生产含有表达CAR的免疫细胞的细胞群体的方法与流程

生产含有表达car的免疫细胞的细胞群体的方法
技术领域
1.本公开内容涉及含有表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的细胞群体及其生产方法。


背景技术：

2.近年来已经将嵌合抗原受体(car)-t细胞治疗开发为癌症患者的免疫疗法之一(非专利文献1)，所述嵌合抗原受体(car)-t细胞为细胞毒性的t细胞(ctl)，其t细胞受体(tcr)经过遗传修饰，使得ctl直接地和选择性地识别肿瘤细胞以发挥抗肿瘤作用，并且作为难治肿瘤的非常有前途的疗法吸引了大量注意。car是这样的蛋白的一般术语，所述蛋白在其n-端侧上具有特异性地识别肿瘤抗原的蛋白，诸如通过将抗体可变区修饰成单链氨基酸序列而制备的单链抗体(scfv)，而在其c-端侧上具有t细胞受体ζ链。表达car的t细胞识别在细胞外结构域处的肿瘤抗原，通过接下来的ζ链将信号传递进t细胞，并变得活化以通过释放细胞杀死因子(诸如穿孔蛋白和粒酶)发挥它们的抗肿瘤作用(非专利文献1)。
3.对于某些肿瘤，使用car-t细胞的癌症治疗在日本、欧洲和美国已经被批准和投入实际应用中。在血液肿瘤领域中，对cd19-阳性的b淋巴细胞性肿瘤进行了iii期临床试验，其中将cd19特异性的car通过基因转移引入从具有复发性急性淋巴细胞白血病的患者预先收集的t细胞中，并将所述细胞培养、扩增和输入患者体内。然后，据报道在所有5位接受施用的患者中得到了在骨髓中的分子生物学减轻(非专利文献2)。基于该报道，两种药物tisagen lecleucel (产品名称: kymriah
®
)和axicabtagene ciloleucel (产品名称: yescarta
®
)在欧洲和美国已经被批准用于cd19-阳性的急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤并投放市场。作为对难治的cd19-阳性的淋巴细胞白血病和淋巴瘤(它们迄今为止难以治愈)的突破性治疗，这两种药物已经吸引了大量注意。
4.大多数临床上应用的car-t细胞制品使用γ-逆转录病毒通过基因修饰来生产。通过非常复杂的过程来制造通过病毒介导的基因修饰生产的细胞制品，所述过程包括gmp级病毒生产、终产物的病毒残余试验和根据某些国家1类应用的cartagena批准(cartagena approval of type 1 use)的生产。
5.为了生产car-t细胞，除了使用病毒载体的常规方法以外，还已经使用了使用非病毒载体的基因修饰技术(专利文献1和2)。例如，聚焦于不使用γ-逆转录病毒而是利用称作piggybac的转座子的基因转移技术(在下文中被称作“piggybac转座子介导的方法”)，非病毒遗传修饰的car-t细胞疗法的研究和开发也正在进行中。对于car-t细胞生产而言，通过非病毒基因修饰技术来生产car-t细胞是一种安全且简单的方法，因为没有病毒被用于基因转移。ace方法是由发明人nakazawa等人之一开发的非病毒遗传修饰的car-t细胞的培养方法(专利文献2)，这是非病毒基因修饰的开创性方法并且已经克服了使用病毒载体的生产方法的问题。
6.现有技术文件专利文献
专利文献1: jp2017-22121a专利文献2: wo2017/061615非专利文献非专利文献1: eshhar z, waks t, gross g, schindler dg.specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and t-cell receptors.proc natl acad sci u s a.1993;90:720-724.非专利文献2: brentjens rj, davila ml, riviere i, park j, wang x, cowell lg, bartido s, stefanski j, taylor c, olszewska m, borquez-ojeda o, qu j, wasielewska t, he q, bernal y, rijo iv, hedvat c, kobos r, curran k, steinherz p, jurcic j, rosenblat t, maslak p, frattini m, sadelain m.cd19-targeted t cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.sci transl med.2013;5:177ra38。


技术实现要素：

7.要解决的问题对于血液肿瘤的靶分子诸如cd19，生产car-t细胞的常规方法可以以临床上可用的质量和数目获得car-t细胞。但是，对于实体瘤的靶分子，难以获得足够数目的细胞用于临床应用。并且，通过长期培养或共刺激性分子的强制激活来确保给予患者所需的细胞数量的尝试可以改变t细胞的特征，使得t细胞具有更少的细胞毒性活性并且容易耗尽。因而，难以稳定地生产对于临床应用而言足够数目和质量的car-t细胞。
8.解决问题的方式本发明的发明人已经进行了勤勉研究以解决以上问题。然后，发明人已经发现，将引入了car的免疫细胞(诸如car-t细胞)与单独制备的表达car的靶抗原的靶抗原表达细胞一起共培养，不仅提高基因转移效率和细胞增殖速率，而且能够稳定培养具有高细胞毒性活性且不容易耗尽的免疫细胞。
9.也就是说，在一个方面，本公开内容提供了一种生产含有表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的细胞群体的方法，其包括共培养表达car的免疫细胞和表达car的靶抗原的细胞，其中所述表达car的免疫细胞是其中已经引入了car基因的细胞且所述靶抗原表达细胞是已经被工程改造成表达靶抗原的正常血细胞。
10.在另一个方面，本公开内容提供了一种细胞群体，其含有通过如上定义的方法生产的表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞。
11.在另一个方面，本公开内容提供了一种用于治疗癌症的组合物，其包含如上定义的细胞群体。
12.发明的效果根据本发明，可以增加表达car的免疫细胞的生产效率，并且可以稳定地生产具有高细胞毒性活性的car-t细胞。特别地，可以显著提高用于实体瘤的表达car的免疫细胞的
生产效率，且因而car-t细胞疗法可以应用于各种癌症类型。
附图说明
13.图1显示了在实施例部分中使用的car基因表达载体和转座酶表达载体。
14.图2显示了在实施例部分中使用的靶抗原表达载体。
15.图3显示了在实施例部分中使用的靶抗原表达载体。
16.图4显示了在表达her2-car的t细胞中的her2-car、cd3、pd-1、ccr7和cd45ra表达的流式细胞计数分析的结果，所述t细胞与表达her2和共刺激性分子(cd80 4-1bbl、cd80或4-1bbl)的靶抗原表达细胞共培养。
17.图5显示了在表达her2-car的t细胞中的her2-car、cd3、pd-1、ccr7和cd45ra表达的流式细胞计数分析的结果，所述t细胞与表达her2和共刺激性分子(cd40 ox40l、cd40或ox40l)的靶抗原表达细胞共培养。
18.图6显示了用表达her2-car的t细胞靶向表达her的u2os细胞的杀伤试验(第一个)的结果。
19.图7显示了用表达her2-car的t细胞靶向表达her的u2os细胞的杀伤试验(第二个)的结果。
20.图8显示了用实施例5的表达her2-car的t细胞、实施例6的表达cd19-car的t细胞和对比实施例8的表达her2-car的t细胞靶向表达her的u2os细胞的杀伤试验的结果。
具体实施方式
21.除非另外指出，否则在本公开内容中使用的术语具有诸如有机化学、医学、药学、分子生物学和微生物学等领域中的本领域技术人员通常理解的含义。下面是在本公开内容中使用的一些术语的定义，且这些定义替代本公开内容中的通常理解。
22.在本公开内容中，当数字伴有术语“约”时，它意图包括该值的
±
10%的范围。例如，“约20”应当包括“18-22”。数字的范围包括在端点之间的所有数字和在端点处的数字。用于范围的术语“约”适用于该范围的两端。因而，例如，“约20-30”应当包括“18-33”。
