乳双歧杆菌与母乳低聚糖组合物在婴幼儿配方食品中的应用的制作方法

1.本发明是关于乳双歧杆菌与母乳低聚糖组合物在婴幼儿配方食品中的应用。


背景技术：

2.大量医学文献记载，未经母乳喂养的婴儿相对于母乳喂养的婴儿，有较高的疾病率和死亡率。母乳不仅为婴儿提供所需营养，母乳中的活性成分更为婴儿的肠道发育和免疫力完善提供保障。母乳喂养的婴儿与配方奶喂养的婴儿相比，肠道菌群中有益菌的相对丰度更高，特别是双歧杆菌和乳酸菌。
3.母乳通过菌群的传递，加上母乳低聚糖和母乳中的细胞因子等活性成分，为新生儿建立起健康的肠道菌群。婴儿每天通过母乳摄入10
7-108个细菌，包括乳酸菌和双歧杆菌。这些菌通过母乳直接传递给婴儿，部分可在婴儿肠道定植，促进生命早期肠道菌群的建立。婴儿肠道菌群的建立，对其肠道的发育，以及对健康和免疫系统有着短期，甚至终生的影响。
4.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，简称hmos)是人乳中存在的第三大乳化合物群体。其在婴幼儿早期发育中起着重要的作用。迄今为止，已经确定了130多不同的结构，但功能影响尚为未知。乳中大多数寡糖不能被消化，因此，hmo可以作为益生元。此外，hmo在免疫系统的成熟方面及其作为免疫调节剂的作用显示它对婴幼儿健康发育的重要性。目前，hmo已经被加入到婴儿配方食品中。
5.目前在婴幼儿配方食品、辅食及营养补充剂领域，需要有缓解婴幼儿肠道不适及提升自身抵御致病菌(如金黄色葡萄球菌)感染能力的解决方案。


技术实现要素：

6.本案发明人在研究中发现，一些乳双歧杆菌与母乳低聚糖组合可提升生物体抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力，从而提供了下述发明：
7.一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物在制备婴幼儿配方食品中的应用，其中，婴幼儿配方食品折合干物质中含有乳双歧杆菌1
×
103cfu～1
×
10
12
cfu/100g，母乳低聚糖0.1g～10g/100g。
8.另一方面，本发明还提供了一种具有可有效提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力、可提高生物体先天免疫的婴幼儿配方食品，其是将乳双歧杆菌与母乳低聚糖添加到婴幼儿配方食品中制备得到的。
9.根据本发明的具体实施方案，本发明的所述婴幼儿配方食品折合干物质中，总蛋白质含量为8g～20g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为40％～70％；脂肪含量为15g～30g/100g；碳水化合物含量为50g～70g/100g，优选所述婴幼儿配方食品折合干物质中，总蛋白质含量为10g～18g/100g；乳清蛋白占总蛋白的比例为40％-65％；脂肪含量为18g～28g/100g；碳水化合物含量为52g～60g/100g。。
10.根据本发明的具体实施方案，本发明的所述婴幼儿配方食品折合干物质中，还含
有亚油酸与α-亚麻酸，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g。
11.根据本发明的具体实施方案，本发明中的所述婴幼儿配方食品可以为针对0-6个月婴儿的配方食品、针对6-12个月较大婴儿的配方食品或针对12-36个月幼儿的配方食品。具体地，针对0-6个月婴儿的配方食品折合干物质中，总蛋白含量为8～15g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为60～70％，脂肪含量为23～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为50～60g/100g。针对6-12个月较大婴儿的配方食品折合干物质中，总蛋白含量为8～20g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为40～70％，脂肪含量为20～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为50～60g/100g。针对12-36个月幼儿的配方食品折合干物质中，总蛋白含量为8～20g/100g，脂肪含量20～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为50～60g/100g。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明的所述婴幼儿配方食品中，提供总蛋白的原料包括：生乳(牛/羊)、全脂奶粉(牛/羊)、脱脂奶粉(牛/羊)、乳清蛋白粉(牛/羊)、脱盐乳清粉中(牛/羊)、β-酪蛋白的一种或多种。具体地，基于1000重量份的上述婴幼儿配方食品，其原料包括：生乳(牛/羊)0～3500份，全脂奶粉0～260(牛/羊)份，乳清蛋白粉(牛/羊)0～120份，脱脂奶粉(牛/羊)0～400份，和/或脱盐乳清粉(牛/羊)0～600份，β-酪蛋白添加量为0-40份。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明的所述婴幼儿配方食品中，提供脂肪的原料包括以下重量份的原料中的一种或多种：玉米油0-50份、大豆油0-65份、葵花籽油0-100份、1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯份0-240、椰子油0-30份、低芥酸菜籽油0-85份、亚麻籽油0-20份。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的婴幼儿配方食品中，提供碳水化合物的原料包括：乳糖0～500份，和/或含有乳糖的上述蛋白原料。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明的婴幼儿配方食品中，除上述组分外，还可包括婴幼儿配方食品的常规组分，例如还可以包括营养素、膳食纤维、肌醇、牛磺酸、左旋肉碱、二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸、叶黄素、核苷酸、乳铁蛋白中的一种或多种。优选包括复配营养素包。在一些优选的实施方案中，所述婴幼儿配方食品包括0-20份的营养素，所述营养素包括维生素和矿物质，或进一步选择性包括膳食纤维(低聚果糖、低聚半乳糖、多聚果糖等)、肌醇、牛磺酸、左旋肉碱、二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸、叶黄素、核苷酸、乳铁蛋白中的一种或多种。复配营养素主要包括：复配维生素：维生素a、维生素d、维生素e、维生素k1、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b
