靶向PIK3CA突变的T细胞受体及其用途的制作方法

靶向pik3ca突变的t细胞受体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月20日提交的美国临时专利申请号：62/864,148的优先权，其内容通过引用以其整体并入，并且要求其优先权。
3.序列表
4.本说明书引用序列表(于2020年6月19日以命名为“0727341093sl.txt”的.txt文件的电子方式提交)。所述.txt文件生成于2020年6月18日，大小为37,623字节。序列表的全部内容在此通过引用并入。
技术领域
5.本公开主题提供用于治疗癌症(例如，乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、结肠癌、多形性胶质母细胞瘤)的方法和组合物。它涉及特异性靶向包含突变的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α(pik3ca)的t细胞受体(tcr)。本发明公开的主题还提供包含此类tcr的免疫应答细胞，以及使用此类tcr和此类细胞治疗任何人pik3ca突变的癌症的方法，包括但不限于乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肛门癌、膀胱癌、结直肠癌，头颈部鳞状细胞癌、非黑色素瘤皮肤癌和唾液腺癌。


背景技术：

6.细胞免疫疗法是一种具有治疗癌症潜力的疗法。t细胞和其他免疫细胞可以通过引入编码对所选抗原特异性的tcr的遗传物质修饰以靶向肿瘤抗原。使用特异性tcr的靶向t细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面近期取得临床成功。
7.三分之一的乳腺癌患者携带pik3ca突变，其中pik3ca中热点突变的位置在所有乳腺癌亚型之中相似。此外，pik3ca仅有有限数量的在乳腺癌患者之中保守的热点突变。这些特性使pik3ca的靶向特异性突变成为靶向和消除乳腺癌细胞的一种有希望的策略。因此，需要新的治疗策略来识别和生成靶向包含突变的pik3ca的tcr，以及能够以最小毒性和免疫原性诱导有效的癌症根除的策略。