23.在本公开内容中，序列同一性是指在多肽或多核苷酸之间的序列匹配程度，且它如下确定：在要对比的序列区域上，对比两个最佳比对的序列(对齐，使得氨基酸或核苷酸匹配最大化)。如下计算序列同一性的数值(%)：确定在两个序列中存在的相同氨基酸或核苷酸，确定匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以要对比的序列区域中的氨基酸或核苷酸的总数，且然后将得到的值乘以100。得到最佳比对和序列同一性的算法的实例包括本领域技术人员通常可得到的各种算法(例如，blast算法、fasta算法)。例如，通过使用序列分析软件诸如blast或fasta，可以确定序列同一性。
24.嵌合抗原受体嵌合抗原受体(在本文中也被称作car)是具有含有靶标特异性的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域的结构的蛋白，其从蛋白的n-端侧至c-端侧对于免疫细胞的效应子功能起作用。car基因是编码该受体的基因。将在下文中描述每个结构域。
25.(a)细胞外结构域细胞外结构域含有表现出靶标特异性结合的抗原识别位点。例如，细胞外结构域
可以含有针对靶标的单克隆抗体的scfv片段(例如，由seq id no: 1或2的氨基酸序列组成的片段，或在wo2017/061615、cn107164338a、wo2016/123143、wo2016/023253或jp2018-198601a中描述的片段)，或者，当靶标是受体时，含有结合所述受体的配体(例如，由seq id no: 3的氨基酸序列组成的配体，或在wo2018/110374或wo2018/052142中描述的配体)。本文中使用的单克隆抗体可以是，例如，啮齿动物(诸如小鼠、大鼠或兔)抗体、人抗体或人源化抗体。人源化的单克隆抗体是通过制造类似于人抗体结构的非人动物(例如，小鼠或大鼠)的单克隆抗体的结构而制备的抗体，且包括人源化的嵌合抗体，其中仅抗体的恒定区用人抗体的恒定区替换，和人源化的cdr-移植抗体，其中恒定区和除了可变区中的互补决定区(cdr)以外的部分用人抗体的那些替换(p.t. johons等人, nature 321, 522, 1986)。为了增强人源化的cdr-移植抗体的抗原结合活性，已经开发了改进的技术，并且可以用于制造人源化抗体，且它们包括，例如，选择与小鼠抗体的框架(fr)区域具有高同源性的人抗体的框架(fr)区域，生产与小鼠抗体具有高同源性的人源化抗体，和在将小鼠cdr移植至人抗体以后置换fr区域中的氨基酸(参见，例如，us5585089b、us5693761b、us5693762b、us6180370b、ep451216b、ep682040b、jp2828340b)。
26.scfv片段具有其中免疫球蛋白的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)通过接头连接的结构，且它保留结合抗原的能力。作为接头，例如，可以使用肽接头。肽接头是作为肽的接头，其中氨基酸线性地连接。肽接头的实例包括由甘氨酸和/或丝氨酸组成的接头(例如，ggs或gs接头)。甘氨酸和丝氨酸是小尺寸的，从而防止接头形成更高阶结构。接头的长度没有特别限于任何具体长度。例如，可以使用具有5-25个氨基酸残基的接头。接头的长度优选地是8-25，更优选地是15-20。
27.靶抗原可以是与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞中显著地或明显地表达的抗原。靶抗原的实例包括，例如，肿瘤相关的或肿瘤特异性的抗原，诸如ephb4、her2、epha2、ephb2、egfr、gd2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5t4、8h9、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3、b7-h6、caix、ca9、cd19、cd20、cd22、κ轻链、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd116、cd123、cd138、cd171、cea、cspg4、egfr、egfrviii、egp2、egp40、epcam、erbb3、erbb4、fap、far、fbp、胎儿achr、叶酸受体α、gd3、hla-ai mage a1、hla-a2、il11ra、il13ra2、kdr、lambda、lewis y、mcsp、间皮素、muc1、muc4、muc6、ncam、nkg2d配体、ny-eso-1、prame、psca、psc1、psma、ror1、sp17、存活素、tag72、tem1、tem8、vegf受体2、癌胚抗原、hmw-maa、vegf受体、纤连蛋白、腱糖蛋白或存在于细胞外基质中的抗原诸如在肿瘤的坏死区域中的癌胚抗原(cea)或含有通过肿瘤的基因组分析和/或差异表达研究而鉴定出的突变的蛋白。
28.当靶抗原是受体时，受体的配体可以用作抗原识别位点来替代scfv。例如，可以使用efnb2蛋白(它是ephb4受体的天然配体)和gm-csf(它是gm-csf受体的配体)以及adnectin(它是egfr的配体)、il-11(它是il11ra的配体)、il-13(它是il13ra2的配体)和fsh(它是fshr的配体)、t1e(它是erbb2家族的配体)、cd27(它是cd70的配体)、dnam-1(它是连接素-2的配体)、nkg2d(它是mica和micb的配体)和nkp30(它是gal3的配体)的细胞外结构域。
29.本公开内容的生产方法可以得到表达car的免疫细胞，其数目和质量不仅对于在血细胞中表达的抗原是足够的，而且对于在这样的细胞中不表达的抗原也是足够的，且它特别适合用于实体瘤的靶抗原。这样的靶抗原的实例包括ephb4、her2、epha2、ephb2、egfr、
gd2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5t4、muc1、muc4、muc6、ncam、egfr、egfrviii、erbb3、erbb4、ny-eso-1、psca、psc1、psma、vegfr受体2、癌胚抗原、hmw-maa和vegf受体。
30.细胞外结构域可以含有促进car向细胞表面的易位的前导序列(信号肽)。作为前导序列，例如，可以使用gm-csf受体的前导序列。
31.在一个实施方案中，细胞外结构域包含与seq id no: 1-3中的任一个的氨基酸序列、优选seq id no: 1的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，细胞外结构域包含seq id no: 1-3中的任一个的氨基酸序列、优选seq id no: 1的氨基酸序列，或由其组成。
32.(b)跨膜结构域跨膜结构域位于细胞外结构域和细胞内信号结构域之间。作为跨膜结构域，可以使用cd8、t细胞受体α或β链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、gitr或4-1bb的跨膜结构域。跨膜结构域还可以是人工构建的多肽。优选地，跨膜结构域是cd28的跨膜结构域(例如，由seq id no: 7或8的氨基酸序列组成的结构域)。
33.在一个实施方案中，跨膜结构域包含与seq id no: 7或8的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含seq id no: 7或8的氨基酸序列或由其组成。
34.(c)细胞内信号结构域细胞内信号结构域传递免疫细胞发挥其效应子功能必需的信号。也就是说，当细胞外结构域结合靶抗原时，要使用的细胞内信号结构域能够传递活化免疫细胞所必需的信号。细胞内信号结构域包含用于传递由tcr复合物介导的信号的结构域(为了方便，被称作“第一结构域”)，并且可以进一步包含用于传递共刺激性信号的结构域(为了方便，被称作“第二结构域”)。这些结构域的实例包括cd2、cd4、cd5、cd28、cd134、4-1bb (cd137)、gitr、cd27、ox40、hvem、cd3ζ、fcεriγ、ox-40和icos的结构域。第一结构域优选地是cd3ζ或fcεriγ的结构域，更优选地是cd3ζ的结构域(例如，由seq id no: 9的氨基酸序列组成的结构域)。第二结构域优选地是cd28、4-1bb (cd137)、cd2、cd4、cd5、cd134、ox-40或icos的结构域，且更优选地是cd28或4-1bb的结构域。第一结构域和第二结构域可以各自由多个相同的或不同的串联连接的结构域组成。
