一种多环芳烃降解菌株及其筛选方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种多环芳烃降解菌株及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是一类广泛存在于环境中的有机污染物。pahs是一类由两个或两个以上苯环组成的碳氢化合物。pahs总体特征是高溶点、高沸点；不溶于水，易溶于苯、乙醚、氯仿等有机溶剂；随着苯环数量的增加，其水溶性降低，生物可利用性和可降解性也随之降低。
3.pahs主要是有机化合物在高温条件下(500℃～800℃)的不完全燃烧或低温处理 (100℃～300℃)时的产物，主要来源是由石油、煤炭、木材、气体燃料、纸张等含碳氢化合物的不完全燃烧。pahs的毒性已引起世界各国的共同关注。早在1979年，美国国家环保局(epa)已将16种pahs列为优先监测的污染物。因此，高效降解环境各介质中的pahs，消除pahs污染，对于维护人类健康和环境保护具有重要意义。
4.目前降解多环芳烃污染的几种方法主要有物理法、化学法及生物法。物理法主要有吸附法，但是吸附法对吸附材料要求较高，带来成本上升的问题，且吸附材料的再生利用是一个亟待解决的问题。化学法主要有氧化法，但是此法能量消耗大，适用范围窄，且容易产生二次污染。通过常规物理和化学方法从污染环境中去除菲、蒽、芴等多环芳烃是昂贵且不环保的过程。相比于物理化学法，微生物降解具有成本低，效率高，危害性小，对污染的土壤和水修复的有效选择，微生物代谢可以将这些有毒物质有效降解成无害的中间体和终产物，可进一步用于修复被各种多环芳烃化合物污染的环境。
5.菲(phenanthrene)是一种含有三个苯环的芳香烃化合物,它存在于煤焦油中，其化学性质接近于萘和蒽之间。可用于合成树脂、植物生长激素、还原染料、鞣料等方面，菲经氢化制得全氢菲可用于生产喷气飞机的燃料。通过鼻腔吸入，口腔食入以及皮肤接触后，具有致癌和致敏的危害，世界卫生组织国际癌症研究机构将菲列在3 类致癌物清单中。蒽(anthracene)也是一种含有3个环的多环芳烃，是菲的同分异构体。存在于煤焦油的高沸点组分中。用于发光材料、紫外吸收涂层、染料、杀虫剂杀菌剂、汽油阻燃剂等。由于其对生物具有致癌等毒害作用，世界卫生组织国际癌症研究机构将蒽列在3类致癌物清单中。芴(fluorene)是一种类似萘具有芳香气味的多环芳烃，在不纯时会发光，存在于汽车尾气、玉米须以及煤焦油的高沸点组分中，具有可燃性。其广泛用于制医药、染料、合成杀虫剂、除草剂，并可制抗冲击有机玻璃和芴酮树脂。芴是一种具有潜在致癌风险的有机物，在环境中微量接触容易致癌，大量接触会有中毒风险。
6.目前，已经发现多种菲、蒽、芴的降解菌株。然而目前，能够同时矿化这三种底物的菌株在此前的研究报道中没有报道。本发明所要解决的技术问题是开发一种能够降解菲、蒽、芴三种多环芳烃类化合物的多环芳烃降解菌株，通过对菌株mns-0的研究，将对深入展开菲、蒽和芴这三种化合物矿化机理的研究提供理论指导，在多环芳烃和杂环芳烃的生物
修复中发挥重要作用。
7.因此，本领域的技术人员致力于开发一种多环芳烃降解菌株，能够对菲、蒽、芴等多种多环芳烃类化合物都具有降解能力，能够实现清洁、高效、无二次污染的环境修复效果。


技术实现要素：

8.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种能够降解菲、蒽、芴三种多环芳烃类化合物的多环芳烃降解菌株，公开其筛选方法和应用。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种多环芳烃降解菌株，菌株为荧光假单胞菌 (diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0)，菌株于2021年6月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021789，保藏的地址为中国典型培养物保藏中心。
10.进一步地，菌mns-0最适生长温度为30℃，最适底物添加量为50ml的msm 培养基中加入菲20mg，该菌株既能降解多种多环芳烃菲、也能降解芴或蒽。
11.本发明还提供了一种多环芳烃降解菌株的筛选方法，方法包括以下步骤：
12.步骤1、将采集到的污水水样加入无机盐液体培养基(液体msm培养基)中，加菲，置于摇床培养，得到培养液；
13.步骤2、将步骤1得到的培养液转接至新鲜液体msm培养基中，重复转接三次，得到转接培养液，将转接培养液稀释并涂布在菲为唯一碳源的无机盐固体培养基平板上；将平板上长出的菌落进行复筛，将复筛长出的菌落进行划线分离，得到能以菲为唯一碳源生长的菌株，
