铁酸钴纳米粒子及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于纳米药物技术领域，具体公开了一种cofe2o4纳米粒子的制备及其应用。


背景技术：

2.当前，癌症已严重威胁着世界各地人们的健康，严重影响着患者的生活质量，癌症传统的治疗方法包括手术、化学疗法、放射疗法等，这些疗法会给患者带来极大的痛苦，并且伴有不可避免的副作用，随着科技和医疗技术的发展，许多有潜力的癌症治疗方式得到深入的研究与探索。
3.光热治疗（ptt）作为一种安全且有发展前景的治疗癌症的方法，主要运用 nir 光对肿瘤所在区域进行照射，使肿瘤局部组织温度升高，从而杀死细胞，与传统治疗相比ptt具有高效、无创、无系统副作用等优点。然而，由于光的穿透深度有限，单用 ptt 很难完全消除癌细胞，阻止肿瘤复发。化学动力学治疗（chemodynamic therapy, cdt）是一种副作用低的非侵入性治疗方法，通过金属离子介导的fenton/fenton 类反应来催化肿瘤微环境（tme）中过表达的h2o2产生剧毒的羟基自由基（
·
oh），从而导致肿瘤细胞凋亡或坏死，具有独立性强、选择性高和适用于组织深处肿瘤的治疗的特点。当 ptt 与 cdt 联合使用时，cdt可治疗近红外光难以穿透的深部肿瘤，同时温度升高会加速
·
oh 的产生从而增强cdt。ptt 与 cdt 相协同克服了单一疗法效果差的缺点，可达到1 1》2的治疗效果。
4.作为常见的铁氧体之一，铁酸钴（cofe2o4）属于尖晶石结构是钴元素和铁元素的复合氧化物，具有良好的磁性、光热性能和表面可修饰性能。cofe2o4在近红外光吸光度较高，具优异的光热转换效率，且cofe2o4中的金属离子可发生芬顿反应，cofe2o4具有光热/化学动力学双疗法协同的作用，可有效杀死肿瘤细胞，阻止肿瘤细胞转移和复发。然而cofe2o4不稳定，易聚集，生物安全性差等缺点，限制了cofe2o4在生物体中肿瘤治疗的应用。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术中的不足，本发明的第一个目的是提供一种cofe2o4纳米粒子的制备方法，该制备方法所需原料易得、制备过程及设备要求简单，且材料对环境无污染。通过该方法制备的cofe2o4纳米粒子不仅具有良好的光热转换效率和芬顿反应速率，并且具有较高的稳定性和生物相容性，可以作为双疗法协同的铁酸钴纳米抗癌药物。
6.为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：一种cofe2o4纳米粒子的制备方法，包括步骤如下：1）将聚乙二醇衍生物溶于去离子水中得到稳定剂溶液；2）将铁盐和钴盐溶解于有机醇溶液中，搅拌30~120 min，边搅拌边依次加入稳定剂溶液和乙酸钠，搅拌均匀后，转移至反应釜中，在150~300 ℃反应6~32 h，反应结束后，用去离子水和无水乙醇混合溶液透析后冷冻干燥，得粒径为5～300 nm的cofe2o4纳米粒子；所述的聚乙二醇衍生物、铁盐、钴盐的摩尔比为：（0.0742~0.742）:2:1。
7.进一步的，上述cofe2o4纳米粒子的制备方法，所述铁盐为氯化铁、水合氯化铁、硝酸铁或硫酸铁中的任意一种。
8.进一步的，上述cofe2o4纳米粒子的制备方法，所述钴盐为氯化钴、水合氯化钴或硝酸钴中的任意一种。
9.进一步的，上述cofe2o4纳米粒子的制备方法，所述的有机醇溶液为乙二醇或二乙二醇。
10.进一步的，上述cofe2o4纳米粒子的制备方法，所述的聚乙二醇衍生物为mpeg-p(age-mpa)。
11.本发明还有一个技术方案是通过上述的方法制得的cofe2o4纳米粒子。
12.本发明还有一个技术方案是上述cofe2o4纳米粒子在制备治疗肿瘤纳米药物的应用；以及作为将近红外激光转化为热能的介质的应用。
13.进一步的，上述的cofe2o4纳米粒子在制备治疗肿瘤纳米药物的应用，所述的cofe2o4纳米粒子作为光热疗法或/和化学动力学疗法治疗肿瘤的纳米药物。
14.进一步的，上述的cofe2o4纳米粒子作为将近红外激光转化为热能的介质，所述的cofe2o4纳米粒子将近红外激光转化为热能时近红外激光的波长为650～1100nm；功率密度为0.1～5 w/cm2；激光照射的时间为5～30 min。
15.本发明提供的技术方案具有如下优点：本发明提供的技术方案所需原料易得、制备过程及设备要求简单，且材料对环境无污染。
