一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物饲料添加剂及制备技术领域，具体为一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用。


背景技术：

2.益生菌，是一类通过调节动物肠道内微生物平衡，促进动物胃肠道内正常菌群生长繁殖，并且抑制病原致病菌群生长繁殖，从而提高动物生长性能的活菌制剂，同时益生菌替代抗菌素做为兽药和饲料添加剂受到广泛重视和应用。丁酸梭菌可以改善宿主肠道细菌生态系统的平衡，并且有效的分解豆渣中的抗营养因子，使发酵百香果皮及米粉废水中营养物质更加均衡。
3.丁酸梭菌，即丁酸梭状芽孢杆菌，是存在于人和畜禽肠道的一种厌氧益生菌，可以改善宿主肠道细菌生态系统的平衡，被作为微生态制剂广泛应用于医药领域和饲料行业当中。由日本千叶医科大学宫入近治博士于1933年最先发现报导，不但可以抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌等致病菌的生长，还可以促进肠道中有益菌如乳酸菌的生长。以前的研究已经表明，丁酸梭菌的急性口服毒性试验和ames试验是安全的，并且由于其形成孢子的能力，能够抵抗胃肠道酸性环境。研究发现，丁酸梭菌具备良好的胃肠道黏附性，可以通过空间占位抑制鳗弧菌等致病菌，并且同时产生各种有益生物，以增强宿主的免疫功能。在使用过程中丁酸梭菌主要存在于的活菌制剂的状态。
4.米粉和百香果每年会产生大量的米粉废水及百香果皮。据不完全统计，我国每年米粉的生产量较大，但其生产过程中的米粉废水的利用率却极低，大部分米粉废水和百香果果皮被当做废弃物直接排出、扔掉，造成环境污染和资源浪费。目前的报道中米粉废水和百香果皮尚未出现将两者混合一起用丁酸梭菌进行发酵生产饲用益生菌剂的先例。将二者共同发酵处理，能提高处理效率，改善处理效果，降低成本，进一步实现资源化利用的需求，具有广阔的市场前景，为此我们提出了新型的饲用益生菌剂方法。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用，解决了生产过程中的米粉废水的利用率却极低，大部分米粉废水和百香果果皮被当做废弃物直接排出、扔掉，造成环境污染和资源浪费的问题。
7.(二)技术方案
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用，所述丁酸梭菌，保藏号cgmcc no.22880，保藏于北京微生物菌种保藏中心。
9.优选的，所述菌株在发酵过程中种子液的接种量2％～10％(v/v)接入发酵培养基中，温度25℃～42℃，发酵20h～60h。
10.优选的，所述丁酸梭菌的冷冻干燥益生菌剂的菌落数在108～109cfu/g。
11.优选的，所述包括如下步骤，
12.(1)菌株平板、液体培养
13.丁酸梭菌rcm固体培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，氯化钠5g，葡萄糖4g，无水乙酸钠3g，可溶性淀粉1g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，ph 7.2
±
0.1，121℃灭菌20分钟；
14.丁酸梭菌rcm液体培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，氯化钠5g，葡萄糖4g，无水乙酸钠3g，可溶性淀粉1g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，加蒸馏水至1000ml，ph 7.2
±
0.1，121℃灭菌20分钟；
15.所述丁酸梭菌，首先用固体培养基进行平板培养，接着用液体培养基进行摇瓶培养，接着按照6％(v/v)接种量接入液体培养基作为一级种子液，然后按照6％(v/v)接种量接入液体培养基作为二级种子液；
16.(2)发酵培养基：可溶性淀粉5～10g/l，玉米粉20～30g/l，百香果皮10～20g/l，硫酸锰0.01～0.1g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，酵母粉10～20g/l，磷酸氢二钾0.1～1g/l，feso4 1～2g/l米粉废水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌20分钟。
17.(3)丁酸梭菌发酵工艺
18.将步骤(1)种子液培养后的丁酸梭菌采用比浊法调整浓度，然后按照接种量2％～10％(v/v)接入步骤(2)中制备的发酵培养基中，温度25℃～42℃，发酵24h～60h；
19.(4)对发酵产物进行分离，上清为有机酸混合液，沉淀为菌体，在菌体中添加保护剂后进行冷冻干燥，即得饲料添加剂成品。