14.步骤3、将步骤2得到的能以菲为唯一碳源生长的菌株进行生理生态鉴定；进行 16s rrna鉴定，并于ncbi中进行blast比对构建系统发育树；结合生理生化的菌学特征和进化树分析，鉴定菌株为diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0。
15.进一步地，步骤1中采集到的污水水样体积为5ml，液体msm培养基体积为 50ml，菲为5mg，置于摇床培养5天；菌株mns-0最适生长温度为30℃，最适底物添加量为菲20mg。
16.进一步地，液体msm培养基的配方为：1l中含有k2hpo4·
3h2o 6.8g，kh2po
4 3.7g，mgso
4 0.1g，na2so
4 1.0g和0.5ml金属离子缓冲液；其中，所述金属离子缓冲液配制方法是：fecl2·
4h2o 0.3g，mncl2·
4h2o 0.02g，h3bo
3 0.0124 g，cucl2·
2h2o 0.0034g，cocl2·
6h2o 0.038g，zncl
2 0.014g和na2moo4·
2h2o 0.04g，溶于1l0.1 m的盐酸溶液中；无机盐固体培养基的配方为：在液体msm培养基中加入1.5％的琼脂粉制成的。
17.本发明还提供了一种多环芳烃降解菌株的应用于降解多种多环芳烃菲、芴或蒽。
18.进一步地，该菌株的底物为菲、芴或蒽，菲、芴或蒽作为唯一碳氮源生长。
19.进一步地，底物的降解情况使用高效液相色谱(hplc)检测；检测的色谱条件为使用c18分析柱，流动相为超纯水：色谱级甲醇，超纯水：色谱级甲醇的比例为20：80；流速为0.5ml/分钟，柱温30℃；检测波长为254nm。
20.进一步地，使用高效液相色谱(hplc)检测底物的降解情况。
21.进一步地，降解多种多环芳烃菲、芴或蒽的产物的检测方法为：使用乙酸乙酯萃取降解多种多环芳烃菲、芴或蒽的产物，得到萃取有机相，将萃取有机相浓缩后，进行硅烷化
衍生，得到衍生产物，将衍生产物进行gc-ms检测；通过休止细胞反应，检测到菲的降解产物1-羟基-2-萘甲酸、2
’‑
羧基苯丙酮酸、邻苯二甲酸、原儿茶酸(衍生化)，其降解菲的途径是邻苯二甲酸降解途径；芴的产物包括在9-芴醇、 9-芴酮、4-羟基-9-芴酮，邻苯二甲酸，其降解途径涉及到两条途径的代谢产物，其中包括邻苯二甲酸途径；蒽的产物包括蒽-9,10-二氢二醇，蒽-9,10-二醇，9,10-蒽醌。
22.进一步地，通过基因组测序完成diaphorobacter polyhydroxybutyrativoransmns-0全基因组测序，分析挖掘提供该菌株在降解过程中的关键基因。
23.进一步地，菌株的筛选方法：取山东滨州污水处理厂的污水加入无机盐培养基(以下简称msm培养基)，加入10mg菲置于摇床进行培养，5天后转接至新的msm培养基，重复转接三次，将最后一次的培养液进行平板涂布，涂布于基础肉汤(以下简称lb培养基)固体培养基。将平板上长出的菌落进行复筛，复筛长出的菌落进行划线分离，得到能以菲为唯一碳源生长的菌株，16s rrna鉴定后并于ncbi中进行blast比对构建系统发育树。
24.进一步地，离心收集在含菲的msm中生长的菌体，用无菌pbs缓冲液重悬菌体，随后离心收集菌体，重复洗菌两次，将重悬的菌液分别接种在10mg蒽、 dbf和dbt为底物的msm培养基中，重复转接三次；菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气；菌株能够以菲作为唯一碳氮源生长。
25.进一步地，优化菌株生长的最适条件和检测菲的降解情况：
26.(1)菌株生长的最适温度：将菌株接种至50ml的含有5mg菲的msm 培养基，分别置于25℃、30℃、33℃、37℃的摇床培养，每隔一定时间用分光光度计测量od600。
27.(2)菌株生长的最适底物添加量：将菌株分别接种至50ml的msm培养基，菲的添加量分别是5，10，15，20，25mg，置于最适温度25℃、200rpm 摇床培养，每隔一定时间用分光光度计测量od600。
28.进一步地，得到菌株mns-0最适生长温度为30℃，最适底物添加量为菲20 mg。
29.进一步地，在最佳生长条件下，用高效液相色谱(hplc)检测菲的降解情况。 hplc为agilent technologies 1200仪器，配备eclipse xdb-c18(5μm，4.6
ꢀ×
150mm)分析柱。
30.进一步地，鉴定该菌株在降解菲、蒽、芴过程中的中间代谢物，并推测其代谢途径。
31.进一步地，活化菌株后，将菌液转接至新鲜lb培养基过夜培养，在4℃下离心收集菌体，用pbs缓冲液重悬，然后离心收集菌体，重复清洗2次，重悬菌体饥饿3h，随后pbs缓冲液稀释休止细胞的od＝5.0，在10ml的磨口瓶中分别添加1mg菲或1mg芴和蒽进行休止细胞反应。在不同时间进行取样，加入等体积的乙酸乙酯萃取，将有机相浓缩后将有机相浓缩后取200μl进行gc-ms检测。取100μl样品进行硅烷化衍生，之后进行gc-ms检测。