12
、烟酸、叶酸、泛酸、维生素c、胆碱、生物素；复配矿物质：钠、钾、钙、磷、铜、铁、锌、锰、碘、硒、镁、钾及它们的衍生物。所述各维生素、矿物质的来源、含量及使用量，应该符合婴幼儿配方食品国家标准及相关法规。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述乳双歧杆菌包括乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)hn019菌株。乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)hn019菌株，为商业化菌株，可由杜邦丹尼斯克公司提供。
17.根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌
与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种。
[0018]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0019]
3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，与2
’‑
岩藻糖基乳糖互为同分异构体。是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0020]
乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)，为乳糖与四糖形成的六糖结构，该物质经微生物发酵法制备，是以核心糖链为基础结构，且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质，且与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0021]3’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与6
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0022]6’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sialyllactose，6
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与3
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0023]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，2
’‑
岩藻糖基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-73％，优选为0％-63％，进一步优选为0％-58％，更进一步优选为2％-55％，例如可以为3％-8％、25％-35％或51％-56％，更具体可以为5％、30％或53％。本发明中，除特别注明外，各母乳低聚糖的含量是以母乳低聚糖中的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖的总重量之和为100％计。
[0024]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，3
’‑
岩藻糖基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-61％，优选为11％-51％，进一步优选为16％-46％，更进一步优选为20％-44％，例如可以为18％-23％、25％-35％或40％-45％，更具体可以为21％、30％或41％。
[0025]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，乳糖-n-四糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-52％，优选为6％-42％，进一步优选为11-37％，更进一步优选为13％-35％，例如可以为13％-18％、22％-27％或30％-35％，更具体可以为16％、25％或32％。
[0026]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，3
’‑
唾液酸基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-42％，优选为0％-32％，进一步优选为0％-27％，更进一步优选为2％-25％，例如可以为2％-7％、10％-15％或20％-25％，更具体可以为5％、12％或22％。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，6
’‑
唾液酸基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-25％，优选为0％-15％，进一步优选为0％-10％，更进一步优选为0％-8％，例如可以为3％-8％，更具体可以为3％或5％。
