外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用与流程

外切型菊糖酶inugold及其制备方法、以及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种外切型菊糖酶inugold及其制备方法、以及其应用。


背景技术：

2.果糖是一种优秀的单糖，它口感好、甜度高且升糖指数低，被称为“健康糖”。果糖是主要的食用糖。尤其随着消费观念的改变，食品和饮料行业对果糖的需求量越来越大，果糖和果葡糖浆的用量已经成为食用糖的主要产品。
3.目前，工业生产果糖的方法主要有两种：一、通过淀粉酶水解成葡萄糖，随后，葡萄糖在葡萄糖异构酶的作用下转化成果糖，此即为双酶法工艺，但通常只能得到果糖和葡萄糖的混合物(即常说的果葡糖浆)，如果需要纯的或者高含量的果糖，则需要进行复杂的纯化工艺；二、通过酸法和酶法将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，然后通过离子排斥层析从葡萄糖中分离果糖，而酸法水解蔗糖存在潜在的污染，且通过异构酶转化葡萄糖制备的果葡糖浆混合物通常果糖含量仅有42％。如果需要高纯度的果糖，则需要后继的复杂的分离纯化系统。
4.菊糖(又称菊粉)是一种仅次于淀粉的可食用性、储藏性多糖，它广泛存在于菊科植物中，是一种来源丰富、价格低廉的可再生资源。其主要存在于菊芋和菊苣中，故名菊糖。菊糖是一种由果糖单体聚合形成的天然大分子聚合物，它于1804年由德国科学家首次从植物中提取。菊糖是由β-d-果糖苷键连接多个果糖基而成的链状多糖。天然菊糖是由长度不同、聚合度各异的果糖聚合物组成的一种混合物，其聚合度(dp)大致在2～100之间。因此，菊糖是生产果糖的理想材料。而通过外切型菊糖酶水解菊糖以产生果糖是一种有效的、绿色的和先进的技术。
5.外切型菊糖酶在植物和微生物中均有分布，但从自然中获得的微生物生产出的外切型菊糖酶的活性较低，从而限制了外切型菊糖酶的工业化应用。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提出一种外切型菊糖酶inugold及其制备方法、以及其应用，旨在提供一种高活性的外切型菊糖酶。
7.为实现上述目的，本发明提出一种外切型菊糖酶inugold，所述外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.此外，本发明还提出一种外切型菊糖酶基因，所述外切型菊糖酶基因用于编码如上所述的外切型菊糖酶inugold。
9.可选地，所述外切型菊糖酶基因的核苷酸序列如id no：1所示。
10.此外，本发明还提出一种表达盒，所述表达盒包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
11.此外，本发明还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
12.此外，本发明还提出一种重组菌株，所述重组菌株包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
13.可选地，所述重组菌株的宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉菌和酵母菌中的任意一种。
14.可选地，所述酵母菌包括乳酸克鲁维酵母。
15.此外，本发明还提出一种外切型菊糖酶inugold的制备方法，培养如上所述的重组菌株，得到外切型菊糖酶。
16.此外，本发明还提出一种如上所述的外切型菊糖酶inugold在制备果糖中的应用。
17.本发明提供的外切型菊糖酶inugold，是以马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶inu1的氨基酸序列(x57202.1)为原始材料，通过人工的设计改造，对外切型菊糖酶inu1进行了定点突变改造，得到了具有高活性的外切型菊糖酶inugold，所述外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列如seq id no：2所示，将其用来制备果糖时，显著提高了果糖的生产效率，可用于果糖的工业化生产。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为本发明实施例1中出发材料外切型菊糖酶inu1的三维结构；
20.图2为本发明实施例1中外切型菊糖酶inugold活性中心的三维结构；
21.图3为本发明实施例3中的重组表达载体pgklac-inugold的图谱；
22.图4为本发明实施例3中的重组表达载体pgklac-inugold经双酶切后的凝胶电泳图；
23.图5为本发明实施例5中的各发酵上清液的sds-pege结果；
24.图6为本发明实施例5中的各发酵上清液的酶活测试结果。