技术实现要素：

8.本发明公开的主题大体上提供一种特异性靶向pik3ca肽的t细胞受体(tcr)，其中所述pik3ca肽包含突变。在某些实施方式中，所述突变为h1047l。在某些实施方式中，所述pik3ca肽为8-mer、9-mer或10-mer。在某些实施方式中，所述pik3ca肽为9-mer。在某些实施方式中，所述pik3ca肽包含seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:51或seq id no:52中所示氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，所述pik3ca肽包含seq id no:11中所示氨基酸序列或由其组成。
9.在某些实施方式中，所述pik3ca肽与hlaⅰ类复合物相关。在某些实施方式中，所述hlaⅰ类复合物选自hla-a、hla-b和hla-c。在某些实施方式中，所述hlaⅰ类复合物为hla-a。
在某些实施方式中，所述hla-a为hla-a*03超家族。在某些实施方式中，所述hla-a*03超家族选自hla-a*03、hla-a*11、hla-a*31、hla-a*33、hla-a*66、hla-a*68和hla-a*74。在某些实施方式中，所述hla-a*03超家族为hla-a*03。
10.在某些实施方式中，所述tcr包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域与pik3ca肽结合。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:3中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3，和包含seq id no:6中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3；b)包含seq id no:27中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3，和包含seq id no:30中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3；c)包含seq id no:37中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3，和包含seq id no:40中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。
11.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:2中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和包含seq id no:5中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2；b)包含seq id no:26中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和包含seq id no:29中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2；或c)包含seq id no:36中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和包含seq id no:39中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2。
12.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:1中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，和包含seq id no:4中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1；b)包含seq id no:25中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，和包含seq id no:28中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1；或c)包含seq id no:35中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，和包含seq id no:38中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1。
13.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；和包含seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；b)包含seq id no:25中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:26中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；和包含seq id no:27中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；或c)包含seq id no:35中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:36中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；和包含seq id no:37中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3。
14.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：包含seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；和包含seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3。
15.在某些实施方式中，胞外结构域包含：a)包含seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；b)包含seq id no:28中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:29中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:30中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；c)包含seq id no:38中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:39中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:40中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
16.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；b)包含seq id no:25中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:26中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:27中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:28中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:29中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:30中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；或c)包含seq id no:35中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:36中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:37中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:38中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:39中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:40中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
17.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：包含seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
18.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:7、seq id no:31或seq id no:41中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列。
19.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含α链可变区，其包含seq id no:7、seq id no:31或seq id no:41中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含α链可变区，其包含seq id no:7中所示氨基酸序列。
20.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:8、seq id no:32或seq id no:42中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列。
21.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:8、seq id no:32或seq id no:42中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:8中所示氨基酸序列。
22.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含与seq id no:7中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和包含与seq id no:8中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区；b)包含与seq id no:31中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和包含与seq id no:32中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区；或c)包含与seq id no:41中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和包含与seq id no:42中所示氨基酸序列具有至少约80％同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区。
23.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:7中所示氨基酸序列的α链可变区；和包含seq id no:8中所示氨基酸序列的β链可变区；b)包含seq id no:31中
所示氨基酸序列的α链可变区；和包含seq id no:32中所示氨基酸序列的β链可变区；或c)包含seq id no:41中所示氨基酸序列的α链可变区；和包含seq id no:42中所示氨基酸序列的β链可变区。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含含有seq id no:7中所示氨基酸序列的α链可变区；和含有seq id no:8中所示氨基酸序列的β链可变区。
24.在某些实施方式中，所述胞外结构域包含：a)包含seq id no:9中所示氨基酸序列的α链；和包含seq id no:10中所示氨基酸序列的β链；b)包含seq id no:33中所示氨基酸序列的α链；和包含seq id no:34中所示氨基酸序列的β链；或c)包含seq id no:43中所示氨基酸序列的α链；和包含seq id no:44中所示氨基酸序列的β链。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含含有seq id no:9中所示氨基酸序列的α链；和含有seq id no:10中所示氨基酸序列的β链。
25.在某些实施方式中，所述胞外结构域与参考tcr或其功能片段结合人突变型pik3ca肽上的相同表位，其中所述参考tcr或其功能片段包含：a)包含seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；b)包含seq id no:25中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:26中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:27中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:28中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:29中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:30中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3；或c)包含seq id no:35中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1；包含seq id no:36中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2；包含seq id no:37中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3；包含seq id no:38中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1；包含seq id no:39中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2；和包含seq id no:40中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
26.在某些实施方式中，所述tcr从载体上重组表达或表达。在某些实施方式中，所述tcr不靶向野生型pik3ca肽。
27.在某些实施方式中，所述tcr包含修饰的α链恒定区和/或修饰的的β链恒定区。在某些实施方式中，修饰的α链恒定区包含与seq id no:20或seq id no:21中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的α链恒定区包含seq id no:20中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的β链恒定区包含与seq id no:22、seq id no:23或seq id no:45中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的β链恒定区包含seq id no:22中所示氨基酸序列。
28.本公开主题还提供包含本文公开的tcr的免疫应答细胞。在某些实施方式中，用所述tcr转导免疫应答细胞。在某些实施方式中，所述tcr在免疫应答细胞的表面上组成性表达。在某些实施方式中，所述免疫应答细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、人胚胎干细胞、
淋巴前体细胞、t细胞前体细胞和可从中分化淋巴细胞的多能干细胞。在某些实施方式中，所述免疫应答细胞是t细胞。在某些实施方式中，所述t细胞选自细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞和中央记忆性t细胞。
29.本公开主题还提供包含本文公开的免疫应答细胞的组合物。在某些实施方式中，所述组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
30.本公开主题还提供包含本文公开的分离的核酸分子的载体。在某些实施方式中，所述载体为γ-逆转录病毒载体。
31.本公开主题还提供编码本文公开的t细胞受体(tcr)的核酸分子。本发明公开的主题还提供一种用于产生结合人突变型pik3ca肽的免疫应答细胞的方法，包括将编码本文公开的tcr的核酸分子或包含所述核酸分子的载体引入免疫应答细胞。
32.本公开主题还提供包含本文公开的核酸分子的宿主细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是t细胞。
33.本公开主题还提供治疗和/或预防受试者中包含pik3ca突变的肿瘤的方法。本发明公开的主题还提供本文公开的所述免疫应答细胞或组合物在用于治疗和/或预防受试者中包含pik3ca突变的肿瘤中的用途。在某些实施方式中，所述pik3ca突变包含h1047l或由其组成。在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫应答细胞或组合物。在某些实施方式中，所述肿瘤选自乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肛门癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈鳞状细胞癌、非黑色素瘤皮肤癌和唾液腺癌。在某些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌。在某些实施方式中，所述方法减少或根除受试者中的肿瘤负荷。在某些实施方式中，所述受试者是人。
34.本公开主题还提供用于治疗和/或预防肿瘤的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包含本文公开的免疫应答细胞、本文公开的核酸分子或本文公开的载体。在某些实施方式中，所述试剂盒还包括使用免疫应答细胞、核酸分子或载体来治疗患有肿瘤的受试者的书面说明。
附图说明
35.以下通过实施例给出(但并非旨在将本发明限制于所描述的特定实施方式)的详细描述可结合附图理解。
36.图1描绘通过质谱法得出突变型pik3ca最小表位序列的示意图。cos-7是一种猴源性细胞系，其1)缺乏人hla分子，且2)可以电穿孔。cos-7细胞与编码hla-a*03:01和突变的pik3ca的rna共电穿孔。包括具有hla-a*03:01的野生型(wt)pik3ca和具有不相关的hla，hla-a*69:01的突变的pik3ca在内作为试验对照。使用pan抗mhcⅰ类抗体，将所有ⅰ类肽-mhc复合物从转染的cos-7细胞表面酸洗脱。然后通过lc/ms/ms得出洗脱肽的序列和大小。
37.图2描绘通过质谱法分析最小表位序列。上面板描绘轮廓线分析，显示用突变型pik3ca和hla-a*03:01的组合电穿孔的转染子组中的富集信号。两个对照组均未检测到信号。下面板描绘在突变的pik3ca hla-a*03:01组中检测到的富集信号的肽碎片图谱的结果。根据碎片模式，肽序列被确定为“alhggwttk”[seq id no:11]。野生型肽由ahhggwttk[seq id no:46]中所示序列组成。
[0038]
图3描绘设计用于确定hla-a*03:01和野生型(wt)或突变的pik3ca最小肽之间相
互作用的相对稳定性的差示扫描荧光的结果。实验包括每组两次技术平行。该技术使用实时pcr技术监测热诱导的蛋白质变性。它测量一种染料的荧光信号的变化，这种染料优先结合在不稳定蛋白质展开时暴露的疏水性残基上。数据显示，突变肽与hla-a*03:01分子稳定结合，即使在超过54度的高温下也能保持这种结合。相比之下，野生型表位在hla-a*03:01上不太稳定，具有36度的低溶解温度。突变型肽由alhggwttk[seq id no:11]中所示序列组成。野生型肽由ahhggwttk[seq id no:46]中所示序列组成。
[0039]
图4描绘与突变的或野生型pik3ca肽复合的重组hla-a*03:01的晶体结构。右侧的x射线晶体结构描绘包含在hla-a*03:01的α螺旋结构域(绿色和蓝色)内的突变的肽序列(红色)的形貌。
[0040]
图5描绘hla-a3作为pik3ca突变特异性tcr 21lt2-2的限制性元件的鉴定。21lt2-2 tcr经逆转录病毒整合到非特异性健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与已用单个ⅰ类hla等位基因以及野生型或突变型的pik3ca共同电穿孔的猴源性抗原呈递细胞一起孵育。突变型在有1047位组氨酸到亮氨酸的替换(h1047l)。细胞已在cd8

tcr

表达上设门。炎症性细胞因子tnf-α产生中的变化被用于指示在正确hla等位基因的背景下突变特异性反应的存在。数据表明在hla-a*03:01的背景下，21lt2-2可以识别突变的h1047l。
[0041]
图6描绘pik3ca突变型特异性tcr，21lt2-2，识别内源性加工的抗原和最小肽。21lt2-2 tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后的第4-6天，t细胞与已用编码hla-a*03:01的rna和(左)野生型或突变的pik3ca rna电穿孔的或(右)用野生型或突变的pik3ca最小9aa肽(lμg/ml)脉冲的猴源性抗原呈递细胞一起孵育。细胞已在cd8

tcr

表达上设门。在hla-a*03:01的背景下，在cd107a和tnfα生产方面的变化被用于指示突变特异性反应的存在。数据表明，21lt2-2可以识别内源性加工和呈递的突变抗原(左)，以及被动脉冲的突变的最小肽(右)。
[0042]
图7描绘pik3ca突变型特异性tcr(21lt2-2)与辅助受体无关。21lt2-2 tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与已用编码hla-a*03:01的rna和(左)野生型或突变的pik3ca rna电穿孔的，或(右)用最小9aa肽(lμg/ml)脉冲的猴源性抗原呈递细胞一起孵育。细胞已在cd4