[0028]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、3-岩藻糖基乳糖(3-fl)、乳糖-n-四糖(lnt)、3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)中的至少二种、至少三种或至少四种组成的组合。
[0029]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-73％):(0％-61％):(0％-52％):(0％-42％):(0％-25％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0030]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-63％):(11％-51％):(6％-42％):(0％-32％):(0％-15％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0031]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-58％):(16％-46％):(11％-37％):(0％-27％):(0％-10％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0032]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-55％):(20％-44％):(13％-35％):(2％-25％):(0％-8％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0033]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0～63％):(11～51％):(6～42％):(0～22％):(0～8％)，优选为(0～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(0～5％)，更优选为(5～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(0～5％)，更优选为(5～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(3～5％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0034]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(30％-53％):(21％-30％):(16％-25％):(5％-12％):(3％-5％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0035]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(33％-73％):(1％-41％):(0％-36％):(0％-25％):(0％-25％)，优选为(43％-63％):(11％-31％):(6％-26％):(0％-15％):(0％-15％)，更优选为(48％-58％):(16％-26％):(11％-21％):(0％-10％):(0％-10％)，最优选为(51％-56％):(18％-23％):(13％-18％):(2％-7％):(3％-8％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0036]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方食品的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述乳双歧杆菌与母乳低聚糖的比例为1
×
103cfu～1
×
10
12
cfu：0.1g～10g，优选为1
×
106cfu～1
×
10
10
cfu：1g～10g。在本发明的一些更具体实施
方案中，所述乳双歧杆菌与母乳低聚糖的比例为1
×
108cfu：0.08g～0.3g。所述乳双歧杆菌与母乳低聚糖的比例是以二者在同一组合物中的用量计。
[0037]
根据本发明的具体实施方案，本发明所述婴幼儿配方食品具有提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能和/或提高生物体先天免疫的功效。
[0038]
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述提升生物体对金黄色葡萄球菌感染抵御能力包括：提升个体预防金黄色葡萄球菌感染的能力，降低金黄色葡萄球菌感染个体的能力，和/或缓解金黄色葡萄球菌感染引起的各种症状例如食物中毒(包括恶心、呕吐、头晕等)、肠炎、肺炎、皮肤感染、伤口溃烂或脑膜炎等。
[0039]
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述生物体包括动物或人。
[0040]
本发明的婴幼儿配方食品，因包括所述的乳双歧杆菌与母乳低聚糖的组合物而具有可有效提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力、可提高生物体先天免疫。
[0041]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述婴幼儿配方食品的方法，该方法采用湿法或干法或干湿复合生产工艺，将乳双歧杆菌和母乳低聚糖组合物与配方中的其他原料混合，制备所述母乳化婴幼儿配方食品。其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。本发明中，乳双歧杆菌可以在配料时一起混料(在婴儿配方食品中以灭活形式存在)，优选在后混料过程中添加(在婴儿配方食品中以活菌形式存在)。本发明中，母乳低聚糖可以在配料时一起混料，也可以在后混料过程中添加。
[0042]