25.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明提出一种外切型菊糖酶inugold，所述外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列如seq id no：2所示。
29.在本实施例中，以马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶inu1的氨基酸序列(x57202.1)为出发材料，人工设计改造优化，获得了新型外切型菊糖酶inugold，从而提高了原始菊糖酶的活性，将具有高活性的外切型菊糖酶inugold用来制备果糖时，显著提高了果糖的生产效率，可用于果糖的工业化生产。
30.具体地，本发明基于侯选菊糖酶inu1的蛋白序列，在对序列特点统计分析基础上，探究蛋白质的序列-结构-功能之间的关系，基于蛋白质结构的信息以及大规模数据统计和深度学习，设计并获得序列底物/产物催化效率提高的新型外切型菊糖酶inugold。新型外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列seq id no：2所示。与原始菊糖酶inu1序列差异主要在于第65位天冬氨酸突变为亮氨酸(d65l)、第241位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g241d)、第306位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸(m306f)、第326位的酪氨酸突变为亮氨酸(y326l)、第476位的亮氨酸突变为脯氨酸(l476p)。需要说明的是，点突变可采用本领域常规的各种突变方法，在此不再赘述。
31.本发明还提出一种外切型菊糖酶基因，本发明不限制所述外切型菊糖酶基因具体的核苷酸序列，只要其能编码出上述外切型菊糖酶inugold(seq id no：2)即可。
32.基于表达宿主的进化信息、表达宿主对密码子的偏好性、酶分子的进化信息等完成对外切型菊糖酶基因密码子全新设计与优化；优化适配性宿主细胞。在本实施例中，人工合成的所述外切型菊糖酶基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，将其命名为外切型菊糖酶基因inugold。包括该外切型菊糖酶基因inugold的重组菌株经诱导表达后，能获得高产量的外切型菊糖酶inugold，且获得的外切型菊糖酶inugold具有高活性。
33.本发明还提出一种表达盒，所述表达盒包括如上所述的外切型菊糖酶基因inugold(seq id no：1)。具体地，通过将乳糖诱导型启动子plac2、外切型菊糖酶基因inugold以及乳糖操纵子终止序列tt组合，从而组成了一种受乳糖诱导表达的表达盒。
34.可以理解的是，该表达盒包括了用于驱动上述外切型菊糖酶基因inugold表达的乳糖启动子。在重组菌株的培养过程中，当向培养基中加入乳糖时，乳糖既可以是重组菌株生产的碳素营养，又能够诱导启动外切型菊糖酶基因inugold的强表达。
35.较优地，所述表达盒还包括信号肽序列alpha-mate factor，该信号肽序列位于启动子的下游与该外切型菊糖酶基因inugold的上游之间，用于引导外切型菊糖酶的跨膜转移至细胞外。
36.本发明还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的外切型菊糖酶基因inugold(seq id no：1)。进一步地，所述重组表达载体包括上述表达盒。在外切型菊糖酶基因inugold的核苷酸序列和外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的表达载体以及其他功能单元。其中，所述表达载体可以为适于在细菌、酵母、真菌等宿主中表达的载体。在一优选实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体和乳酸克鲁维表达载体中的任意一种。更优地，所述表达载体为乳酸克鲁维表达载体。
37.在一具体实施例中，所述重组表达载体由以下步骤制得：
38.步骤s10、在外切型菊糖酶基因inugold片段两端分别引入nde i和ecor i酶切位
点，用nde i和ecor i双酶切外切型菊糖酶基因inugold后、在t4连接酶的作用下，16℃过夜，将酶切后的菊糖酶基因片段连接到经相同酶切后的经胶回收后的乳酸克鲁维表达载体pgklac上，得到重组表达载体，命名为pgklac-inugold。
39.本发明还提出一种重组菌株，所述重组菌株包括如上所述的外切型菊糖酶基因inugold(seq id no：1)。进一步地，所述重组菌株包括如上所述的重组表达载体。所述重组菌株的表达产物为上述外切型菊糖酶inugold(seq id no：2)。其中，所述重组菌株的宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉菌和酵母菌中的任意一种。较优地，所述重组菌株的宿主细胞为酵母菌中的乳酸克鲁维酵母。