tcr

表达上设门。在hla-a*03:01的背景下，cd107a和tnfα生产方面的变化被用于指示突变特异性反应的存在。数据表明21lt2-2在cd4

t细胞主干内也能发挥功能，并且不需要cd8辅助受体的存在来识别突变的h1047l。
[0043]
图8描述丙氨酸替换，表明除p4之外的所有位置对pmhc:tcr相互作用均十分关键。21lt2-2 tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与已被编码hla-a*03:01的rna电穿孔，并用丙氨酸替换肽(10μg/ml)脉冲的猴源性抗原呈递细胞一起孵育。细胞已在cd8

tcr

表达上设门。与未修饰的9个氨基酸的突变序列(表；p2中的突变)相比，当用丙氨酸替换肽脉冲时，识别率损失》50％，指示该位置的天然氨基酸对tcr识别的重要性。此处显示的数据证明，除位置4处的甘氨酸残基外，9个氨基酸序列中的所有氨基酸似乎均对pmhc-tcr相互作用十分关键。肽序列从左到右分别为seq id no:11-19。
[0044]
图9描绘21lt2-2的潜在交叉反应的人蛋白质组的搜索结果。
[0045]
图10描绘识别受hla-a*03:01限制的突变的pik3ca的额外的独特t细胞受体的鉴定。
[0046]
图11描绘多个独特的t细胞受体，它们可以识别受hla-a*03:01限制的突变的pik3ca。细胞设门在cd8

tcr

细胞上。
[0047]
图12描绘突变的pik3ca特异性t细胞受体的辅助受体依赖性。细胞设门在cd4

tcr

细胞上。
[0048]
图13显示pik3ca-新抗体特异性受体具有细胞溶解能力。细胞设门在cd8

tcr

细胞上。
[0049]
图14a-14c描绘显示不同tcr-hla/肽相互作用图谱的丙氨酸替换肽。图14a所示为p2-p5；图14b所示为p6-p9；图14c所示为天然野生型pik3ca肽和突变的pik3ca p1肽。p1肽由seq id no:11(alhggwttk)中所示氨基酸序列组成。p2肽由seq id no:12(aahggwttk)中所示氨基酸序列组成。p3肽由seq id no:13(alaggwttk)中所示氨基酸序列组成。p4肽由seq id no:14(alhagwttk)中所示氨基酸序列组成。p5肽由seq id no:15(alhgawttk)中所示氨基酸序列组成。p6肽由seq id no:16(alhggattk)中所示氨基酸序列组成。p7肽由seq id no:17(alhggwatk)中所示氨基酸序列组成。p8肽由seq id no:18(alhggwtak)中所示氨基酸序列组成。p9肽由seq id no:19(alhggwtta)中所示氨基酸序列组成。wt pik3ca肽由seq id no:46(ahhggwttk)中所示氨基酸序列组成。
[0050]
图15描绘被指定来建立用于tcr识别和确定交叉反应性的关键残基的基序。虚线指示最大反应性的50％。基于此，用于确定潜在交叉反应性的基序指示在右侧，“x”表示tcr识别的非关键残基。默认情况下，位置1被指定为“x”，因为该位置的天然氨基酸是丙氨酸，因此不适用于本试验。xlhxgwttk为seq id no:48；xxxxgwttk为seq id no:49，以及xlhggwttk为seq id no:50。
[0051]
图16a和16b描绘对人蛋白质组进行潜在交叉反应的搜索结果。图16显示未检测到tcr 21lt2-2和1022t8的交叉反应表位。检测到tcr 0606t1-2的单个潜在交叉反应表位(ivfmgwttk)。图16b显示，潜在交叉反应表位脉冲的hla*a03:01 靶细胞未触发0606t1-2。突变的pik3ca肽用作对照。alhggwttk为seq id no:11。ivfmgwttk为seq id no:47。
[0052]
图17描绘pik3ca-突变型特异性tcr可以识别突变肽的替代长度。突变型pik3ca特异性tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与hla-a*03:01 抗原呈递细胞一起孵育，并用8-mer和10-mer突变的pik3ca肽池(1μg/ml)脉冲。以野生型和9-mer肽作为对照。细胞已在cd8

