一种改良的静脉内衬支架大鼠原位肝移植模型建立方法与流程

1.本发明属于动物模型制作领域，具体涉及一种改良的veno-lined 支架大鼠原位肝移植模型建立方法。


背景技术：

2.大鼠原位肝移植是研究肝脏免疫排斥反应、免疫耐受、缺血-再灌注损伤极为重要的动物模型；大鼠原位肝移植方法与人类临床肝移植方法相类似，但是由于手术复杂、死亡率高，并没有得到推广；从首例大鼠肝移植建模成功至今，大鼠原位肝移植术一直再被不断的研究，其也在不断改进和优化；尤其是袖套技术的应用，更是使得大鼠原位肝移植术手术难度降低，成功率上升；
3.目前在大鼠原位肝移植术比较常用的两种方法是“二袖套”和“三袖套”法；在不考虑肝动脉重建的情况下，两种移植术式最大的区别在于肝上下腔静脉(suprahepatic vena cava，shvc)的吻合方式：“二袖套”法的shvc缝合技术和“三袖套”法的shvc袖套吻合技术，两者各有优缺点；shvc缝合技术能较好地还原血管生理结构，但存在缝合技术难度大、无肝期较长等问题；而shvc袖套吻合技术能有效缩短无肝期，但存在shvc袖套制作困难，术后并发症多(shvc损伤、扭折和肝损伤等)等问题。本领域研究人员发明的静脉内衬 (veno-lined)支架技术能巧妙地避开shvc缝合和shvc袖套制作等复杂的手术步骤，极大地降低了移植手术的难度，但此技术仍然存在手术操作繁琐、无肝期长等问题。近年来，新兴科技磁环吻合技术的应用能够使受体手术无肝期控制在10分钟以内，这是传统移植技术不可企及的。本着降低手术难度、缩短无肝期、减少术后并发症的思想，我们将对传统移植技术中的veno-lined支架技术做进一步优化和改进，让其无肝期同样能控制在10分钟以内，以此能更好地应用于肝移植领域的研究。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提出了一种改良的veno-lined 支架大鼠原位肝移植模型建立方法，可明显缩短无肝期，降低凝血风险，降低手术难度；
5.为了达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：一种改良的veno-lined支架大鼠原位肝移植模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.s1：供受体术前适应性喂养一周，自由饮水、进食；术前禁食 12h，禁水8h；
7.s2：供体经腹腔注射麻醉，全身肝素化后游离供肝，缝扎右肾上腺静脉和腰静脉，钝性游离ihvc(肝下下腔静脉)至左左髂静脉水平；并结扎此段静脉的分支小静脉；将腹主动脉与ihvc分离，利用静脉头皮针于腹主动脉近心端扎入，推注20ml灌注液；沿肋骨边缘的膈肌上迅速打开胸腔，夹闭胸主动脉；剪断胸段shvc(肝上下腔静脉)让灌注液流出，随后可见肝脏由鲜红色逐渐变为土黄色；胆管处理采用“splint”技术；
8.s3：将肝固有动脉从pv(门静脉)上分离剔除；8-0线结扎幽门静脉后剪断；于脾静脉与门静脉主干分叉处作开口用于制作pv袖套； 8-0线结扎右肾静脉后剪断；于左肾静脉
与腔静脉主干分叉处作开口用于制作ihvc袖套；
9.s4：取下左肾静脉至左髂静脉水平段的静脉，置于4℃保存液中；在膈肌上，距离shvc0.5cm处环形剪开膈肌，切忌损伤shvc；剪断肝脏背部韧带、多余粘连组织和胃食管静脉丛，取下供肝后置于 4℃保存液中；
10.s5：将左肾静脉至左髂静脉水平段的静脉放入shvc支架管腔内，血管两端均外翻后使用5-0丝线与支架打结固定，形成一个内壁完全由静脉腔包绕，且无异物的血管支架，将1/2长度的血管支架于供肝膈肌之上的shvc开口处插入shvc腔内，于膈肌之下使用5-0丝线打结固定支架，随后剪去肝脏上剩余的膈肌；
11.s6：受体吸入麻醉后，切开腹部，垫高颈部，自制拉钩充分暴露肝脏，游离肝脏，结扎胃食管静脉丛，缝扎右肾上腺静脉，结扎胆总管，剪断近肝侧胆管，暴露pv；分离肝固有动脉和pv，充分游离肝脏背部韧带，停止乙醚吸入，换低流量吸氧；
12.s7：夹闭ihvc，pv，shvc，靠肝脏侧剪断pv、ihvc；贴近肝脏根部切除肝脏左外侧叶即可充分暴露支架插入口；