40.在一具体实施例中，所述重组菌株由以下步骤制得：
41.步骤s20、用限制性内切酶将上述步骤s10制得的重组表达载体pgklac-inugold线性化；
42.步骤s21、采用电转仪将线性化后的重组表达载体转化入乳酸克鲁维酵母中；
43.步骤s22、在含乙酰胺的平板中筛选生长出的单菌落；
44.步骤s23经划线纯化后，经pcr验证为准确的阳性转化子，即得到含外切酶菊糖酶inugold基因的酵母重组菌株。
45.本发明还提出一种外切型菊糖酶inugold的制备方法，所述制备方法包括：培养如上所述的重组菌株，得到外切型菊糖酶inugold。具体地，将含有外切型菊糖酶基因inugold的重组菌株在含乳糖的ypgal培养液中培养，在菌株生长的过程中，外切型菊糖酶inugold被逐渐诱导表达分泌到培养液中，此时的培养液可作为含外切型菊糖酶inugold的液体，同时也可以进一步精制。
46.本发明还提出一种如上所述的外切型菊糖酶inugold在制备果糖中的应用。具体地，采用外切型菊糖酶inugold与菊糖接触，通过外切型菊糖酶inugold对菊糖的水解作用得到果糖。
47.进一步地，所述外切型菊糖酶inugold是由所述外切型菊糖酶基因inugold编码得到的。由于人工设计合成的所述外切型菊糖酶基因inugold具有高产量、高活性的特点，因此，与传统果糖的制备方法相比，本发明提供的获得果糖的方法更高效，能适用于果糖的工业化生产。
48.优选地，外切型菊糖酶inugold对菊糖的水解参数为：ph 5.0，温度50℃，菊糖浓度为15％，外切型菊糖酶/菊糖比为5000u/g(即酶活力单位与底物质量比为5000u/g)，水解时间为4小时，在上述水解参数下，能高效便捷地获得高纯度的果糖浆。
49.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
50.实施例1外切型菊糖酶inugold的获得
51.以马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶inu1的氨基酸序列(x57202.1)为出发材料，其中，所述出发的外切型菊糖酶inu1基因(将其命名为外切型菊糖酶基因inu1)的核苷酸序列由seq id no：3所示，外切型菊糖酶inu1的氨基酸序列由seq id no：4所示。可以理解的是，核苷酸序列(seq id no：3)中最后的tga为终止密码子。
52.本发明基于侯选外切型菊糖酶inu1的蛋白序列数据库，对序列特点进行统计分析，构建酶的隐马尔科夫模型；通过隐马尔科夫模型检索潜在候选的突变位点；探究蛋白质
的序列-结构-功能之间的关系；基于蛋白质结构的信息以及大规模数据统计和深度学习，在trrosetta等的辅助下，设计并获得序列底物/产物催化效率提高的新型外切型菊糖酶inugold，所述新型外切型菊糖酶inugold的氨基酸序列seq id no：2所示，其与原始菊糖酶inu1序列差异主要在于第65位天冬氨酸突变为亮氨酸(d65l)、第241位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g241d)、第306位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸(m306f)、第326位的酪氨酸突变为亮氨酸(y326l)、第476位的亮氨酸突变为脯氨酸(l476p)。
53.图1为出发材料外切型菊糖酶inu1的三维结构，由图1可以看出外切型菊糖酶inu1围绕活性中心的5个关键性的氨基酸asp65、gly241、met306、tyr326和leu476。
54.图2为外切型菊糖酶inugold活性中心的三维结构，由图2可以看出重新设计的外切型菊糖酶inugold围绕活性中心的5个关键氨基酸leu65、asp241、phe306、leu326和phe476。
55.实施例2外切型菊糖酶基因inugold的获得
56.基于表达宿主的进化信息、表达宿主对密码子的偏好性、酶分子的进化信息和酶基因的序列信息等，基于gene designer等完成对外切型菊糖酶基因inugold密码子全新设计与优化；优化适配性宿主细胞。通过人工优化、设计、合成并获得高活性、高产量的外切型菊糖酶基因inugold，外切型菊糖酶基因inugold的核苷酸序列seq id no:1所示。可以理解的是，核苷酸序列seq id no:1最后的taa为终止密码子。
57.实施例3重组表达载体的构建
58.(1)在实施例1合成的外切型菊糖酶基因inugold(seq id no：1)片段两端分别引入nde i和ecor i酶切位点，用nde i和ecor i双酶切外切型菊糖酶基因inugold后、在t4连接酶的作用下，16℃过夜，将酶切后的菊糖酶基因片段连接到经相同酶切后的经胶回收后的乳酸克鲁维表达载体pgklac上，得到重组表达载体，命名为pgklac-inugold，所述pgklac-inugold重组表达载体的图谱如图3所示。该外切型菊糖酶基因inugold由乳糖诱导子驱动表达，由乳糖tt终止子终止表达。