tcr

表达上设门。tnfα生产过程中的突变型肽特异性上调指示对替代肽长度的识别。野生型9-mer由seq id no:46(ahhggwttk)中所示氨基酸序列组成。突变体9-mer由alhggwttk(seq id no:11)中所示氨基酸序列组成。突变型池包括由lhggwttk(seq id no:51)中所示氨基酸序列组成的8-mer肽和由dalhgggwttk(seq id no:52)中所示氨基酸序列组成的10-mer肽。
具体实施方式
[0053]
本公开主题提供靶向包含突变(例如，突变包含h1047l或由其组成)的pik3ca(例如，人pik3ca)的tcr。
[0054]
本公开主题还提供包含靶向pik3ca的tcr的免疫应答细胞(例如，t细胞(例如，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、中央记忆t细胞等)、自然杀伤(nk)细胞、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞、t细胞前体细胞、和可从中分化出淋巴细胞的多能干细胞)，以及使用该免
疫应答细胞治疗肿瘤(例如乳腺癌)的方法。
[0055]ⅰ.定义
[0056]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献提供本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人,dictionary of microbiology and molecular biology(2nd ed.1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walker ed.,1988)；the glossary of genetics,5th ed.,r.rieger等人(eds.),springer verlag(1991)；和hale&marham,the harper collins dictionary of biology(1991)。
[0057]
如本文所使用的，术语“大约”或“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“大约”可表示在3个或3个以上的标准偏差范围内。或者，“大约”可表示高达给定值的20％、优选高达10％、更优选高达5％、且更优选还要高达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，术语可以表示在一个数量级内，优选在一个值的5倍内，更优选在2倍内。
[0058]
如本文所用，术语“细胞群”指至少两个表达相似或不同表型的细胞组。在非限制性实例中，细胞群可包括至少约10、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000个表达相似或不同表型的细胞。
[0059]
如本文所用，术语“载体”指任何在与适当的控制元件相关联时能够复制并且能够将基因序列转移到细胞中的遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。
[0060]
如本文所用，术语“表达载体”指重组核酸序列，例如，一种重组dna分子，包含在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所需的期望编码序列和适当的核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操作子(可选)和核糖体结合位点，通常与其他序列一起。已知真核细胞利用启动子、增强子、终止子和多聚腺苷酸化信号。
[0061]
如本文所用，“cdr”被定义为tcr的互补决定区氨基酸序列，其是tcrα链和β链的高变区。通常，tcr包括α链可变区中的至少三个cdr和β链可变区中的至少三个cdr。cdr为tcr与抗原或表位的结合提供大部分接触残基。cdr区可以使用kabat系统(kabat,e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第五版,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242)、chothia编号系统(chothia等人,j mol biol.(1987)196:901-17)、abm编号系统(abhinandan等人,mol.immunol.2008,45,3832-3839)、或imgt编号系统(可访问http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/imgtigvlsuperfa mily.html，http://www.imgt.org/imgtindex/numbering.php)进行描绘。在某些实施方式中，使用imgt编号系统描绘cdr区。
[0062]
在本公开主题中有用的核酸分子包括编码多肽或其片段的任何核酸分子。在某些实施方式中，在本公开主题中有用的核酸分子包括编码tcr或其靶向结合部分的核酸分子。这种核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常会表现出基本同一性。与内源性序列具有“基本同源性”或“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)
或其部分之间配对以形成双链分子。(参见，例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methods enzymol.152:399；kimmel,a.r.(1987)methods enzymol.152:507)。
[0063]
术语“基本同源性”或“基本同一性”是指显示出与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何一条氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一条核酸序列)具有至少50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。例如，这种序列与用于比较的序列在氨基酸或核酸水平上具有至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或甚至约99％同源性或同一性。
[0064]
序列同源性或序列同一性通常使用序列分析软件来测量(例如，sequence analysis software package of the genetics computer group,university of wisconsin biotechnology center,1710university avenue,madison,wis.53705,blast,bestfit,gap,或pileup/prettybox程序)。这种软件通过为各种替换、删除和/或其他修分配同源度来匹配相同或相似的序列。在确定同一程度的示例性方法中，可以使用blast程序，概率分数在e-3
和e-100
之间表示密切相关的序列。
[0065]
如本文所用，术语“类似物”指具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关多肽或核酸分子。
[0066]
如本文所用，术语“配体”指与受体结合的分子。具体而言，配体结合另一细胞上的受体，允许细胞间识别和/或相互作用。
[0067]
如本文所用，术语“疾病”指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病情或病症。疾病的例子包括肿瘤或细胞的病原体感染。
[0068]“有效量”(或“治疗有效量”)是足以影响治疗后有益或预期临床结果的量。有效量可以一次或多次给药于受试者。就治疗而言，有效量是指足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病(如肿瘤)进展或以其他方式减少疾病的病理后果的量(如肿瘤)。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。在确定达到有效量的适当剂量时，通常会考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的疾病，病情的严重程度以及所给药的免疫应答细胞的形式和有效浓度。
[0069]
如本文所用，术语“肿瘤”是指以细胞或组织的病理性增殖及其随后向其他组织或器官迁移或侵袭为特征的疾病。肿瘤生长通常是不受控制和进行性的，并且在不会引起或导致正常细胞停止增殖的条件下发生。肿瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、结肠、骨、脑、乳房、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胸膜、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道，或其组织或其细胞类型。肿瘤包括癌症，如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
[0070]
如本文所用，术语“异源核酸分子或多肽”指通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cdna、dna或rna分子)或多肽。这种核酸可能来自另一种生物体，也可能是，例如，在细胞或样本中通常不表达的mrna分子。
[0071]
如本文所用，术语“免疫应答细胞”指在免疫应答中起作用的细胞或其祖细胞或其后代。
[0072]
如本文所用，术语“调节”指正或负的改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、或约100％的变化。
[0073]
如本文所用，术语“增加”指正改变至少约5％，包括但不限于正改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。
[0074]
如本文所用，术语“减少”指负改变至少约5％，包括但不限于负改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。
[0075]
如本文所用，术语“分离的细胞”指从自然伴随该细胞的分子和/或细胞成分中分离出的细胞。
[0076]
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”指物质在不同程度上不含通常在其天然状态下伴随其存在的成分。“分离”表示与原始来源或环境的分离程度。“纯化”表示比分离更高的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他物质，因此任何杂质都不会对蛋白质的生物特性产生实质上影响或造成其他不利后果。也就是说，本公开主题的核酸或多肽如果基本上不含细胞物质、病毒物质或通过重组dna技术生产时的培养基，或化学前体或化学合成时的其他化学品，那么它就是“纯化的”。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可产生不同的分离蛋白质，其可分别纯化。
[0077]
如本文所用，术语“分泌”指通过内质网、高尔基体的分泌途径从细胞释放的多肽，以及作为在细胞质膜上短暂融合的囊泡，在细胞外释放蛋白质。
[0078]
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异性靶向”指识别和结合目标生物分子(例如，多肽)但基本上不识别和结合样品(例如，生物样品)中的其他分子的多肽或其片段，其包含或表达人突变型pik3ca肽。
[0079]
如本文所用，术语“治疗”或“医治”指试图改变所治疗个体或细胞的病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中执行。治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可防止受影响或被确诊的受试者或怀疑患有该疾病的受试者因病症而恶化，但是，治疗也可以防止有患该疾病风险的受试者或怀疑患有该疾病的受试者出现该疾病或该疾病的症状。
[0080]
如本文所用，术语“受试者”指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等(例如，其将是特定治疗的接受者，或从其获取细胞)。
[0081]ⅱ.pik3ca
[0082]
磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α(pik3ca；gene id:5290；也称为mcm、cws5、mcap、pi3k、clove、mcmtc、pi3k-α和p110-α)是一种编码磷脂酰肌醇3激酶催化亚单位的基因，该亚单位利用atp磷酸化ptdins、ptdins4p和ptdins(4,5)p2。已经发现pik3ca具有致癌性，并且与乳腺癌和宫颈癌有关。
[0083]ⅲ.细胞受体(tcr)
[0084]
tcr是一种二硫键连接的异二聚体蛋白，由两条可变链组成，表达为具有不变cd3链分子的复合物的一部分。tcr存在于t细胞表面，负责识别抗原为与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合的肽。在某些实施方式中，tcr包括α链和β链(分别由tra和trb编码)。在某些实施方式中，tcr包括γ链和δ链(分别由trg和trd编码)。