16.本发明制备的cofe2o4纳米粒子具有简单高效的特点，由于聚乙二醇衍生物mpeg-p(age-mpa)包含大量羧基基团，以此为稳定剂增加了铁酸钴纳米粒子的稳定性和生物相容性，延长了血液循环时间。通过本发明方法制备得到的铁酸钴纳米粒子粒径小且可控，具有较好的肿瘤渗透滞留效应（epr）在肿瘤部位富集程度高，同时该铁酸钴纳米药物能在近红外激光照射下快速升温并结合芬顿反应实现ptt/cdt双疗法协同治疗肿瘤。
17.本发明制备的铁酸钴纳米药物克服了单一疗法的肿瘤疗效差以及材料本身不稳定、安全性差的缺点，为铁酸钴在安全高效的肿瘤治疗应用中提供了一种新的策略。
附图说明
18.图1为实施例1中cofe2o4的透射电镜（tem）图。
19.图2为实施例1中cofe2o4水动力粒径分布图。
20.图3为实施例1中cofe2o4的zeta电位图。
21.图4为实施例1中cofe2o4的xrd电位图。
22.图5为实施例2中cofe2o4的透射电镜（tem）图。
23.图6为实施例3中cofe2o4的透射电镜（tem）图。
24.图7为实施例4中cofe2o4的透射电镜（tem）图。
25.图8为实施例1中cofe2o4随时间变化的体外光热转化升温图。
26.图9为检测实施例1中cofe2o4产生羟基自由基的结果图。
27.图10为实施例1中不同浓度cofe2o4（0、25、50、100、200、300、400 μg/ml）对l-o2细胞生长抑制图。
28.图11为实施例1中cofe2o4促进hepg2细胞活性氧产生的倒置荧光显微镜图（50x）。
29.图12为实施例1中不同浓度的cofe2o4（0、25、50、100、200、300、400 μg/ml）在有或无激光作用下对hepg2细胞生长抑制图（激光：nir 808nm, 1.2w/cm2, 10 min）。
具体实施方式
30.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
31.实施例1将100 mg聚合物胶束 mpeg-p(age-mpa)溶于2 ml去离子水中制备稳定剂溶液。再将六水合氯化铁（0.2 mmol）和水合氯化钴（0.1 mmol）溶解于23 ml的乙二醇溶液中，混匀，边搅拌边依次加入稳定剂溶液和0.5 g的naac，600 rpm搅拌60 min，转移至反应釜中，200 ℃反应24 h，反应结束后，用去离子水和乙醇混合溶液进行透析，冷冻干燥得cofe2o4纳米粒子。
32.所得cofe2o4的形状大小如图1的tem图所示，呈椭圆形，粒径10~30 nm。如图2所示cofe2o4水动力直径分布在57.70 nm左右，并且具有较好的水分散性和稳定性。cofe2o4的zeta电位如图3所示在-19.17 ev左右，与带负电位的血液中蛋白及细胞的电荷相斥促进了cofe2o4的安全性。如图4的xrd图所示cofe2o4的特征衍射峰与cofe2o4的jcpds标准卡片pdf-03-0864基本相同，表明制备的cofe2o4结晶度好。
33.实施例2将50 mg聚合物胶束 mpeg-p(age-mpa)溶于2 ml去离子水中制备稳定剂溶液。再将水合氯化铁（0.2 mmol）和氯化钴（0.1 mmol）溶解于23 ml的乙二醇溶液中，混匀，边搅拌边依次加入稳定剂溶液和0.5 g 的naac，600 rpm搅拌120 min，转移至反应釜中，150 ℃反应30 h，反应结束后，通过用去离子水和无水乙醇混合溶液透析，冷冻干燥得cofe2o4纳米粒子。所得cofe2o4的形状大小如图5所示，呈六边形，粒径150~300 nm。
34.实施例3将300 mg聚合物胶束 mpeg-p(age-mpa)溶于2 ml去离子水中制备稳定剂溶液。再将硝酸铁（0.2 mmol）和硝酸钴（0.1 mmol）溶解于23 ml的二乙二醇溶液中，混匀，边搅拌边依次加入稳定剂溶液和0.5 g 的naac，1000 rpm搅拌30 min，转移至反应釜中，280 ℃反应8 h，反应结束后，通过用去离子水和无水乙醇混合溶液透析，冷冻干燥得cofe2o4纳米粒子。所得cofe2o4的形状大小如图6所示，有聚集的不规则小颗粒也存在大的纳米粒子，粒径在5~200 nm。
35.实施例4将500 mg聚合物胶束 mpeg-p(age-mpa)溶于2 ml去离子水中制备稳定剂溶液。再将硫酸铁（0.2 mmol）和水合氯化钴（0.1 mmol）溶解于23 ml的二乙二醇溶液中，混匀，边搅拌边依次加入稳定剂溶液和0.5 g 的naac，200 rpm搅拌120 min，转移至反应釜中，300 ℃反应24 h，反应结束后，通过用去离子水和无水乙醇混合溶液透析，冷冻干燥得cofe2o4纳米粒子。所得cofe2o4的形状大小如图7所示，呈聚集的小颗粒，粒径5~20 nm。
36.实施例5本实施例为实施例1的应用，验证cofe2o4纳米药物的光热性能。