13.s8：将连有供肝的veno-lined支架从此口插入到达膈肌环下 2mm，使用5-0丝线在靠近支架管口的位置打结固定支架，随后剪下受体剩余的肝叶；
14.s9：将受体pv套管结扎固定，从ihvc套管口处冲洗下腔静脉排尽内部空气，开放shvc和pv血管夹，结束无肝期；将受体ihvc套管结扎固定；温生理盐水反复冲洗肝脏和腹腔，使受体复温，吸尽体液；
15.s10：“splint”技术吻合胆管后将肠系膜覆盖于胆管上；腹腔滴入2ml甲硝唑，逐层关腹，移植完毕；术后前3天独笼喂养；
16.优选的，所述游离供肝为剪断肝镰状韧带、肝左三角韧带、肝后韧带、肝胃韧带；
17.优选的，所述s5中血管在支架内外翻后两端的打结位置尽量靠近支架内侧；血管支架插入供肝膈肌的之上的shvc腔内，于膈肌之下固定支架的打结位置靠近血管支架的管口；整个s5的操作均在4℃环境中完成；
18.优选的，所述供受体选用雄性wistar大鼠，体重280-330g；
19.优选的，所述s2和s10中胆道支撑管由硬膜外麻醉导管制成， veno-lined支架、ihvc和pv套管均选用硬质薄壁的聚乙烯管；
20.优选的，所述胆道支撑管内径为0.5mm，长度约为0.5cm，左右两端削成60
°
的梯形斜面；veno-lined支架的外径为0.35cm，内径为0.29cm，长度为0.6cm；ihvc套管的外径为0.3cm，内径为0.24cm，长度为0.2cm，pv套管的外径为0.23cm，内径为0.17cm，长度为 0.2cm。
21.本发明的有益效果是：veno-lined支架技术作为一种全新的大鼠olt技术，它充分利用供体剩余的下腔静脉来制作血管支架进而吻合shvc，巧妙地避开了缝合shvc和制作shvc袖套等较为复杂的手术步骤，大大降低了吻合shvc的手术难度；此外，在手术成功率方面，veno-lined支架技术要优于shvc缝合技术和shvc袖套吻合技术，并且长期存活率能和shvc缝合技术相媲美；改良的veno-lined 支架技术大大缩短了手术时长，并能够将无肝期控制在7min以内，最短可至5min。
附图说明
22.图1为改良veno-lined支架技术的关键步骤；其中a：veno-lined 支架制作；b：veno-lined支架预先固定于供肝上；c：切除肝脏左外侧叶即可充分暴露支架插入口；d：带有供肝的veno-lined支架从受体肝脏左外侧叶根部的切口处插入；
23.图2为veno-lined支架形成shvc血栓的吻合方式(a)以及正确的吻合方式(b)。
具体实施方式
24.为了说明本发明的方案及效果，下面通过具体实施例进行详细说明。
25.实施例1
26.本发明改良的veno-lined支架大鼠原位肝移植模型建立方法，包括以下步骤：
27.s1：供受体术前适应性喂养一周，自由饮水、进食；术前禁食 12h，禁水8h；
28.s2：供体经腹腔注射麻醉，全身肝素化后游离供肝，缝扎右肾上腺静脉和腰静脉，钝性游离ihvc(肝下下腔静脉)至左左髂静脉水平；并结扎此段静脉的分支小静脉；将腹主动脉与ihvc分离，利用静脉头皮针于腹主动脉近心端扎入，推注20ml灌注液；沿肋骨边缘的膈肌上迅速打开胸腔，夹闭胸主动脉；剪断胸段shvc(肝上下腔静脉)让灌注液流出，随后可见肝脏由鲜红色逐渐变为土黄色；胆管处理采用“splint”技术；
29.s3：将肝固有动脉从pv(门静脉)上分离剔除；8-0线结扎幽门静脉后剪断；于脾静脉与门静脉主干分叉处作开口用于制作pv袖套； 8-0线结扎右肾静脉后剪断；于左肾静脉与腔静脉主干分叉处作开口用于制作ihvc袖套；
30.s4：取下左肾静脉至左髂静脉水平段的静脉，置于4℃保存液中；在膈肌上，距离shvc0.5cm处环形剪开膈肌，切忌损伤shvc；剪断肝脏背部韧带、多余粘连组织和胃食管静脉丛，取下供肝后置于 4℃保存液中；
31.s5：将左肾静脉至左髂静脉水平段的静脉放入shvc支架管腔内，血管两端均外翻后使用5-0丝线与支架打结固定，形成一个内壁完全由静脉腔包绕，且无异物的血管支架(见图1a)，将1/2长度的血管支架于供肝膈肌之上的shvc开口处插入shvc腔内，于膈肌之下使用5-0丝线打结固定支架，随后剪去肝脏上剩余的膈肌(见图1b)；