[0085]
tcr的每条链都包含两个胞外结构域：可变区和恒定区。恒定区靠近细胞膜，其次
id no:12、seq id no:13或seq id no:14中所示氨基酸序列或由其组成。
[0093]
在某些实施方式中，所述tcr特异性靶向与hla
ꢀⅰ
类复合物相关的pik3ca肽，例如hla-a、hla-b和hla-c。在某些实施方式中，所述tcr特异性靶向与hla
ꢀⅱ
类复合物相关的pik3ca肽，例如hla-dp、hla-dm、hla-do、hla-dq和hla-dr。
[0094]
在某些实施方式中，所述tcr特异性靶向与hla-a*03超家族相关的pik3ca肽(例如，以hla-a*03超家族依赖的方式)。在某些实施方式中，hla*a03超家族成员包括但不限于hla-a*03、hla-a*11、hla-a*31、hla-a*33、hla-a*66、hla-a*68和hla-a*74中的等位基因和子等位基因。
[0095]
tcr克隆型
[0096]
在某些实施方式中，所述tcr包含含有seq id no:9中所示氨基酸序列的α链。在某些实施方式中，所述tcr包含含有seq id no:10中所示氨基酸序列的β链。在表1中披露seq id no:9和seq id no:10。
[0097]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:7中所示氨基酸序列的α链可变区。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:8中所示氨基酸序列的β链可变区。在表1中披露seq id no:7和8。
[0098]
在某些实施方式中，所述被指定为21lt2-2的tcr是人tcr，并特异性结合突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)。
[0099]
在某些实施方式中，所述tcr是人tcr，其包含含有seq id no:9中所示氨基酸序列的α链和/或含有seq id no:10中所示氨基酸序列的β链。
[0100]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包括选自表1的α链可变区和β链可变区或cdr。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:7中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:7中所示氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含seq id no:7中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:8中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:8中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:8中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有与seq id no:7中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和含有与seq id no:8中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:7中所示氨基酸序列的α链可变区和包含seq id no:8中所示氨基酸序列的β链可变区。
[0101]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:1中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，含有seq id no:2中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和含有seq id no:3中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3。seq id no:1-3在表1中披露。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1，含有seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2，和含有seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:4中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1，含有seq id no:5中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2，和含有seq id no:6中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在表1中披露seq id no:4-6。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1，含有seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2，和含有seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:1中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，含有seq id no:2中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和含有seq id no:3中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3，含有seq id no:4中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1，含有seq id no:5中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2，和含有seq id no:6中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:1中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1，含有seq id no:2中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2，含有seq id no:3中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3，含有seq id no:4中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1，含有seq id no:5中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2，和含有seq id no:6中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
[0102]
表1.(21lt2-2)
[0103][0104]
在某些实施方式中，包括表1在内的上述cdr区使用imgt编号系统(可访问http://
www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/imgtigvlsuperfa mily.html，http://www.imgt.org/imgtindex/numbering.php)。
[0105]
在某些实施方式中，所述tcr包含含有seq id no:33中所示氨基酸序列的α链。在某些实施方式中，所述tcr包含含有seq id no:34中所示氨基酸序列的β链。在表2中披露seq id no:33和seq id no:34。
[0106]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含seq id no:31中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:32中所示氨基酸序列。在表2中披露seq id no:31和seq id no:32。
[0107]
在某些实施方式中，所述tcr是人tcr，并特异性结合被指定为0606t1-2的突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)。
[0108]
在某些实施方式中，所述tcr是人tcr，其包含含有seq id no:33中所示氨基酸序列的α链和/或含有seq id no:34中所示氨基酸序列的β链。
[0109]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包括选自表2的α链可变区和β链可变区或cdr。在某些实施方式中，tcr的胞外结构域包含α链可变区，该α链可变区包含与seq id no:31中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:31中所示氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:31中所示氨基酸序列的α链可变区。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:32中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:32中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:32中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有与seq id no:31中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和含有与seq id no:32中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:31中所示氨基酸序列的α链可变区和含有seq id no:32中所示氨基酸序列的β链可变区。
[0110]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:25中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，含有seq id no:26中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和含有seq id no:27中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3。在表2中披露seq id no:25-27。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:25中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1，含有seq id no:26中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2，和含有seq id no:27中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:28中所示氨基酸序列或其保守修饰的β
id no:42中所示氨基酸序列。在表3中披露seq id no:41和42。
[0116]
在某些实施方式中，所述tcr是人tcr，并特异性结合到被指定为1022t8的突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)。
[0117]
在某些实施方式中，所述tcr是人tcr，其包含含有seq id no:43中所示氨基酸序列的α链和/或含有seq id no:44中所示氨基酸序列的β链。
[0118]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区和β链可变区或选自表3的cdr。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:41中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含与seq id no:41中所示氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含α链可变区，其包含seq id no:41中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:42中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含与seq id no:42中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含β链可变区，其包含seq id no:42中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有与seq id no:41中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的α链可变区，和含有与seq id no:42中所示氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列的β链可变区。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:41中所示氨基酸序列的α链可变区和含有seq id no:42中所示氨基酸序列的β链可变区。