35.当细胞内信号结构域包括第一结构域和第二结构域时，第一结构域和第二结构域可以以任何方式连接，但是第二结构域优选地置于跨膜结构域侧上，因为已知当cd3ζ连接在远侧时在某些情况下强烈地传递共刺激。第一结构域和第二结构域可以直接连接，或可以通过接头连接。作为接头，例如，可以使用肽接头。肽接头是作为肽的接头，其中氨基酸线性连接，且它的结构和特征如上所述。连接第一结构域和第二结构域的接头可以是仅由甘氨酸组成的接头。接头的长度没有特别限于任何具体长度。例如，可以使用具有2-15个氨基酸残基的接头。
36.在一个实施方案中，细胞内信号结构域包含与seq id no: 9的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，细胞外结构域包含seq id no: 9的氨基酸序列或由其组成。
37.(d)其它元件
细胞外结构域和跨膜结构域可以通过间隔结构域连接。间隔结构域用于促进car与靶抗原的结合。作为间隔结构域，可以使用抗体或其片段或衍生物的fc片段、抗体或其片段或衍生物的铰链区、抗体的ch2区域、抗体的ch3区域、人工间隔序列或它们的组合(例如，由seq id no: 4-6中的任一个的氨基酸序列组成的结构域)。例如，可以将人igg (例如，人igg1、人igg4)的fc片段用作间隔结构域。另外，cd28的细胞外结构域的一部分和cd8α的细胞外结构域的一部分也可以用作间隔结构域。间隔结构域还可以提供在跨膜结构域和细胞内信号结构域之间。
38.在一个实施方案中，间隔结构域包含与seq id no: 4-6中的任一个的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，间隔结构域包含seq id no: 4-6中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
39.car表达载体在本公开内容中，通过使用car表达载体将car基因引入免疫细胞中来制备表达car的免疫细胞。car表达载体是指能够将编码car基因的核酸分子运输进免疫细胞中的核酸分子。它可以是任何形式和任何起源的dna或rna，且不同类型的载体是可得到的。载体可以是病毒载体或非病毒载体。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体和仙台病毒载体。在这些中，利用逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺伴随病毒载体，掺入载体中的目标基因整合进宿主染色体中并预见到稳定的且长期的表达。根据常规方法或通过使用用于此目的的商购可得的试剂盒，可以制备每种病毒载体。非病毒载体的实例包括质粒载体、脂质体载体和带正电荷的脂质体载体(felgner, p.l., gadek, t.r., holm, m. 等人, proc. natl. acad. sci., 84: 7413-7417, 1987)、yac载体和bac载体。
40.car表达载体包含用于表达car基因的表达单元，其经常包含启动子、car基因和多腺苷酸添加信号。可以用在car表达盒中的启动子的实例包括cmv-ie(巨细胞病毒早期基因衍生的启动子)、sv40ori、逆转录病毒ltrsrα、ef1α和β-肌动蛋白启动子。多腺苷酸添加信号序列的实例包括sv40的多腺苷酸添加序列、牛生长激素基因的多腺苷酸添加序列和球蛋白的多腺苷酸添加序列。car基因通常直接地或经由另一个序列连接至启动子的3'末端，使得启动子调节car基因的表达，且多腺苷酸添加信号序列置于car基因的下游。car基因从这样的表达单元转录成信使rna (mrna)，且car从mrna翻译并呈递到细胞表面上。
41.表达单元可以包含例如用于检测基因表达的基因(例如，报道基因、细胞或组织特异性的基因、或可选择的标记基因)、用于提高表达效率的增强子序列、wrpe序列。
42.检测的基因用于确定car表达载体的引入的成功或失败和效率，检测car基因的表达或确定car基因的表达效率，或选择或分选表达car基因的细胞。检测的基因的实例包括赋予对新霉素的抗性的neo基因、赋予对卡那霉素或其它抗生素的抗性的npt基因(herrera estrella, embo j. 2 (1983), 987-995)和赋予对卡那霉素或其他抗生素的抗性的nptii基因(messing和vierra, gene 1 9:259-268 (1982))、赋予对潮霉素的抗性的hph基因(blochinger和diggl mann, mol cell bio 4: 2929-2931)、和赋予对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(bourouis等人, embo j.2 (7)) (标记基因的实例)；萤光素酶基因(giacomin, p1. sci. 116(1996), 59-72; scikantha, j. bact. 178 (1996), 121)，β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因，荧光蛋白诸如gfp (gerdes, febs lett. 389 (1996), 44-47)或其变体
(例如，egfp、d2egfp)的基因(报道基因的实例)；和缺乏细胞内结构域的表皮生长因子受体(egfr)基因。检测的基因可以经由例如双顺反子控制序列(例如，核糖体内部识别序列(ires))或编码自切割肽的序列连接至car基因。自切割肽的实例包括从thosea asigna病毒衍生出的2a肽(t2a)。自切割肽的不同实例包括小rna病毒衍生的2a肽(f2a)、口蹄疫病毒(fmdv)衍生的2a肽(f2a)、马鼻炎a病毒(erav)衍生的2a肽(e2a)和猪捷申病毒(ptv-1)衍生的2a肽(p2a)和轮状病毒、昆虫病毒、aft病毒或tripanosoma病毒衍生的2a肽，但不限于此。
43.免疫细胞在本公开内容中，将car基因引入免疫细胞中。在本公开内容中的免疫细胞可以是t细胞(包括cd4-阳性的cd8-阴性的t细胞、cd4-阴性的cd8-阳性的t细胞、αβ-t细胞、γδ-t细胞和nkt细胞)、b细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或它们的组合。免疫细胞可以是从人类分离的细胞，或可以是从诸如ips细胞、es细胞或造血干细胞等细胞分化出的细胞。并且，免疫细胞可以是自体细胞或同种异体细胞。在本公开内容中，术语“自体细胞”是指从要给其施用通过本公开内容的方法生产的细胞群体的受试者得到的细胞，或从这样得到的细胞衍生出的细胞。术语“同种异体细胞”是指，所述细胞不是“自体细胞”。优选地，免疫细胞是自体细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞(即，t细胞、b细胞、nk细胞或它们的组合)。在另一个实施方案中，免疫细胞是t细胞。通过向含有免疫细胞或其祖细胞(诸如造血干细胞)的细胞群体中的基因转移，可以得到表达car的免疫细胞。例如，表达car的免疫细胞可以通过其中已经引入了car基因的细胞(诸如ips细胞、es细胞或造血干细胞)的分化得到，或可以通过在已经引入car基因以后已经转化成ips细胞的细胞的分化而得到。在一个实施方案中，通过将car基因引入血细胞中，制备表达car的免疫细胞。在本公开内容中，术语“血细胞”是指一个或多个构成血液的细胞，并且用于指单个细胞或含有多个细胞的细胞群体，和由一类细胞组成的细胞群体的含义，以及含有多类细胞的细胞群体的含义。血细胞优选地是红细胞和血小板以外的血细胞，且这样的血细胞包括免疫细胞诸如淋巴细胞和单核细胞。血细胞可以是从人类分离的细胞或从诸如ips细胞、es细胞或造血干细胞等细胞分化出的细胞，且可以是自体细胞或同种异体细胞，但是优选自体细胞。在另一个实施方案中，通过将car基因引入pbmc中来制备表达car的免疫细胞。pbmc优选地是自体pbmc(即，从要给其施用通过本公开内容的方法生产的细胞群体的受试者收集的pbmc)。可以通过常规方法，例如，通过参考saha s, nakazawa y, huye le, doherty je, galvan dl, rooney cm, wilson mh. j vis exp. 2012 nov 5;(69): e4235，制备pbmc。除非另外指出，否则本文描述的任何细胞(例如，t细胞)是人细胞。