32.s6：受体吸入麻醉后，切开腹部，垫高颈部，自制拉钩充分暴露肝脏，游离肝脏，结扎胃食管静脉丛，缝扎右肾上腺静脉，结扎胆总管，剪断近肝侧胆管，暴露pv；分离肝固有动脉和pv，充分游离肝脏背部韧带，停止乙醚吸入，换低流量吸氧；
33.s7：夹闭ihvc，pv，shvc，靠肝脏侧剪断pv、ihvc；贴近肝脏根部切除肝脏左外侧叶即可充分暴露支架插入口(见图1c)；
34.s8：将连有供肝的veno-lined支架从此口插入到达膈肌环下 2mm，使用5-0丝线在靠近支架管口的位置打结固定支架，随后剪下受体剩余的肝叶(见图1d)；
35.s9：将受体pv套管结扎固定，从ihvc套管口处冲洗下腔静脉排尽内部空气，开放shvc和pv血管夹，结束无肝期；将受体ihvc套管结扎固定；温生理盐水反复冲洗肝脏和腹腔，使受体复温，吸尽体液；
36.s10：“splint”技术吻合胆管后将肠系膜覆盖于胆管上；腹腔滴入2ml甲硝唑，逐层关腹，移植完毕；术后前3天独笼喂养；
37.优选的，所述游离供肝为剪断肝镰状韧带、肝左三角韧带、肝后韧带、肝胃韧带；
38.优选的，所述s5中血管在支架内外翻后两端的打结位置尽量靠近支架内侧；血管支架插入供肝膈肌的之上的shvc腔内，于膈肌之下固定支架的打结位置靠近血管支架的管口；整个s5的操作均在4℃环境中完成；
39.优选的，所述供受体选用雄性wistar大鼠，体重280-330g；
40.优选的，所述s2和s10中胆道支撑管由硬膜外麻醉导管制成， veno-lined支架、ihvc和pv套管均选用硬质薄壁的聚乙烯管；
41.优选的，所述胆道支撑管内径为0.5mm，长度约为0.5cm，左右两端削成60
°
的梯形斜面；veno-lined支架的外径为0.35cm，内径为0.29cm，长度为0.6cm；ihvc套管的外径为0.3cm，内径为0.24cm，长度为0.2cm，pv套管的外径为0.23cm，内径为0.17cm，长度为 0.2cm。
42.实施例2
43.为了比较不同shvc吻合方式术后大鼠的生命体征情况，进行以下实验观察；
44.实验分组：将实验分为三组，分别是：改良的veno-lined支架技术组、shvc缝合技术组、shvc袖套吻合技术组，每组30对大鼠；
45.数据统计：应用spss 22.0统计软件进行统计分析，数据以均数
±
标准差表示，采用one-way anova方法进行统计学分析，组间两两比较采用dunnett-t检验进行统计学分析，p＜0.05为差异有统计学意义；
46.观察项目及结果：
47.1)手术时长
48.统计了三种shvc吻合方式的手术时长，并统计进表1；
49.表1不同术式的手术时长(min)
[0050][0051][0052]
注：shvc(肝上下腔静脉)；与改良的veno-lined支架技术组进行dunnett-t 检验，*p＜0.05。
[0053]
2)术后情况
[0054]
我们将供肝恢复血流后有胆汁排出、关腹时无活动性出血、术后 15min内大鼠能自行翻身爬行作为手术成功的标准；针对不同shvc 的吻合方式，我们对其术后存活情况、shvc有关的术后并发症(见表2)进行了统计；
[0055]
表2不同术式术后情况
[0056][0057]
3)改良veno-lined支架技术术后并发症分析：在应用改良 veno-lined支架技术的大鼠olt中，有3例大鼠例死因均为shvc内血栓形成，进一步研究发现血栓形成的原因为：在制作veno-lined支架时，两端打结固定线过于靠向支架外侧，导致打结固定线和支架外壁暴露于血液中形成血栓(见图2a)；在存活到30d的25只大鼠中，我们通过吸入过量乙醚处死大鼠后进行解剖探查，未发现shvc有出血、扭折、血栓形成、支架脱落以及肝损伤等并发症。
[0058]
4)不同olt术式的练习曲线：我们统计了早期前50例不同olt 术式的练习曲线；以每10例为一个练习周期分析术后1周存活率，相较于其它术式，改良的veno-lined支架技术能在较短练习周期内将术后1周存活率提升至100％。