[0119]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含：包含seq id no:35中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，包含seq id no:36中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，和包含seq id no:37中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3。seq id no:35-37在表3中披露。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含：包含seq id no:35中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1，包含seq id no:36中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2，和包含seq id no:37中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含：包含seq id no:38中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1，包含seq id no:39中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2，和包含seq id no:40中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。seq id no:38-40在表3中披露。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:38中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1，含有seq id no:39中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2，和含有seq id no:40中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含：包含seq id no:35中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1，包含seq id no:36中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2，包含seq id no:37中所示氨
基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3，包含seq id no:38中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1，包含seq id no:39中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2，和包含seq id no:40中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含：包含seq id no:35中所示氨基酸序列的α链可变区cdr1，包含seq id no:36中所示氨基酸序列的α链可变区cdr2，包含seq id no:37中所示氨基酸序列的α链可变区cdr3，包含seq id no:38中所示氨基酸序列的β链可变区cdr1，包含seq id no:39中所示氨基酸序列的β链可变区cdr2，和包含seq id no:40中所示氨基酸序列的β链可变区cdr3。
[0120]
表3.(1022t8)
[0121][0122]
在某些实施方式中，包括表3在内的上述cdr区使用imgt编号系统(可访问http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/imgtigvlsuperfamily.html,http://www.imgt.org/imgtindex/numbering.php)。
[0123]
如本文所用，术语“保守序列修饰”指不显著影响或改变本发明公开的包含氨基酸序列的tcr的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸替换、添加和删除。可以根据氨基酸的物理化学性质(如电荷和极性)将其分类成不同的组。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基替换为同组氨基酸。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，带中性电荷的氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同组的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能分析试验测试经改变的tcr的保留功能(即，上文(c)至(1)中所示功能)。在某些实
施方式中，指定序列或cdr区内的不多于一个、不多于两个、不多于三个、不多于四个、不多于五个残基被改变。
[0124]
在某些实施方式中，α链可变区和/或β链可变区氨基酸序列与指定序列(例如，seq id no:7、8、31、32、41和42)具有至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％(例如，约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同源性或同一性，其包含的修饰包括但不限于相对于指定序列的替换(例如，保守替换)、插入或删除，但保留与突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)结合的能力。在某些实施方式中，此类修饰不在可变区的cdr结构域内。
[0125]
在某些实施方式中，所述胞外结构域特异性结合突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)而不是相应的野生型肽序列。
[0126]
在某些实施方式中，在seq id no:7、seq id no:8、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:41或seq id no:42中替换、插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方式中，替换、插入或删除发生在所述胞外结构域的cdr之外的区域中。在某些实施方式中，所述胞外结构域包含α链可变区和/或选自seq id no:7、8、31、32、41和42(包括那些序列(seq id no:7、seq id no:8、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:41或seq id no:42)的翻译后修饰)的β链可变区序列。
[0127]
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数(即％同源性＝#相同位置/#总
×
100)，考虑到间隙的数量和每个间隙的长度，需要引入间隙以实现两个序列的最佳对齐。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
[0128]
两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))的算法确定，该算法已被纳入align程序(版本2.0)，使用pam120重量残基表，空位长度罚值为12，空位罚值为4。此外，可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已被纳入gcg软件包(可访问www.gcg.com)中的gap程序，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12，10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0129]
另外或可选地，本公开主题的氨基酸序列还可以用作“查询序列(query sequence)”，以对公共数据库执行搜索，以例如识别相关序列。可以使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-10的xblast程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用xblast程序执行blast protein搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所公开的指定序列具有同源性的氨基酸序列。为获得空位联配(gapped alignments)以用于比较，，可以使用如altschul等人(1997)nucleic acid res.25(17):3389-3402中所描述的gapped blast。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用相应程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
[0130]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域与参考tcr结合到突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)上的相同表位。例如，本公开的tcr的胞外结构域结合到突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)与参考tcr或其功能片段相同的表位上，其包含例如，任何一种本公开的tcr的α链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列和β链可变区cdr1、cdr2和cdr3序
列。在某些实施方式中，本公开的tcr的胞外结构域结合到突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)与参考tcr或其功能片段相同的表位上，其包含例如任何一种本公开的tcr的α链可变区和β链可变区序列。
[0131]
在本领域众所周知，独立于cdr1和/或cdr2结构域的cdr3结构域可单独确定tcr或其功能片段对同源抗原的结合特异性，并且基于共同的cdr3序列，可预测生成具有相同结合特异性的多种tcr。
[0132]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:3中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3；和含有seq id no:6中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含：包含seq id no:2中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2；和包含seq id no:5中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含：包含seq id no:1中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1；和包含seq id no:4中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1。
[0133]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:27中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3；和含有seq id no:30中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含含有seq id no:26中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2；和含有seq id no:29中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含含有seq id no:25中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1；和含有seq id no:28中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1。