32.进一步地，气相色谱-质谱(gcms)为agilent 6850/5975c。
33.在本发明的较佳实施方式1中，详细说明 diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0的筛选、分离和鉴定过程；
34.在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明不同培养条件下 diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0的生长条件优化及其降解菲的降解能力；
35.在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明菌株 diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0降解菲、芴、蒽的中间代谢物分析过程。
36.本发明的有益效果在于：
37.(1)本发明提供了一株筛选到的新菌株 diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0，它能够利用菲作为唯一碳源生长，可以降解多种pahs，实现更好的生物修复环境效果；该菌株既能降解多种多环芳烃菲、也能降解芴或蒽。
38.(2)本发明通过展开对这四种化合物矿化过程中中间代谢产物的研究，揭示 mns-0对菲、蒽、芴的降解途径和矿化机理。
39.(3)本发明利用微生物diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0 对多种多环芳烃进行生物催化，催化剂成本低、操作简便、反应条件温和，节省能源。
40.(4)本发明通过对mns-0的基因组分析，挖掘其降解相关的基因资源，为多环芳烃和杂环芳烃的生物修复提供理论指导。
41.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
42.图1是本发明的一个较佳实施例1的菌株16s rrna序列分析比对后构建的系统发育树；
43.图2是本发明的一个较佳实施例2的菌株在不温浓度下无机盐液体培养基中的生长情况；
44.图3是本发明的一个较佳实施例2的菌株在不同浓度下无机盐液体培养基中的生长情况；
45.图4是本发明的一个较佳实施例2的菌株在不同浓度下无机盐液体培养基中对菲的降解情况；
46.图5是本发明的一个较佳实施例3的菌株降解菲代谢途径推测与中间代谢物分析示意图；
47.图6是本发明的一个较佳实施例3的菌株降解蒽代谢途径推测与中间代谢物分析示意图；
48.图7是本发明的一个较佳实施例3的菌株降解芴代谢途径推测与中间代谢物分析示意图。
具体实施方式
49.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
50.实施例1diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0的筛选、分离和鉴定
51.1.1采取样品
52.污水样品来源：山东滨化污水处理厂。
53.1.2菌株的筛选和分离
54.将采集到的水样均匀混合，将5g混合物加入向250ml装有50ml msm培养基的锥形瓶中，加入20mg菲。将锥形瓶置于30℃，200rpm的摇床培养5天。按 5％接种量转接至50ml新
鲜msm培养基，加入20mg菲，每隔5天进行转接，重复三次，将最后一次的培养液稀释并涂布在无机盐固体培养基上，倒置的平板盖上放50 mg菲，30℃下培养直至长出单菌落。挑取单菌落到新鲜的无机盐液体培养基中，选取生长最快的菌株进行划线分离，重复多次直到获得纯化的单菌。为了摸索单菌的底物谱，将挑取的单菌落在含菲的msm中生长，离心收集菌体，用无菌pbs缓冲液重悬洗菌，随后再次离心，重复洗菌两次，重悬的菌液分别接种在2.5mg芴、蒽的msm 培养基中进行培养，其能在芴、蒽培养下产生降解，但未见生长。
55.上述msm液体培养基的配方(1l)是：k2hpo4·
3h2o 6.8g，kh2po
4 3.7g， mgso
4 0.1g，na2so
4 1.0g和0.5ml金属离子缓冲液；其中，金属离子缓冲液(1l) 配方是：fecl2·
4h2o 0.3g，mncl2·
4h2o 0.02g，h3bo
3 0.0124g，cucl2· 2h2o 0.0034g，cocl2·
6h2o 0.038g，zncl
2 0.014g和na2moo4·
2h2o 0.04 g，溶于0.1m的盐酸溶液中。固体培养基是在液体培养基中加入1.5％的琼脂粉制成的。