59.(2)出发材料外切型菊糖酶基因inu1的重组表达载体采用上述步骤(1)相同的方式构建，并命名为pgklac-inu1。
60.提取质粒pgklac-inugold载体，进行nde i和ecor i双酶切验证，实施结果如图4所示(图4中：m为dna marker，1代表未酶切的pgklac-inugold载体，2代表双酶切的pao-inu载体)。由图4可知，在1600bp位置有条带，表明外切型菊糖酶基因inugold成功连接至表达载体上，也即，重组表达载体成功构建。
61.实施例4重组菌株的构建
62.(1)用限制性内切酶将上述实施例3制得的重组表达载体pgklac-inugold线性化，线性化条件为：每200l体积中含有质粒4μg，sac ii酶10u，将其置于37℃线性化2h后，沉淀干燥备用。
63.(2)采用电转仪将线性化后的重组表达载体转化入乳酸克鲁维酵母中，电转化的条件参数为v＝1500v，pc＝200ω，c＝25μf。
64.(3)在含乙酰胺的平板中，置于28℃培养箱培养2～3d筛选生长出的单菌落。
65.(4)经划线纯化后，经pcr验证为准确的阳性转化子，即得到含外切酶菊糖酶inugold基因的酵母重组菌株。
66.(5)出发材料外切型菊糖酶基因inu1的重组菌株采用上述步骤(1)、(2)和(3)相同的方式构建，得到含外切型菊糖酶基因inu1的重组菌株。
67.经鉴定，上述得到的含外切酶菊糖酶基因inugold的乳酸克鲁维重组菌株细胞呈白色球形，生长过程中温度为28～30℃，乳糖为主要的碳源。
68.实施例5外切型菊糖酶inugold的制备
69.将实施例4步骤(4)和步骤(5)制得的重组菌株分别接种于装有50ml ypd培养基的250ml容量瓶中，28℃、180r/min恒温振荡培养。当od
600
约为3.0～6.0时，转接入含100ml培养基yplac培养基中(yplac培养基的成分为每1000ml液体含酵母粉10g，蛋白胨20g，乳糖20g)，于不同的时间点(第12/24/36/48h，接种时作为发酵起始点第0h)取发酵液，10000rpm，离心5min，取上清液(分别为外切型菊糖酶inugold和外切型菊糖酶inu1)。
70.将上述各发酵上清液采取sds-page检测，其结果如图5所示。由图5可以看出，人工设计优化得到的外切型菊糖酶基因inugold重组菌株中的蛋白含量明显高于含出发菊糖酶基因inu1的重组菌株。
71.检测上述各发酵上清液的酶活力，其结果如图6(图中：纵坐标表示酶活，单位为u/ml；横坐标为不同的时间点)所示。由图6可以看出，经优化设计改造后的外切型菊糖酶inugold的活性明显高于原始外切型菊糖酶基因inu1的活性，具体地，在第48h时，酶活达到21500u/ml，而原始基因仅为6150u/ml，活性提高了约3.5倍。
72.综上，优化得到的外切酶菊糖酶基因inugold构建的重组菌株经发酵培养后，能够获得高产量、高活性的外切型菊糖酶inugold。
73.实施例6果糖的制备
74.将实施例5中含外切酶菊糖酶基因inugold构建的重组菌株培养得到的外切型菊糖酶inugold接触菊糖，通过对菊糖的水解作用得到果糖。
75.优化反应体系：
76.1.菊糖浓度对水解的影响；在ph 5.0，温度50℃，实施例5提到的酶液用量与菊糖底物的体积比为1:1，水解时间为0.5h，在一系列的菊糖浓度分别为8％，10％，15％，30％，50％条件下，通过检测水解产物，发现底物浓度对菊糖的水解率有显著影响，当底物浓度为15％时，水解率接近100％，底物浓度高于15％，水解率下降明显。采用15％的菊糖用于以下实验。
77.2.酶活力单位与菊糖的质量比对菊糖水解率的影响；在ph 5.0，温度50℃，反应菊糖底物浓度15％，水解时间0.5h的条件下，设定了一系列不同的外切型菊糖酶酶活力单位与菊糖底物重量比(u/g)，分别是：25000、12000、10500、7500、5000和4000，检测各比例下的菊糖的水解率。结果显示，随着外切型菊糖酶的增加，菊糖的水解率提高。同时，当酶量从5000变为12000时，其中的水解速率非常相似。考虑到水解时间设定为0.5小时，选择5000u/g的比例用于后续实验。
78.3.水解时间对菊糖水解率的影响。在ph5.0，温度50℃，底物浓度为15％，酶/菊糖比为10000u/g的条件下，研究了水解时间对菊糖水解速率的影响。当反应时间为2小时，约95％的菊糖水解，当时间延长至大于4小时后，菊糖几乎100％地被水解成单糖。
79.4.根据上述优化试验，菊糖的最佳水解参数为ph 5.0，温度50℃，菊糖浓度为15％，酶/菊糖比为5000u/g，水解时间为4小时。在4小时水解后，具有不同链长的果糖聚合
物的混合物完全水解，并且产物仅含有两种组分，果糖回收率为95％，其他物质葡萄糖至多为5％。
80.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。