[0134]
在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域包含含有seq id no:37中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr3；和含有seq id no:40中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr3。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含含有seq id no:36中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr2；和含有seq id no:39中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr2。在某些实施方式中，所述tcr的胞外结构域还包含含有seq id no:35中所示氨基酸序列或其保守修饰的α链可变区cdr1；和含有seq id no:38中所示氨基酸序列或其保守修饰的β链可变区cdr1。
[0135]
在某些实施方式中，所述本公开主题的tcr还包含用于在人细胞中表达核酸序列的诱导型启动子。用于表达tcr基因的启动子可以是组成型启动子，例如泛素c(ubic)启动子。
[0136]
本公开主题还提供编码本文所述靶向突变型pik3ca的tcr或其功能部分的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子编码本公开的tcr的α链和β链。在某些实施方式中，所述α链和β链由自裂解肽(例如2a肽)分开。在某些实施方式中，所述α链和β链由furin-2a-肽分开。在某些实施方式中，所述肽包含seq id no:24中所示氨基酸序列。
[0137][0138]
在某些实施方式中，所述核酸分子编码本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的功能部分/片段。如本文所用，术语“功能部分”或“功能片段”是指本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的任何保留该靶向突变型pik3ca的tcr(母体tcr)的生物活性的部分、部件或片段。例如，功能部分包括保留与母体tcr的程度相似、相同，甚至更高的识别靶细胞的能力以治疗
疾病(例如，乳腺癌)的本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的部分、部件或片段。在某些实施方式中，编码本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的功能部分的核酸分子编码包含例如约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多的母体tcr的蛋白质。
[0139]
具有cdr修饰的tcr
[0140]
在某些实施方式中，本发明公开的tcr(或其功能片段)包含含有cdr1、cdr2和cdr3序列的α链可变区和含有cdr1、cdr2和cdr3序列的β链可变区，其中，这些cdr序列中的一个或多个包含基于本文所述tcr(或其功能片段)指定氨基酸序列(见表1-3)或其修饰，其中tcr(或其功能片段)保留本公开主题的突变型pik3ca肽特异性tcr(或其功能片段)的所需功能特性。
[0141]
在某些实施方式中，本公开的tcr(或其功能片段)包含α链恒定区和β链恒定区，其中至少一个恒定区包含基于本文所述tcr(或其功能片段)的指定氨基酸序列(见表1-3)或其修饰，其中所述tcr(或其功能片段)保留本公开主题的突变型pik3ca肽特异性tcr(或其功能片段)的所需功能特性。
[0142]
在某些实施方式中，此类修饰不会显著影响或改变含有氨基酸序列的tcr的结合特性。此类修饰的非限制性示例包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点突变和pcr介导的突变，将修饰引入本公开的tcr或其功能片段。
[0143]
所述修饰可以是保守修饰、非保守修饰或保守修饰和非保守修饰的混合。如上所述，保守氨基酸替换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的替换。本领域已定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。表4显示示例性保守氨基酸替换。在某些实施方式中，可将氨基酸替换引入目标tcr中，并筛选具有所需活性(例如，保留的/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc)的产物。
[0144]
表4
[0145]
原始残基示例性保守氨基酸替换ala(a)val；leu；ilearg(r)lys；gln；asnasn(n)gln；his；asp，lys；argasp(d)glu；asncys(c)ser；alagln(q)asn；gluglu(e)asp；glngly(g)alahis(h)asn；gln；lys；argile(i)leu；val；met；ala；pheleu(l)ile；val；met；ala；phelys(k)arg；gln；asnmet(m)leu；phe；ilephe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrpro(p)ala
ser(s)thrthr(t)val；sertrp(w)tyr；phetyr(y)trp；phe；thr；serval(v)ile；leu；met；phe；ala
[0146]
氨基酸可根据共同的侧链特性进行分组：
[0147]
·
疏水性：去甲亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0148]
·
中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gin；
[0149]
·
酸性：asp、glu；
[0150]
·
碱性：his、lys、arg；
[0151]
·
影响链取向的残基：gly、pro；
[0152]
·
芳香族：trp、tyr、phe。
[0153]
在某些实施方式中，cdr区内的一个或多个氨基酸残基可被来自同组的其他氨基酸残基替换，并且可使用本文所述的功能分析试验测试经改变的tcr的保留功能。
[0154]
非保守替换涉及将其中一个类的成员替换为另一个类的成员。
[0155]
在某些实施方式中，指定序列或cdr区内的不多于一个、不多于两个、不多于三个、不多于四个、不多于五个残基被改变。
[0156]
在某些实施方式中，tcr恒定区内的一个或多个氨基酸残基可被修饰以增强该tcr的稳定性和/或细胞表面表达。在某些实施方式中，指定序列或恒定区内的不多于一个、不多于两个、不多于三个、不多于四个、不多于五个残基被改变。在某些实施方式中，所述修饰包括但不限于鼠化、半胱氨酸修饰和跨膜修饰(参见cohen等人,enhanced antitumor activity of murine-human hybrid t-cell receptor(tcr)in human lymphocytes is associated with improved pairing and tcr/cd3 stability,cancer res.2006；66(17):8878-8886；cohen等人,enhanced antitumor activity of t cells engineered to express t-cell receptors with a second disulfide bond,cancer res.2007；67(8):3898-3903；kuball等人,facilitating matched pairing and expression of tcr chains introduced into human t cells,blood 2007；109(6):2331-2338；haga-friedman等人,incorporation of transmembrane hydrophobic mutations in the tcr enhance its surface expression and t cell functional avidity,journal of immunology 2012；188(11):5538-5546，每个的内容以其整体并入本文)。
[0157]
在某些实施方式中，本文公开的tcr包含修饰的tcrα链恒定区，其包含具有与seq id no:20或seq id no:21中所示氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％，或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的tcrα链恒定区包含seq id no:20中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的tcrα链恒定区包含seq id no:21中所示氨基酸序列。
[0158]
在某些实施方式中，本文公开的tcr包含修饰的tcrβ链恒定区，其包含与seq id no:22、seq id no:23、seq id no:45中所示氨基酸序列具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的tcr β链恒定区包含seq id no:22中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的tcrβ链恒定区包含seq id no:23中所示氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的tcrβ链恒定区包含seq id no:45中所示氨基酸序列。
[0159]
人α链恒定区：
[0160][0161]
小鼠α链恒定区：(加下划线的跨膜区中的半胱氨酸修饰和lvl修饰)
[0162][0163]
人β链恒定区：
[0164][0165]
小鼠β链恒定区：(加下划线的半胱氨酸修饰)
[0166][0167]
人β链恒定区：
[0168][0169]
ⅴ
.免疫应答细胞
[0170]
本公开主题提供包含靶向突变型pik3ca肽的tcr(例如，本文公开的tcr)的细胞。将所述细胞施用于需要其治疗和/或预防肿瘤(例如乳腺癌)的人受试者。在某些实施方式中，所述细胞是免疫应答细胞。
[0171]
本发明公开的主题提供免疫应答细胞，其包含特异性结合到如上所述的突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)的tcr。
[0172]
免疫应答细胞可以用本公开的tcr转导，从而使细胞表达tcr。本发明公开的主题还提供使用此类细胞治疗瘤(例如乳腺癌)的方法。
[0173]
本公开主题的免疫应答细胞可以是淋巴系细胞。包含b细胞、t细胞和自然杀伤(nk)细胞的淋巴系提供tcr的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来剂的检测、宿主中外来细胞的检测等。淋巴系免疫应答细胞的非限制性示例包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、胚胎干细胞、和多能干细胞(例如，可从中分化出淋巴细胞的细胞)。t细胞可以是胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。t细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的t细胞可以是任何类型的t细胞，包括但不限于辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆性t细胞(包括中枢记忆性t细胞、干细胞样记忆性t细胞(或干样记忆性t细胞)和两种类型的效应器记忆性t细胞：例如，t
em
细胞和t
emra
细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤t细胞、粘膜相
关恒定t细胞和γδt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤性t细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞亚群。在某些实施方式中，表达tcr的t细胞表达foxp3以实现和维持t调节性表型。
[0174]
自然杀伤(nk)细胞可以是淋巴细胞，是细胞介导免疫的一部分，在先天免疫反应中发挥作用。nk细胞无需事先激活，即可对靶细胞产生细胞毒性作用。
[0175]
本公开主题的免疫应答细胞可表达特异性结合突变型pik3ca肽(例如人突变型pik3ca肽)的tcr，用于治疗癌症(例如，乳腺癌)。此类免疫应答细胞可被施用于需要其用于治疗癌症(例如乳腺癌)的受试者(例如，人受试者)。在某些实施方式中，所述免疫应答细胞是t细胞。所述t细胞可以是cd4