20.优选的，所述步骤(3)中发酵培养基中有百香果皮和米粉废水成分，实现废弃资源的再利用，减少废弃材料对环境的污染，大大降低生产成本。
21.本发明提供了一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用，具备以下有益效果：
22.1、该用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用，发酵菌株的创新，选择丁酸梭菌为饲用益生菌剂，适应多种条件，具有调整动物肠道微生物平衡、提高动物饲料转化率并同时有效的提高机体免疫力等作用。
23.2、该用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用，发酵培养基的创新，利用百香果皮和米粉废水成分进行发酵培养，大大降低生产成本，变废为宝，提高生产的综合效益，解决了生产过程中的米粉废水的利用率却极低，大部分米粉废水和百香果果皮被当做废弃物直接排出、扔掉，造成环境污染和资源浪费的问题。
具体实施方式
24.实施例1：
25.本实施例对丁酸梭菌的接种比例进行了考察，分别将丁酸梭菌的种子液不同的接种量比例的接入发酵培养基，进行发酵实验，接种比例分别为2％、4％、6％、8％、10％，测定菌剂的菌落数，结果见表1。
26.表1不同菌种比例对丁酸梭菌菌剂中活菌数的影响
[0027][0028]
实施例2：
[0029]
本发明对一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用进行了考察，将复合微生态益生菌剂按6％(v/v)的接种量接入发酵培养基，发酵温度为25℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃，测定总菌落数，cfu/g、总酸(乳酸计)，％，结果见表2。因此，最佳发酵温度为35℃。
[0030]
表2不同发酵温度对发酵产物各理化指标的影响
[0031]
[0032][0033]
实施例3：
[0034]
本发明对一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用进行了考察，对以下三种培养基进行比较：(1)培养基a：可溶性淀粉5～10g/l，玉米粉20～30g/l，百香果皮10～20g/l，硫酸锰0.01～0.1g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，酵母粉10～20g/l，磷酸氢二钾0.1～1g/l，feso4 1～2g/l，米粉废水替代水作为液体补充；(2)培养基b：可溶性淀粉5～10g/l，玉米粉20～30g/l，硫酸锰0.01～0.1g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，酵母粉10～20g/l，磷酸氢二钾0.1～1g/l，米粉废水替代水作为液体补充；(3)培养基c：可溶性淀粉5～10g/l，玉米粉20～30g/l，硫酸锰0.01～0.1g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，酵母粉10～20g/l，磷酸氢二钾0.1～1g/l，feso4 1～2g/l，水作为液体补充；测定发酵产物的总菌落数，cfu/g、总酸(乳酸计)，％，结果见表3。加入适量的百香果皮和米粉废水，一定程度上能够降低了生产成本，提高了生产的综合效益。
[0035]
表3不同发酵培养基对发酵产物各理化指标的影响
[0036][0037]
实施例4：
[0038]
本发明对一种用于饲用添加剂的丁酸梭菌及其应用进行了考察。将丁酸梭菌的种子液以6％的接种量接入发酵培养基，在37℃下培养48h。对发酵产物进行分离，添加保护剂冷冻干燥，即得饲料添加剂成品。将所制得饲料添加剂以0.02％(w/w)的比例添加到饲料中作为试验组，同时以未添加本发明饲料添加剂作为空白对照组，进行试验。仔猪自由采食，饲喂50天，饲喂结果如表4。
[0039]
表4本发明益生菌剂饲料添加剂对断奶仔猪的影响
[0040]
[0041][0042]
由表4可以看出：和空白对照组相比，在饲料中添加本发明丁酸梭菌益生菌剂饲料添加剂的试验组断奶仔猪日增重提高37.84％，料肉比降低9.375％，腹泻率降低50％，成活率提高4.255％。
[0043]
总菌落数的测定
[0044]
参考国标gb 4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定。
[0045]
总酸(乳酸计)的测定
[0046]
参考国标gb/t 12456食品中总酸的测定。
[0047]
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。