44.表达car的免疫细胞的制备通过常规方法将为基因转移制备的car基因表达载体引入免疫细胞中。在病毒载体的情况下，通过病毒感染将它引入细胞中。在非病毒载体诸如质粒的情况下，常规方法诸如通过电穿孔、脂质体或磷酸钙介导的方法可以用于引入细胞中，且所述引入优选地通过电穿孔进行。
45.为了提高向宿主染色体中的整合的效率，优选的是，通过由转座子介导的方法进行基因转移。转座子介导的方法是非病毒基因转移方法之一，且它可以通过利用这样的机制将目标基因整合进宿主染色体中，通过该机制，作用于基因组的酶(转座酶)和它的特定识别序列共同造成基因易位。转座子介导的方法可以是，例如，piggybac转座子介导的方
法。piggybac转座子介导的方法利用从昆虫分离出的转座子(fraser mj等人, insect mol biol. 1996年5月;5(2):141-51. ; wilson mh等人, mol ther2007年1月;15(1):139-45)，且它能够非常高效地整合进哺乳动物染色体中。piggybac转座子介导的方法已经实际用于基因转移(参见，例如，nakazawa y等人, j immunother 32:826-836, 2009；nakazawa y等人, j immunother 6:3-10, 2013)。
46.转座子介导的方法不限于使用piggybac的方法，且可以使用转座子诸如sleeping beauty (ivics z, hackett pb, plasterk rh, izsvak z (1997) cell 91: 501-510.), frog prince (miskey c, izsvak z, plasterk rh, ivics z (2003) nucleic acids res 31: 6873-6881.), tol1(koga a, inagaki h, bessho y, hori h. mol gen genet. 1995年12月10日; 249(4):400-5.；koga a, shimada a, kuroki t, hori h, kusumi j, kyono-hamaguchi y, hamaguchi s. j hum genet. 2007;52(7):628-35. 2007年6月7日电子公开), tol2 (koga a, hori h, sakaizumi m (2002) mar biotechnol 4: 6-11. ; johnson hamlet mr, yergeau da, kuliyev e, takeda m, taira m, kawakami k, mead pe (2006) genesis 44: 438-445.；choo bg, kondrichin i, parinov s, emelyanov a, go w, toh wc, korzh v (2006) bmc dev biol 6: 5.)。
47.通过转座子介导的方法进行的基因转移过程可以是常规过程。例如，piggybac转座子介导的方法可以如下进行：制备携带编码piggybac转座酶的基因的载体(转座酶质粒)和具有结构的载体(转座子质粒)，在所述结构中，car基因表达单元被夹在piggybac反向重复序列之间，并通过多种方法诸如电穿孔、核转染、脂转染和磷酸钙介导的方法中的任一种将这些载体引入靶细胞中。
48.靶抗原表达细胞的制备在本公开内容中，除了表达car的免疫细胞以外，被工程改造成表达靶抗原的正常血细胞用作靶抗原表达细胞。靶抗原表达细胞是这样的细胞：其已经被工程改造成在细胞表面上表达靶抗原的一部分或全部，使得引入表达car的免疫细胞中的car可以结合靶抗原。本公开内容中的靶抗原是指被car识别的靶抗原，且可以是在细胞表面上表达的蛋白、糖链或糖脂，使得引入免疫细胞中的car可以结合它。靶抗原的实例包括，例如，被前述car靶向的肿瘤相关的或肿瘤特异性的抗原，诸如epha2、her2、ephb2、ephb4、egfr、gd2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、her2、5t4、8h9、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3、b7-h6、caix、ca9、cd19、cd20、cd22、κ轻链、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd116、cd123、cd138、cd171、cea、cspg4、egfr、egfrviii、egp2、egp40、epcam、erbb3、erbb4、erbb3/4、fap、far、fbp、胎儿achr、叶酸受体α、gd2、gd3、hla-ai mage a1、hla-a2、il11ra、il13ra2、kdr、lambda、lewis y、mcsp、间皮素、muc1、muc4、muc6、ncam、nkg2d配体、ny-eso-1、prame、psca、psc1、psma、ror1、sp17、存活素、tag72、tem1、tem8、vegf受体2、癌胚抗原、hmw-maa、vegf受体、纤连蛋白、腱糖蛋白或存在于细胞外基质中的抗原诸如在肿瘤的坏死区域中的癌胚抗原(cea)或含有通过肿瘤的基因组分析和/或差异表达研究而鉴定出的突变的蛋白。
49.在一个实施方案中，靶抗原包含与seq id no: 10、11或16的氨基酸序列、优选seq id no: 10的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，靶抗原包含seq id no: 10、11或16的氨基酸序列、优选seq id no: 10的氨基酸
序列或由其组成。
50.如关于表达car的免疫细胞的所述，可以通过使用具有用于表达靶抗原基因的表达单元的载体将编码靶抗原的基因引入细胞中，制备靶抗原表达细胞以表达靶抗原。可替换地，也可以通过制备靶抗原基因的mrna和将所述mrna直接引入细胞中，制备靶抗原表达细胞。另外，可以如下制备靶抗原表达细胞以表达靶抗原：将诱导靶抗原表达的另一个基因引入细胞中以替代编码靶抗原的基因，或用诱导靶抗原表达的试剂(诸如低分子量化合物、生长因子、激素或细胞因子)处理细胞。例如，用唾液酸或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理可以制备表达gd2的靶抗原表达细胞。在一个实施方案中，通过将靶抗原基因引入细胞中来制备靶抗原表达细胞，且因而，靶抗原表达细胞包含外源靶抗原基因。
51.可以通过将共刺激性分子基因与靶抗原基因一起引入细胞中以在细胞表面上表达靶抗原和共刺激性分子，制备靶抗原表达细胞。也就是说，在一个实施方案中，靶抗原表达细胞包含一种或多种外源共刺激性分子的一个或多个基因。共刺激性分子的实例包括cd40、cd80、4-1bb配体(4-1bbl)、ox40、ox40l、cd52、cd54、cd70、cd58、cd86、cd95、cd252、cd275和整联蛋白家族的配体(例如，cd49a至cd49h、cd51、cd103、cd41、cd11a至11c、itga9-11、cd18、cd19、cd61、itgb4-8)。在一个实施方案中，共刺激性分子是至少一种选自cd40、cd80、4-1bbl、ox40l的共刺激性分子，优选cd80和/或4-1bbl，更优选cd80和4-1bbl。
52.在一个实施方案中，共刺激性分子包含与seq id no: 12-15中的任一个的氨基酸序列具有90%或更多序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，所述靶抗原包含seq id no: 12-15中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