综上所述，本发明发现包括乳双歧杆菌和母乳低聚糖的所述组合物具有提高生物体先天免疫、可有效提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力，将其应用于婴幼儿配方食品中可抗感染、提高免疫力，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0043]
图1显示10mg/ml的母乳低聚糖组合物a与乳双歧杆菌hn019的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0044]
图2显示30mg/ml的母乳低聚糖组合物a与乳双歧杆菌hn019的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0045]
图3为母乳低聚糖组合物a与乳双歧杆菌hn019菌株的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0046]
图4为母乳低聚糖组合物a与乳双歧杆菌hn019菌株的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第五天的存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0047]
图5为庆大霉素圆片扩散抑菌圈实验结果图。
[0048]
图6为乳双歧杆菌hn019圆片扩散抑菌圈实验结果图。
[0049]
图7显示hn019(1
×
108cfu)与hmo组合物a(10mg/ml)在金葡菌感染前和/或感染期间共培养对于提升线虫存活率的不同效果。
[0050]
图8显示hmo组合物a(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0051]
图9显示hmo组合物g(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0052]
图10显示hmo组合物h(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0053]
图中：*代表p《0.05,**代表p《0.01,***代表p《0.001,****代表p《0.0001，ns代表没有显著性差异(not significant)。
具体实施方式
[0054]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0055]
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
[0056]
实施例中未详细注明的操作条件，按照所属领域的常规操作进行。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例提供一种粉状0～6月龄的婴儿配方食品，该粉状配方食品中总蛋白质含量为10.7g/100g粉，脂肪含量为27.9g/100g粉；碳水化合物含量为55.2g/100g粉；母乳低聚糖含量0.19g/100g粉；hn019益生菌1
×
108cfu/100g粉。
[0059]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0060]
生牛乳1000份，乳糖400份，混合植物油120份，opo结构油脂110份，脱盐乳清粉100份，脱脂奶粉20份，乳清蛋白粉80份，低聚半乳糖33份，低聚果糖22份，母乳低聚糖组合物(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl、6-sl混合物a)2份，乳双歧杆菌0.18份，复配维生素2.5份，复配矿物质8份。
[0061]
本实施例的婴儿配方粉采用干湿复合生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。经检测，该成品的各项指标符合婴幼儿配方食品标准要求。
[0062]
实施例2
[0063]
本实施例提供一种粉状6～12月龄的较大婴儿配方食品，该粉状配方食品中总蛋白质含量为12.5g/100g粉，脂肪含量为22.9g/100g粉；碳水化合物含量为57.9g/100g粉；母乳低聚糖含量0.39g/100g粉；hn019益生菌1.5
×
109cfu/100g粉。
[0064]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0065]
生牛乳2000份，脱盐乳清粉200份，乳糖260份，脱脂奶粉100份，混合植物油份150份(含opo结构脂)，乳清蛋白粉25份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl、6-sl混合物a)4份，乳双歧杆菌0.5份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0066]
本实施例的婴儿配方粉采用干湿复合产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。经检测，该成品的各项指标
符合婴幼儿配方食品标准要求。
[0067]
实施例3
[0068]
本实施例提供一种粉状12～36月龄的幼儿配方羊奶粉，该粉状配方食品中总蛋白质含量为13.8g/100g粉，脂肪含量为23.5g/100g粉；碳水化合物含量为57.5g/100g粉；母乳低聚糖含量0.78g/100g粉；hn019益生菌1
×
109cfu/100g粉。
[0069]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0070]
生羊乳1900份，脱盐乳清粉325份，乳糖140份，混合植物油份140份(含opo结构脂)，乳清蛋白粉45份，低聚半乳糖85份，低聚果糖5份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl、6-sl混合物h)8份，乳双歧杆菌0.33份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0071]