56.1.3菌株的鉴定
57.菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气，能够以菲作为唯一碳氮源生长。用16s rrna 通用引物(27f 5
’‑
agagtttgatcctggctca-3’及1492r 5
’ꢀ‑
agagtttgatcctggctca-3’)进行扩增并测序，将扩增结果送至公司进行测序。使用ncbi数据库中的核苷酸blast(blastn) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在blast中检索菌株的16s rrna序列使用mega7的邻接(nj)方法建立的系统发育树。如图1菌株16s rrna序列分析比对后构建的系统发育树所示，菌株和diaphorobacter菌属亲缘关系最近。结合以上的生理生化的菌学特征和进化树分析，将其鉴定为 diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0。
58.实施例2不同培养条件下diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0的生长条件优化及其降解菲的降解能力
59.2.1、菌株生长的最适温度：将菌株分别接种至50ml的含有5mg菲的msm 培养基，分别置于25℃、30℃、33℃、37℃的摇床培养，每隔一定时间用分光光度计测量od600。如图2菌株在不同温度下无机盐液体培养基中的生长情况中所示，最适合菌株生长的培养温度为30℃。
60.2.2、菌株生长的最适底物添加量：将菌株分别接种至50ml的msm培养基，菲的添加浓度分别是0、100、200、300、400和500mg/l,置于最适温度30℃、200rpm 摇床培养，每隔一定时间用分光光度计测量od600。如图3菌株在不同浓度下无机盐液体培养基中的生长情况，最适底物添加量为50ml的msm培养基中加入菲20 mg。
61.2.3、高效液相色谱hplc检测菲在最佳生长条件下的含量
62.将培养液用等体积乙酸乙酯萃取，将萃取液用高效液相色谱hplc检测，检测条件是agilent technologies 1200仪器，配备eclipse xdb-c18(5μm，4.6
×
150mm) 分析柱，流动相a：超i水，流动相b：色谱级甲醇，比例为20：80；流速为0.5ml/ 分钟，柱温30℃；检测波长为254nm(菲)。配制不同浓度梯度的菲标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将样品中测得的峰面积由标准曲线换算得出底物含量。如图4菌株在不同浓度下无机盐液体培养基中对菲的降解情况中所示。
63.实施例3菌株diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans mns-0降解菲、芴、蒽的中间代谢物分析
64.3.1、样品制备：活化菌株后，将菌液转接至新鲜lb培养基过夜培养，在4℃下离心
收集菌体，用pbs缓冲液重悬，然后离心收集菌体，重复清洗2次，重悬菌体饥饿3h，随后pbs缓冲液稀释休止细胞的od＝5.0，分别添加1mg菲、蒽、芴进行休止细胞反应。在不同时间进行取样，加入等体积的乙酸乙酯萃取，用分液漏斗震荡萃取，使用旋转蒸发仪浓缩，取200μl有机相，进行gc-ms检测。取100μl进行硅烷化衍生，之后进行gc-ms检测。
65.3.2、gc-ms检测：检测条件为气相色谱(agilent 6850/5975c)，检测器温度为 250℃，氦气流量为1ml/分钟，升温过程为：初始温度50℃，保持2分钟；以15℃ /分钟的速率从50℃升温至250℃，保持10分钟。
66.3.3、检测结果：如图5菌株降解菲代谢途径推测与中间代谢物分析示意图所示，通过gc-ms，检测到菲的产物1-羟基-2-萘甲酸、2
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羧基苯丙酮酸、邻苯二甲酸、原儿茶酸(衍生化)，证明其代谢途径为邻苯二甲酸降解途径；如图6菌株降解蒽代谢途径推测与中间代谢物分析示意图所示，通过gc-ms，检测到蒽的产物包括在蒽-9,10-二氢二醇，蒽-9,10-二醇，9,10-蒽醌，在最后9,10-蒽醌有产物累积，与生长体系中不能生长现象相同；如图7菌株降解芴代谢途径推测与中间代谢物分析示意图所示，通过gc-ms，检测到芴的产物包括在9-芴醇，9-芴酮，4-羟基-9-芴酮，还检测到邻苯二甲酸，涉及到两条途径的代谢产物，因此对mns-0降解芴的代谢途径仍需要进一步研究。
67.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。