53.可以如下引入共刺激性分子基因：通过基因转移，使用包含共刺激性分子基因和靶抗原基因的表达载体；或通过基因转移，同时地或分开地引入共刺激性分子的表达载体或mrna以及靶抗原的表达载体或mrna，其中共刺激性分子的表达载体或mrna与靶抗原的表达载体或mrna分开。
54.要被加工成表达靶抗原基因以制备靶抗原表达细胞的细胞是正常血细胞(也就是说，不包括癌细胞或从其衍生出的细胞系的血细胞)，且没有特别限于，但是可以是，从人类分离出的细胞，从诸如ips细胞、es细胞或造血干细胞等细胞分化出的细胞，且可以是自体细胞或同种异体细胞，但是优选地是自体细胞。血细胞优选地是红细胞和血小板以外的血细胞，且这样的血细胞包括免疫细胞诸如淋巴细胞和单核细胞。靶抗原表达细胞可以是已经向其引入靶抗原基因的免疫细胞诸如淋巴细胞，或通过引入另一个基因或通过用试剂处理已经在其中诱导靶抗原表达的细胞。靶抗原表达细胞也可以是如下得到的细胞：将靶抗原基因或诱导靶抗原表达的另一个基因引入祖细胞诸如ips细胞、es细胞或造血干细胞，然后使所述细胞分化。在一个优选的实施方案中，从pbmc制备靶抗原表达细胞，优选地通过向pbmc中的基因转移。在一个实施方案中，通过将靶抗原基因引入pbmc中来制备靶抗原表达细胞。当使用pbmc时，可以得到具有高增殖效率和高质量的表达car的免疫细胞。另外，当使用pbmc时，可能在不引入共刺激性分子基因的情况下高效地生产表达car的免疫细胞。pbmc优选地是自体pbmc(即，从要给其施用通过本公开内容的方法生产的细胞群体的受试者取出的pbmc)。当使用自体pbmc时，不必要取出靶抗原表达细胞来制备要施用给患者的细胞。进一步，靶抗原表达细胞和表达car的免疫细胞都优选地从相同受试者的pbmc制备，且更优选地从自体pbmc制备。
institute, inc.)。其它培养条件没有限制，只要它们适合于细胞存活和增殖，并且可以采用常规条件。例如，可以在设定于37℃的co2培养箱(co2浓度: 5%)中培养细胞。
63.可以将t细胞生长因子或活化剂加入培养基中以辅助细胞存活和增殖。t细胞生长因子的实例包括il-1、il-2、il-7、il-15和il-21，且活化剂的实例包括抗-cd3抗体和抗-cd28抗体。例如，il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体可以在共培养过程中加入培养基中。这些因子不是必要的，且特别当使用从pbmc制备的靶抗原表达细胞时，可以在不加入抗-cd3抗体和/或抗-cd28抗体的情况下在短时间段内高效地得到临床上可应用的表达car的免疫细胞。当制备表达car的免疫细胞时，也可以将il-7和/或il-15加入培养基中。例如，可以将il-7和il-15分别以5 ng/ml至10 ng/ml加入培养基中。可以根据常规方法制备t细胞生长因子或活化剂，且还可以使用商购可得的产品。t细胞生长因子或活化剂可以属于非人动物物种，但是优选地属于人起源(且可以是重组的)。
64.通过共培养表达car的免疫细胞和靶抗原表达细胞，可能得到含有对于临床应用而言足够数目和质量的表达car的免疫细胞的细胞群体。特别地，即使当在血细胞中没有表达靶抗原时(例如，在实体瘤的肿瘤相关抗原诸如her2和ephb4的情况下)，共培养表达car的免疫细胞和靶抗原表达细胞会提供从靶抗原表达细胞至表达car的免疫细胞的适当刺激，并产生含有足够数目的表达car的免疫细胞的细胞群体，所述表达car的免疫细胞具有高细胞毒性活性且不容易耗尽。本公开内容的方法可以高效地产生预期与常规方法相比非常有效的细胞群体。例如，通过本公开内容的生产方法得到的细胞群体可以具有20%、30%或40%或更多的表达car的免疫细胞的比例，优选地40%或更多。另外，通过本公开内容的生产方法得到的细胞群体具有低表达的pd-1，所述pd-1为耗尽标志物，且例如，表达car的免疫细胞中的pd-1表达细胞的比例可以小于10%，优选地小于5%，更优选地小于1%。并且，在通过本公开内容的生产方法得到的细胞群体中，表达car的免疫细胞中原初细胞的比例可以是45%、50%、55%或60%或更多，优选60%或更多。
65.细胞群体的应用通过本公开内容的方法生产的含有表达car的免疫细胞的细胞群体可以用于治疗癌症，特别是用于治疗表达表达car的免疫细胞的靶抗原的癌症。所述癌症可以是实体瘤或血液肿瘤。癌症的具体实例包括各种b-细胞淋巴瘤(例如，滤泡恶性淋巴瘤、弥散性大b-细胞恶性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、血管内b-细胞淋巴瘤、cd20-阳性的霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生性赘生物、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物(cmml、jmml、cml、mds/mpn-uc)、骨髓增生异常综合征、急性髓样白血病、神经母细胞瘤、脑肿瘤、尤因肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、骨和软组织肉瘤、肾癌、胰腺癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌和结肠癌，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述癌症是实体瘤。实体瘤的实例包括，例如，神经母细胞瘤、脑肿瘤、尤因肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、骨和软组织肉瘤、肾癌、胰腺癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌和结肠癌。
66.以治疗有效量施用本公开内容的细胞群体，所述治疗有效量适当地根据因素诸如受试者的年龄、体重和症状确定。本公开内容的受试者通常是人，优选癌症患者。例如，可以以每次1
×
104个细胞至1
×
10
10
个细胞施用本公开内容的细胞群体。施用途径没有特别限
于，但可以是，例如，静脉内注射、动脉内注射、门静脉注射、真皮内注射、皮下注射、肌肉内注射或腹膜内注射。可以全身性地或局部地施用本公开内容的细胞群体，且局部施用包括直接注射进靶组织、器官或部分。施用计划适当地根据因素诸如受试者的年龄、体重和症状来确定，且可以是单次施用或连续或定期多次施用。
67.除了要施用给受试者的细胞群体以外，包含本公开内容的细胞群体的组合物可以包含组分诸如用于保护细胞的目的的二甲基亚砜(dmso)或血清白蛋白，用于防止细菌污染的目的的抗生素，或用于活化、增殖或诱导细胞分化的目的的多种组分(诸如维生素、细胞因子、生长因子、类固醇)中的任一种。可以通过常规方法制备组合物。
68.下面描述了本发明的示例性实施方案。
69.[1] 一种生产含有表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的细胞群体的方法，其包括共培养表达car的免疫细胞和表达car的靶抗原的细胞，其中所述表达car的免疫细胞是其中已经引入了car基因的细胞且所述靶抗原表达细胞是已经被工程改造成表达靶抗原的正常血细胞。
[0070]
[2] 根据项目1的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
[0071]
[3] 根据项目1或2的方法，其中所述免疫细胞是t细胞。
[0072]
[4] 根据项目1-3中的任一项的方法，其中所述靶抗原是her2或ephb4。
[0073]
[5] 根据项目1-4中的任一项的方法，其中所述表达car的免疫细胞是通过向外周血单核细胞(pbmc)中的基因转移而制备的细胞。
[0074]
[6] 根据项目1-5中的任一项的方法，所述方法进一步包括制备表达car的免疫细胞。
[0075]
[7] 根据项目6的方法，其中通过向pbmc中的基因转移来制备表达car的免疫细胞。
[0076]
[8] 根据项目6或7的方法，其中通过piggybac转座子介导的方法来制备表达car的免疫细胞。
[0077]
[9] 根据项目1-8中的任一项的方法，其中所述靶抗原表达细胞是其中已经引入靶抗原基因的细胞。
[0078]