本实施例的幼儿配方粉采用干湿复合生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。经检测，该成品的各项指标符合婴幼儿配方食品标准要求。
[0072]
实施例4
[0073]
本实施例提供一种12～36月龄的幼儿配方液态奶，该配方食品折合干物质中总蛋白质含量为16.5g/100g；脂肪含量为20.5g/100g；碳水化合物含量为53.5g/100g；母乳低聚糖含量1.4g/100g；hn019益生菌1.5
×
109cfu/100g。
[0074]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份干物质)：
[0075]
水6400份，脱盐乳清粉300份，脱脂奶粉250份，混合植物油份170份(含opo结构脂)，全脂奶粉100份，乳糖140份，乳清蛋白粉30份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl、6-sl混合物a)15份，乳双歧杆菌0.5份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0076]
本实施例的幼儿配方食品采用现有工艺制备而成，主要包括：鲜奶-净乳-冷贮-混料-高温瞬间灭菌-无菌灌装封口，混料过程中添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。经检测，该成品的各项指标符合婴幼儿配方食品标准要求。
[0077]
乳双歧杆菌与母乳低聚糖组合物功效实验
[0078]
一、母乳低聚糖组合与乳双歧杆菌hn019组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响
[0079]
1.实验材料与方法
[0080]
1.1受试母乳低聚糖样品
[0081]
[0082]
五种hmo的组合物a中，组成比例为：53％2fl,21％3fl,16％lnt,5％3sl,5％6sl。
[0083]
用蒸馏水配置母乳低聚糖溶液，并在含有不同终浓度(分别是1、10、30mg/ml)的线虫生长培养基的培养皿中进行培养。
[0084]
用补充了1％半胱氨酸的mrs培养基来培养受试的益生菌，并在37℃厌氧环境中孵育过夜。收获细胞并用生理盐水溶液冲洗，调整细菌浓度将其接种在含有线虫生长培养基的平皿中，终浓度为1
×
108cfu。
[0085]
1.2线虫感染模型
[0086]
获取了年龄一致的线虫并将其培养在含线虫琼脂培养基(ngm培养基，线虫培养基中含有大肠杆菌op50为食物)的培养皿中，添加了不同剂量的hmo组合(8mg/ml，10mg/ml，30mg/ml)与益生菌(1
×
108cfu)组合物进行共培养(每个线虫培养皿中加入的液体总体积是10ml。对于浓度为10mg/ml的hmo受试组，每个培养皿中hmo的最终量是100mg；对于浓度分别为8mg/ml和30mg/ml的hmo受试组，每个培养皿中hmo的最终量分别是80mg和300mg。因此每个培养皿平板中，益生菌与hmo的添加量比例为：1
×
108cfu：80mg-300mg)。在线虫成年后，它们被转移到接种了金黄色葡萄球菌atcc25923的培养皿中，添加量为108～109cfu/ml，来模拟受到金黄色葡萄球菌感染的情况。各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。使用了两个对照，分别是没有致病菌的条件(线虫培养皿中含有大肠杆菌op50)，以及有致病菌金黄色葡萄球菌感染但没有任何干预物的(只含有金黄色葡萄球菌的培养皿)。另设置培养阶段添加干预物而感染阶段没有任何干预物的组别、以及培养阶段未添加干预物而感染阶段添加干预物的组别。
[0087]
将线虫培养几天后，对它们的存活率进行每日计数。如果线虫对铂丝没有反应，则可被认为是死亡。每种条件均进行了两次独立测定。
[0088]
对存活曲线进行了统计学的比较分析，用graphpad prism 4统计学软件包进行了log rank survival显著性分析。关于对线虫存活率的影响各组间在每一天体现的差异，先用two-way anova进行分析，再用tukey’s post hoc test进行各组间的比较，对于hmo组合物单独或益生菌单独组同益生元益生菌混合组的区别，在图上用星号标出。用one-way anova与dunnett’s post hoc test分析感染第三天或第五天各组存活率的显著性差异。
[0089]
1.3圆片扩散抑菌圈实验
[0090]
为确定受试物质是否本身具有抗菌效果，进行了圆片扩散的抑菌圈实验。用无菌的滤纸制成圆片，并接入受试的hmo物质(10mg/ml，30mg/ml)或益生菌(1
×
108cfu)，并将圆片在无菌条件下干燥过夜。将金黄色葡萄球菌atcc25923(1.0
×
106cfu/ml)均匀涂抹在ngm琼脂平板表面，随后再将圆片放置于接种的琼脂平板培养皿表面。庆大霉素(200μg/ml)作为阳性对照。所有培养皿在37摄氏度下培养18小时。通过观察在圆片周围是否形成透明的环状圈来确认受试物质是否能直接抑制细菌生长或者具有抗菌活性。
[0091]
2.实验结果
[0092]
乳双歧杆菌hn019与两种不同剂量的五种hmo组合物a对秀丽隐杆线虫受到金葡菌感染存活率的影响如图1和图2所示。在整个实验周期，hmo组合物在10mg/ml时，益生元益生菌组合物比hmo组合物单独或益生菌单独的效果均显著的好(p《0.0001)。而hmo组合物a在30mg/ml时，在整个实验周期，hmo与益生菌组合物并未体现优势。
[0093]
如图1所示，在hmo组合物a为10mg/ml时，益生元hmo和益生菌hn019组合物在第4、5
天效果显著好于益生菌hn019单独的组(p《0.05)，在第2、4、5天显著好于hmo组合物单独的组(第2天：p《0.0001；第4、5天：p《0.05)。在观察是否有协同效应时，将hmo与益生菌组合物的存活率数值与单独hmo组合或单独益生菌作比较，发现hmo与益生菌组合物存活率在第4和第5天均显著高于单独hmo组合与单独益生菌存活率数值的加和，体现了hmo与益生菌组合物的协同效应。可参见下表。