37.配制浓度分别为400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，0μg/ml的cofe2o4水溶液。测试不同浓度cofe2o4水溶液在808nm的近红外光（1.2w/cm2）照射下随时间变化的体外近红外光热转化升温变化情况。
38.结果如图8显示，cofe2o4的光热转化升温能力随浓度的升高而增强，光热剂的温度随着时间推移不断上升，400μg/ml的cofe2o4光照10分钟温度可达到59℃。温度高于43℃便可杀死肿瘤细胞，此温度可有效治疗肿瘤。
39.为了证明本技术提供的技术方案的效果：1、验证cofe2o4纳米药物的芬顿反应性能。（实施例1提供的cofe2o4纳米粒子）以亚甲基蓝（mb）为模拟物，运用比色法，测量了不同情况下
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oh的产生情况。配制10mgl-1
的mb溶液，分别取4mlmb溶液于5个10mlpe管中。组别设置为：pbs、h2o2、cofe2o4、cofe2o4 h2o2、cofe2o4 h2o2 l（laser）。避光反应4小时。12000rpm离心10min，上清用0.22μm滤膜过滤，滤液在650nm处测吸收值。
40.结果如图9所示，与mb、h2o2、cofe2o4等组相比cofe2o4 h2o2吸光度明显下降，表明cofe2o4在h2o2存在下能产生羟基自由基。同时在激光的照射下的cofe2o4 h2o2 l组吸光度下降更快，表明光热促进了芬顿反应，加强了cdt。
41.2、对cofe2o4进行体外生物相容性评价（实施例1提供的cofe2o4纳米粒子）通过细胞毒性实验，评估对人的正常肝癌细胞（l-o2）的细胞毒性。将l-o2细胞（5
×
104个细胞/孔）接种到96孔板中并培养过夜，吸走培养基，分别用含有不同浓度cofe2o4（0，25，50，100，200和400μg/ml）的完全培养基共孵育细胞24h，共孵育完成后，将各孔中的细胞培养液轻轻吸出，以纯培养基为溶剂，配制0.5μg/ml的mtt溶液，取100μl加入各孔，培养4h后，每孔加入100μldmso取代原来的培养基以溶解甲臜，用酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度。
42.结果如图10所示，与对照组相比，在实验的浓度范围内l-o2细胞与cofe2o4共孵育24h后，细胞活力仅显示出轻微的下降，这表明cofe2o4浓度低于400μg/ml时对正常细胞的生长影响较小，具有低毒性。cofe2o4的低毒性主要是由于其聚乙二醇衍生物作为稳定剂大大改善它的生物相容性。
43.3、验证cofe2o4纳米药物促进细胞内活性氧的产生（实施例1提供的cofe2o4纳米粒子）用ros荧光探针2
′
,7
′‑
二氟荧光素二乙酸酯（dcfh-da）检测细胞内ros的生成。将hepg2细胞（3
×
105个细胞/孔）接种到两块六孔板中，分为光照组和非光照组，非光照组：将孔板中加入不同浓度的cofe2o4（0、100、200、400μg/ml）一起孵育8h；光照组：将孔板中加入不同浓度的cofe2o4（0、100、200、400μg/ml）一起孵育6h后，用808nm的激光照射10min，再孵育2h。然后，将两组细胞用pbs洗涤两次，并与dcfh-da荧光探针一起温育30分钟。最后，用pbs洗涤细胞，并通过荧光倒置显微镜检测细胞内ros的产生。结果如图11所示，hepg2细胞内的活性氧随浓度上升而增多，并且近红外的光照产生更多的进活性氧。
44.4、验证cofe2o4纳米光热剂的抗肿瘤效果。（实施例1提供的cofe2o4纳米粒子）
cofe2o4对肿瘤细胞的双疗法协同治疗效果通过hepg2细胞的细胞毒性实验来验证。将hepg2细胞（5
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104个细胞/孔）接种到2块96孔板中并培养过夜，吸走培养基，其中一块板为非光照组，分别用含有不同浓度cofe2o4（0，25，50，100，200和400μg/ml）的完全培养基共孵育细胞24h，另一块板为光照组，分别用含有不同浓度cofe2o4（0，25，50，100，200和400μg/ml）的完全培养基共孵育细胞6h后置于近红外光下（808nmlaserat1.2w/cm2）照射5min，再将细胞再培养18h，两块板共孵育完成后，将各孔中的细胞培养液轻轻吸出，加入mtt溶液，培养4h后，加入dmso后用酶标仪检测490nm处的吸光度。结果如图12所示细胞的存活率随着浓度的上升而下降，同时，光照组的细胞存活率与未光照组相比明显降低的，双疗法加强了治疗肿瘤效果。