[10] 根据项目1-9中的任一项的方法，其中所述靶抗原表达细胞是其中已经引入一种或多种共刺激性分子的一个或多个基因的细胞。
[0079]
[11] 根据项目1-10中的任一项的方法，其中所述靶抗原表达细胞是从pbmc制备的细胞。
[0080]
[12] 根据项目11的方法，其中所述靶抗原表达细胞是通过向pbmc中的基因转移制备的细胞。
[0081]
[13] 根据项目12的方法，其中所述基因转移包括靶抗原基因的转移。
[0082]
[14] 根据项目1-13中的任一项的方法，所述方法进一步包括制备靶抗原表达细胞。
[0083]
[15] 根据项目14的方法，其中从pbmc制备所述靶抗原表达细胞。
[0084]
[16] 根据项目15的方法，其中通过向pbmc中的基因转移来制备所述靶抗原表达细胞。
[0085]
[17] 根据项目16的方法，其中所述基因转移包括靶抗原基因的转移。
[0086]
[18] 根据项目10-17中的任一项的方法，其中所述一种或多种共刺激性分子选自cd40、cd80、4-1bbl和ox40l。
[0087]
[19] 通过根据项目1-18中的任一项的方法生产的含有表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的细胞群体。
[0088]
[20] 一种用于治疗癌症的组合物，其包含根据项目19的细胞群体。
[0089]
[21] 根据项目20的组合物，其中所述癌症是实体瘤。
[0090]
[22] 一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括给受试者施用根据项目19的细胞群体。
[0091]
[23] 一种用于治疗癌症的方法，其包括通过根据项目1-18中的任一项的方法生产细胞群体，和将如此得到的细胞群体施用给受试者。
[0092]
[24] 用于治疗癌症的根据项目19的细胞群体。
[0093]
[25] 根据项目19的细胞群体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症。
[0094]
在下文中，将参考实施例进一步描述本发明。但是，本发明在任何意义上不限于这些实施例。
实施例
[0095]
(实施例1)通过比重分离离心从外周血分离和收集外周血单核细胞(pbmc)。然后，通过电穿孔实现的基因转移，向15
×
106个收集的pbmc细胞引入表达ephb4-car的载体(图1, (a))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达ephb4-car的t细胞，所述ephb4-car具有作为细胞外结构域的ephb4配体(seq id no: 3)和间隔结构域(seq id no: 6)、跨膜结构域(seq id no: 8)和细胞内信号结构域(seq id no: 9)。并且，向5
×
106个pbmc，通过电穿孔引入表达ephb4 (seq id no: 11)(其为ephb4-car的靶分子)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13)的载体(图2, (a))以制备瞬时表达ephb4的ephb4表达细胞。将如此制备的表达ephb4-car的t细胞和ephb4表达细胞在基因转移后分别培养1天，且然后在培养的第一天和第三天将ephb4表达细胞用紫外线照射并将5
×
106个紫外线照射的ephb4表达细胞分开并与表达ephb4-car的t细胞混合。在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下将细胞与含有il-7 (10 ng/ml)和il-15 (5 ng/ml)的alys培养溶液共培养，并在培养开始后12天收集。
[0096]
(对比实施例1)以与在实施例1中相同的方式，收集pbmc并制备表达ephb4-car的t细胞。并且，在对收集的pbmc的一部分进行紫外线照射以后，将病毒肽(peptivator cmv pp65、peptivator adv5 hexon、peptivator ebv ebna-1和peptivator ebv bzlf1，miltenyi biotec)添加到照射过的细胞以制备饲养细胞。另外，制备紫外线照射的rh30细胞，其为表达ephb4的癌细胞系的细胞。然后，将10
×
106个表达ephb4-car的t细胞与2
×
106个饲养细胞和1
×
106个rh30细胞混合，并在抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下将这些细胞与含有il-7 (10 ng/ml)和il-15 (5 ng/ml)的alys培养溶液共培养，并在培养开始后9天收集。
[0097]
(对比实施例2)
(10 ng/ml)和il-15 (5 ng/ml)以及2%人工血清的alys培养基在平板上培养7天，在所述平板上以100 μg/ml固定化了her2-car的靶分子her2蛋白，然后与饲养细胞混合。将细胞共培养另外7天，并在培养开始后14天收集。
[0103]
(试验实施例2)对于在实施例2和对比实施例4中得到的细胞，通过流式细胞计量术计数细胞的总数并分析表达her2-car的t细胞的比例。结果显示在表2中。
[0104]
[表2] 实施例2对比实施例4培养以前的细胞数目(x106)1015培养以后的细胞数目(x106)14611表达her2-car的t细胞(%)34.133.7表达her2-car的t细胞数目(x106)49.83.7如在表2中所示，在实施例2中可能得到足够数目的表达her2-car的t细胞用于临床应用，尽管在培养开始之前制备的表达her2-car的t细胞的数目小于在对比实施例4中的数目。这些结果证实，包括共培养her2表达细胞(其通过her2基因的引入被工程改造成表达靶抗原her2)和表达her2-car的t细胞的生产方法是非常有用的。
[0105]
(实施例3)以与在实施例1中相同的方式分离和收集pbmc。然后，向20
×
106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例2中所用的her2-car表达载体(图1, (b))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达her2-car的t细胞。并且，向20
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达her2 (seq id no: 10)(其为her2-car的靶分子)的表达载体(图2, (c))以制备瞬时表达her2 (seq id no: 10)的her2表达细胞。将如此制备的表达her2-car的t细胞和her2表达细胞在基因转移以后分别培养1天，且然后将her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细胞在il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0106]
(对比实施例5)以与在实施例3中相同的方式制备表达her2-car的t细胞。并且，替代her2表达载体，向20
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达ephb4 (seq id no: 11)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13)的载体(图2, (a))以制备要用作抗原呈递细胞的ephb4表达细胞。以与在实施例3中相同的方式将如此制备的表达her2-car的t细胞和ephb4表达细胞共培养，并在培养开始后14天收集细胞。
[0107]
(对比实施例6)以与在实施例3中相同的方式制备表达her2-car的t细胞。以与在实施例3中相同的方式将如此制备的表达her2-car的t细胞与1
×
106个u2os细胞共培养，所述u2os细胞为表达her2的癌细胞系的细胞并用作抗原呈递细胞来替代her2表达细胞。在培养开始后14天收集细胞。
[0108]
(实施例4)以与在实施例1中相同的方式分离和收集pbmc。然后，向20
×