[0094][0095]
图3和图4显示了在感染第三天和第五天，hmo组合物a与益生菌形成的组合物对秀丽隐杆线虫存活率影响的比较。在感染第五天，益生元与hn019形成的组合物相比于其他受试组，效果较好。
[0096]
此外，本发明的实验显示，培养阶段添加了hmo和hn019的组合干预物而感染阶段没有添加任何干预物的组别的秀丽隐杆线虫存活率，显著高于培养阶段及感染阶段均未添加干预物的组别。
[0097]
为了研究在此前测试中所出现的，hmo与益生菌组合物对于应对金黄色葡萄球菌感染起到的保护作用，是否来源于直接的杀菌或者抑菌功能，进行了受试物质和菌群一起培养并观察是否有抑菌圈形成的测试。如图5、图6所示，乳双歧杆菌hn019菌株未在接种点周围形成透明的环状抑菌圈(图6)。而阳性对照庆大霉素(gentamicin)则显示出了抑菌效果，以透明环状抑菌圈的产生作为标志(图5)。此外，各hmo单体在两个不同浓度下(10mg/ml，30mg/ml)的抑菌圈实验也有类似结果，各母乳低聚糖单体并不能直接抑制金葡菌生长。可见，本研究中体现的各母乳低聚糖和益生菌hn019组合物对于线虫受到金黄色葡萄球菌感染的保护作用并非源于物质可以直接杀菌。
[0098]
二、不同组成的母乳低聚糖组合与乳双歧杆菌hn019组合物的提升先天免疫功效实验
[0099]
本实施例中，受试母乳低聚糖组合物的各组分及含量比例如下：
[0100]
[0101]
受试组合物功效验证实验1(考察受试物在“提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力和/或提高生物体先天免疫”方面的预防效果)：获取了年龄一致的线虫并将其培养在含线虫琼脂培养基的培养皿中，添加了一定比例的hmo组合物a(10mg/ml)与hn019益生菌(1
×
108cfu)组合物进行共培养，直到线虫成年。此后，将线虫转移到感染的平板中，接受致病菌金黄色葡萄球菌atcc25923的感染，不添加hmo与益生菌组合物。
[0102]
受试组合物功效验证实验2(考察受试物在“提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力和/或提高生物体先天免疫”方面的治疗效果)：获取了年龄一致的线虫并将其培养在含线虫琼脂培养基的培养皿中。当线虫成年后，将线虫转移到平板中，平板中添加了一定比例的hmo组合物a(10mg/ml)与hn019益生菌(1
×
108cfu)组合物，并接受致病菌金黄色葡萄球菌atcc25923的感染。
[0103]
此外，另有一组，将线虫在感染前与感染后的阶段均添加了hmo与益生菌组合物，并与上述功效验证实验1、2两种情形作为对照组比较。
[0104]
将线虫培养几天后，对它们的存活率进行每日计数。如果线虫对铂丝没有反应，则可被认为是死亡。此外还包含了两组对照，一组没有添加致病菌(普通培养平板加上大肠杆菌op50作为食物)，另一组为感染对照组(平板上只添加了金葡菌)。每种条件均进行了两次独立测定。对存活曲线进行了统计学的比较分析，用graphpad prism 9统计学软件包进行了log rank survival显著性分析。
[0105]
实验过程中其余操作参照实施例1。
[0106]
实验结果：
[0107]
1.受试物质与线虫在感染前和/或感染期间共培养对于实验结果的影响
[0108]
如前所述，为了判断受试物质是否有预防效果，仅将线虫与hmo组合物a与hn019在金葡菌感染前进行共培养。为了判断受试物质是否有治疗效果，仅将线虫与hmo组合物a与hn019在金葡菌感染的同时进行共培养。同样，还包括了一种情况，即将受试物质与线虫在感染前和感染期间都共培养。
[0109]
结果参见图7所示。存活曲线显示，在培养后第一天到第五天，不管是将受试物质在感染前还是感染期间加入共培养，对于提升线虫在金葡菌感染情况下的存活率都有较好的提升和保护作用。而线虫在金葡菌感染期间才加入受试物质，和从始至终都有受试物质的情况，二者对金葡菌存活率的提升和保护作用都相似，且与仅在感染前加入受试物质相比，在感染阶段加入受试物质的情况，以及全过程都有受试物质的情况，对于线虫存活率的保护作用更高。
[0110]
2.hmo组合物a(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0111]
结果参见图8。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物a与单独的益生菌hn019(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，且当二者形成组合物之后，提升效果更显著(p《0.0001)。体现了益生菌hn019与hmo组合物a(8mg/ml)的较好的协同效应。
[0112]
3.hmo组合物g(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0113]
结果参见图9。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物g与单独
的益生菌hn019(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当二者形成组合物之后，提升效果有更显著的趋势。体现了益生菌hn019与hmo组合物g(8mg/ml)的较好的组合效果。
[0114]
4.hmo组合物h(8mg/ml)与乳双歧杆菌hn019单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0115]
结果参见图10。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物h与单独的益生菌hn019(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当二者形成组合物之后，提升效果有更显著的趋势。体现了益生菌hn019与hmo组合物h(8mg/ml)的较好的组合效果。