106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例1中使用的ephb4-car表达载体(图1, (a))和转座酶表达载
体(图1, (c))以制备表达ephb4-car的t细胞。并且，向20
×
106个pbmc，通过电穿孔引入表达ephb4 (seq id no: 11)(其为ephb4-car的靶分子)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13)的表达载体以制备瞬时表达ephb4的ephb4表达细胞。将如此制备的表达ephb4-car的t细胞和ephb4表达细胞在基因转移以后分别培养1天，然后将ephb4表达细胞用紫外线照射并与表达ephb4-car的t细胞混合。将细胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0109]
(对比实施例7)以与在实施例4中相同的方式制备表达ephb4-car的t细胞。向20
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达cd19 (seq id no: 16)(而不是ephb4)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13)的载体(图2, (d))以制备要用作抗原呈递细胞的cd19表达细胞。以与在实施例4中相同的方式将如此制备的表达ephb4-car的t细胞和cd19表达细胞共培养，并在培养开始后14天收集细胞。
[0110]
(试验实施例3)对于分别在实施例3和4和对比实施例5-7中得到的细胞，通过流式细胞计量术计数细胞的总数并分析表达car的t细胞的比例。结果显示在表3中。
[0111]
[表3]如在表3中所示，当表达her2的靶分子的癌细胞用作抗原呈递细胞时(对比实施例6)，和当抗原呈递细胞表达的靶抗原不匹配car-t细胞的car时(对比实施例5和7)，通过培养不可能生产足够数目的car-t细胞。相反，当被工程改造成表达与car-t细胞的car匹配的靶抗原的细胞用作抗原呈递细胞时(实施例3和4)，可能生产足够数目的car-t细胞用于临床应用。
[0112]
(试验实施例4)为了证实通过本公开内容的生产方法生产的表达car的免疫细胞的特征，如下生产表达car的免疫细胞。首先，通过比重分离离心从外周血分离和收集外周血单核细胞(pbmc)。向20
×
106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例2中使用的her2-car表达载体(图1, (b))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达her2-car的t细胞。并且，为了制备靶抗原表达细胞，向10
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达her2 (seq id no: 10)(其为her2-car的靶分子)以及cd80 (seq id no: 12)、4-1bbl (seq id no: 13)、cd40 (seq id no: 14)和ox40配体(seq id no: 15)中的任意一个(图3, (a))或两个(图2, (b)；图3, (b))的表达载体以制备瞬时表达her2的her2表达细胞。将如此制备的表达her2-car的t细胞和her2表达细胞在基因转移以后培养1天。然后，将her2表达细胞用紫外线照射，并将10
×
106个her2表达细胞与20
×
106个表达her2-car的t细胞混合。将细胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。得到的细胞的数目显示在表4中。
[0113]
[表4]关于如此得到的表达her2-car的t细胞，通过流式细胞计量术分析表达以下任一种的细胞的比例：t细胞标志物，cd3；引入的her2-car；耗尽标志物，pd-1；和用于分析原初t细胞或中央记忆t细胞的标志物ccr7和cd45ra。结果显示在图4和5中。
[0114]
并且，使用得到的表达her2-car的t细胞进行杀伤试验。首先，将u2os细胞(其为表达her2的癌细胞系的细胞)以1
×
104个细胞/孔接种在用于实时细胞分析仪(xcelligence, acea bioscience, inc.)的平板上，并允许附着平板。接着，将各个表达her2-car的t细胞接种在平板上，使得表达her2-car的t细胞与u2os细胞之比为1: 2，并将细胞共培养72小时以用实时细胞分析仪确定受损伤的u2os细胞的比例。此后，将与u2os细胞共培养的表达her2-car的t细胞加给在另一个孔中制备的u2os细胞，并将细胞共培养另外72小时。然后，进行测量细胞毒性活性的步骤共3次。结果显示在图6和7中。
[0115]
如在图4和5中的结果所示，通过本公开内容的生产方法得到的表达her2-car的t细胞占细胞总数的20%或更多，表明以高比例得到表达her2-car的t细胞。表达pd-1(其为这些t细胞的耗尽标志物)的细胞的比例非常小。并且，在表达her2-car的t细胞中的原初t细胞(cd45ra阳性的和ccr7阳性的)和中央记忆t细胞(cd45ra阴性的和ccr7阳性的)的比例是高的，且共为至少45%或更多。
[0116]
进一步，从图6和7的结果发现，本公开内容的表达her2-car的t细胞对表达her2的癌细胞系显示出优秀的细胞毒性活性，并且所述细胞在杀伤活性的两次连续测量中没有变得耗尽，并且甚至在第二次杀伤活性测量中具有足够的细胞毒性活性。
[0117]
从这些结果发现，本公开内容的生产方法可以高效地生产高质量细胞群体，其含有大量具有低表达的耗尽标志物以及原初t细胞或中央记忆t细胞的表型的细胞，并且它在用于实体瘤的引入了car的免疫细胞的生产中是特别有效的。
[0118]
(实施例5)通过比重分离离心从外周血分离和收集pbmc。然后，向20
×
106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例2中使用的her2-car表达载体(图1, (b))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达her2-car的t细胞。并且，向10
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达her2 (seq id no: 10)(其为her2-car的靶分子)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13) (图2, (d))的表达载体以制备瞬时表达her2的her2表达细胞。将如此制备的表达her2-car的t细胞和her2表达细胞在基因转移以后分别培养1天，且然后将her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0119]
(实施例6)通过比重分离离心从外周血分离和收集pbmc。然后，向40
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106个pbmc通过电穿孔引入表达cd19-car的表达载体(图1, (d))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达cd19-car的t细胞，所述cd19-car具有作为细胞外结构域的抗-cd19scfv (seq id no: 2)和间隔结构域(seq id no: 5)、跨膜结构域(seq id no: 7)和细胞内信号结构域(seq id no: 9)。并且，向10
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106个pbmc通过电穿孔引入表达cd19 (seq id no: 16)(其为cd19-car的靶分子)和cd80 (seq id no: 12)和4-1bbl (seq id no: 13)的表达载体(图2, (d))以制备瞬时表达cd19的cd19表达细胞。将如此制备的表达cd19-car的t细胞和cd19表达细胞在基因转移以后分别培养1天，且然后将cd19表达细胞用紫外线照射并与表达cd19-car的t细胞混合。将细胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0120]
(对比实施例8)通过比重分离离心从外周血分离和收集pbmc。然后，将0.125
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106个pbmc用抗-cd3抗体和抗-cd28抗体刺激，并使用具有与在实施例2中相同的her2-car表达单元的逆转录病毒载体(图3 (c))进行基因转移。在没有il-2存在下培养细胞，并在培养开始后14天收集。
[0121]
(试验实施例5)使用在实施例5、实施例6和对比实施例8中得到的表达car的t细胞进行杀伤试验。首先，将u2os细胞(其为表达her2的癌细胞系的细胞)以5000个细胞/孔接种在用于实时细胞分析仪(xcelligence, acea bioscience, inc.)的平板上，并允许附着平板。然后，将在实施例5、实施例6和对比实施例8中得到的各个表达car的t细胞接种在平板上，使得表达car的t细胞与u2os细胞数目之比为4: 1。将细胞共培养100小时，并用实时细胞分析仪测量受损伤的u2os细胞的比例。结果显示在图8中。
[0122]
如在图8中的结果所示，在共培养开始后72小时，实施例5的表达her2-car的t细胞损伤了95%或更多的表达her2的u2os细胞，而对比实施例8的表达her2-car的t细胞的细胞毒性为约65%。并且，在实施例6的表达cd19-car的t细胞中，观察到对表达her的u2os细胞的约30%的非特异性细胞毒性反应。因此，认为car依赖性的特异性细胞毒性活性在对比实施
例8所制备的car-t细胞中是弱的。从这些结果，认为通过本公开内容的生产方法得到的表达her2-car的t细胞具有强烈的car特异性的细胞毒性活性。
[0123]
(实施例7)从健康受试者分离和收集pbmc。然后，向20
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106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例2中使用的her2-car表达载体(图1, (b))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达her2-car的t细胞。并且，向20
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106个pbmc通过电穿孔引入表达her2 (seq id no: 10)(其为her2-car的靶分子)的表达载体(图2, (c))以制备瞬时表达her2 (seq id no: 10)的her2表达细胞。将如此制备的表达her2-car的t细胞和her2表达细胞在基因转移以后分别培养1天，且然后将her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0124]
(对比实施例9)以与在实施例7中相同的方式，向10
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106个pbmc通过电穿孔引入her2-car表达载体和转座酶表达载体以制备表达her2-car的t细胞。然后，将从相同健康受试者收集的3
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106个pbmc用紫外线照射并与如此制备的表达her2-car的t细胞混合。将细胞以与在实施例7中相同的方式共培养，并在培养开始后14天收集。
[0125]
(试验实施例6)对于分别在实施例7和对比实施例9中得到的细胞，通过流式细胞计量术计数细胞的总数并分析表达car的t细胞的比例。结果显示在表5中。
[0126]
[表5]如表5中的结果所示，当将细胞与pbmc简单地共培养时(对比实施例9)，不可能通过培养来生产足够数目的car-t细胞。相反，本发明的生产方法能够生产足够数目的car-t细胞用于临床应用(实施例7)。
[0127]
(实施例8)从健康受试者分离和收集pbmc。然后，向17
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106个收集的pbmc细胞通过电穿孔引入如在实施例2中使用的her2-car表达载体(图1, (b))和转座酶表达载体(图1, (c))以制备表达her2-car的t细胞。并且，向17
×
106个pbmc通过电穿孔引入表达her2 (seq id no: 10)(其为her2-car的靶分子)的表达载体(图2, (c))以制备瞬时表达her2 (seq id no: 10)的her2表达细胞。将如此制备的表达her2-car的t细胞和her2表达细胞在基因转移以后分别培养1天，且然后将her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细
胞在没有il-2、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体存在下共培养，并在培养开始后14天收集。
[0128]
(对比实施例10)以与在实施例8中相同的方式，向17
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106个pbmc通过电穿孔引入her2-car表达载体和转座酶表达载体以制备表达her2-car的t细胞。并且，除了使用17
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106个k562细胞(不表达her2)替代pbmc以外，以相同方式将her2表达载体引入细胞以制备her2表达细胞。将如此制备的her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细胞以与在实施例8中相同的方式共培养，并在培养开始后14天收集。
[0129]
(对比实施例11)以与在实施例8中相同的方式，向17
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106个pbmc通过电穿孔引入her2-car表达载体和转座酶表达载体以制备表达her2-car的t细胞。并且，除了使用10
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106个rh30细胞(表达her2)替代pbmc以外，以相同的方式将her2表达载体引入细胞中以制备her2表达细胞。将如此制备的her2表达细胞用紫外线照射并与表达her2-car的t细胞混合。将细胞以与在实施例8中相同的方式共培养，并在培养开始后14天收集。
[0130]
(试验实施例6)对于分别在实施例8和对比实施例10和11中得到的细胞，通过流式细胞计量术计数细胞的总数并分析表达car的t细胞的比例。结果显示在表6中。
[0131]
如在表6中所示，与使用k562和rh30细胞的对比实施例得到的细胞相比，通过使用her2表达细胞(其通过使pbmc表达靶抗原her2而制备)得到了5倍或更多的细胞。因此，发现
本公开内容的方法表现出优秀的细胞生产力且能够生产临床应用必需的足够数目的细胞。特别地，当将从pbmc制备的细胞用作her2表达细胞时，cd8-阳性细胞的比例是58.7%，且它是使用k562或rh30细胞时的比例的两倍还多，并且得到的car-阳性的、cd8-阳性的细胞的数目为超过10倍。发现可以主要生产cd8-阳性的car-t细胞。
[0132]
进一步，在质量方面，与当使用k562或rh30细胞时的表达相比，当将从pbmc制备的细胞用作her2表达细胞时，car-阳性的细胞中的pd-1表达是极低的，为0.7%，且cd45ra和ccr7阳性的原初细胞的比例也是62.8%，这为超过1.5倍，表明细胞是年轻的且没有耗尽，并且可以生产高质量car-t细胞。
[0133]
工业适用性根据本公开内容，可以在表达car的免疫细胞的生产中增加细胞增殖速率，且可以稳定地生产具有高细胞毒性活性的car-t细胞。特别地，可显著改善用于实体瘤的表达car的免疫细胞的生产效率，且因此car-t细胞疗法可以应用于多种癌症类型。