t细胞或cd8

t细胞。在某些实施方式中，所述t细胞是cd4

t细胞。在某些实施方式中，所述t细胞是cd8

t细胞。
[0176]
本发明公开的免疫应答细胞还可包括至少一种重组或外源性共刺激配体。例如，可进一步用至少一个共刺激配体转导本公开的免疫应答细胞，使得该免疫应答细胞共表达或被诱导共表达所述靶向pik3ca的tcr和至少一种共刺激配体。靶向pik3ca的tcr与至少一种共刺激配体之间的相互作用提供对免疫应答细胞(例如t细胞)的完全激活非常重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员和免疫球蛋白(ig)超家族配体。tnf是一种参与全身炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用是调节免疫细胞。tnf超家族成员有许多共同特征。大多数tnf超家族成员合成为包含短的胞质片段和相对较长的胞外区域的ⅱ型跨膜蛋白(胞外c端)。tnf超家族成员包括但不限于神经生长因子(ngf)、cd40l(cd40l)/cd154、cd137l/4-1bbl、tnf-α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配体(fasl)、cd30l/cd153、肿瘤坏死因子β(tnfβ)/淋巴毒素α(ltα)、淋巴毒素β(itβ)、cd257/b细胞激活因子(baff)/blys/thank/tall-1，糖皮质激素诱导的tnf受体配体(gitrl)和tnf相关的凋亡诱导配体(trail)，light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大类参与细胞识别、结合或粘附过程的细胞表面和可溶性蛋白质。这些蛋白质与免疫球蛋白具有相同的结构特征——它们拥有一个免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于，cd28的两种配体cd80和cd86，pd-1的配体pd-l1/(b7-h1)。在某些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14、pd-l1、及其组合。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含一个的重组共刺激配体，其为4-1bbl。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两个重组共刺激配体，其为4-1bbl和cd80。
[0177]
此外，本发明公开的免疫应答细胞可进一步包含至少一种外源性细胞因子。例如，本公开的免疫应答细胞可进一步用至少一种细胞因子转导，使得免疫应答细胞分泌至少一种细胞因子并表达靶向突变型pik3ca的tcr。在某些实施方案中，至少一种细胞因子选自il-2、il-3、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18和il-21。在某些实施方案中，细胞因子为il-12。
[0178]
突变型pik3ca肽特异性或靶向突变型pik3ca的可用于外周供体淋巴细胞的人淋巴细胞，例如，sadelain,m.等人,2003nat rev cancer3:35-45(披露经基因修饰表达tcr的外周供者淋巴细胞)、morgan,r.a.等人,2006science 314:126-129(披露经基因改造表达包含α和β异二聚体的全长肿瘤抗原识别t细胞受体复合物的外周供者淋巴细胞)、panelli,m.c.等人,2000j immunol 164:495-504；panelli,m.c.等人,2000j immunol 164:4382-4392(披露肿瘤活检中来源于肿瘤浸润淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物)、dupont,j.等
人,2005cancer res65:5417-5427；papanicolaou,g.a.等人,2003blood 102:2498-2505(披露使用人工抗原呈递细胞(aapc)或脉冲树突状细胞选择性体外扩增抗原特异性外周血白细胞)。免疫应答细胞(如t细胞)可以是自体的、非自体的(如同种异体的)，或从工程化祖细胞或干细胞中体外衍生的。
[0179]
ctl的未纯化的来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成人或其他造血细胞来源，例如胎肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可用于初步去除非ctl。
[0180]
大部分终末分化细胞最初可通过相对粗糙的分离来去除。例如，磁珠分离可用于初步去除大量无关细胞。优选地，在细胞分离之前，至少约80％，通常至少约70％的总造血细胞将被去除。
[0181]
分离程序包括但不限于密度梯度离心；重置；与改变细胞密度的颗粒偶联；用tcr包裹的磁珠进行磁分离；亲和层析；与mab结合或结合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及使用附着在固体基质(例如平板、芯片)上的tcr进行淘洗、淘析或任何其他方便的技术。
[0182]
用于分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术，其可具有不同程度的精密度，例如，多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
[0183]
通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(pi)，可以针对死细胞选择细胞。优选地，将细胞收集在包含2％胎牛血清(fcs)或0.2％牛血清白蛋白(bsa)的培养基或任何其他合适的、优选无菌等渗的培养基中。
[0184]ⅵ.载体
[0185]
免疫应答细胞(例如，t细胞、nk细胞)的基因修饰可通过用重组dna或rna构建体转导基本均质的细胞组合物来完成。所述载体可以是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒)，其用于将dna或rna构建体引入宿主细胞基因组。例如，编码靶向突变型pik3ca的tcr的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且可以由其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列或替代性内部启动子驱动表达。
[0186]
也可以使用非病毒载体或rna转录激活因子样效应物核酸酶。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如，使用核酸酶、(talen)、锌指核酸酶(zfn)和/或规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)或转基因表达(例如，使用天然或化学修饰的rna)。
[0187]
对于用以提供靶向突变型pik3ca的tcr表达细胞的细胞初始遗传修饰，通常使用逆转录病毒载体进行转导，但是也可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于对细胞进行随后的基因修饰以提供包含含有至少两个共刺激配体的抗原呈递复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样被证明有效。逆转录病毒载体和适当包装线的组合也适用，其中衣壳蛋白将对感染人细胞有作用。已知各种双嗜性病毒生产细胞系，包括但不限于pa12(miller等人,(1985)mol.cell.biol.5:431-437)；pa317(miller等人,(1986)mol.cell.biol.6:2895-2902)；和crip(danos等人,(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也适用，例如，具有vsvg、rd114或galv包络的假型颗粒以及本领域的任何其他已知颗粒。
[0188]
可能的转导方法进一步包括细胞与生产者细胞的直接共培养，例如通过bregni等人,(1992)blood 80:1418-1422的方法，或使用单独病毒上清液或含有或不含有适当生长
因子和聚阳离子的浓缩载体培养，例如通过xu等人,(1994)exp.hemat.22:223-230；和hughes等人,(1992)j.clin.invest.89:1817的方法。
[0189]
转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体和/或分泌细胞因子(例如，4-1bbl和/或il-12)。优选地，所选择的载体表现出高感染效率和稳定的整合与表达(参见，例如，cayouette等人,human gene therapy 8:423-430,1997；kido等人,current eye research15:833-844,1996；bloomer等人,journal of virology 71:6641-6649,1997；naldini等人,science 272:263 267,1996；和miyoshi等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319,1997)。可使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，比如爱泼斯坦-巴尔病毒(例如，另见miller,human gene therapy 15-14,1990；friedman,science 244:1275-1281,1989；eglitis等人,biotechniques 6:608-614,1988；tolstoshev等人,current opinion in biotechnology 1:55-61,1990；sharp,the lancet 337:1277-1278,1991；cornetta等人,nucleic acid research and molecular biology 36:311-322,1987；anderson,science 226:401-409,1984；moen,blood cells17:407-416,1991；miller等人,biotechnology 7:980-990,1989；le gal la salle等人,science 259:988-990,1993；和johnson,chest 107:77s-83s,1995)。逆转录病毒载体发展得特别好，并已在临床环境中使用(rosenberg等人,n.engl.j.med.323:370,1990；anderson等人,u.s.pat.no.5,399,346)。
[0190]
在某些非限制性实施方案中，表达本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的载体是逆转录病毒载体，例如肿瘤逆转录病毒载体。
[0191]
非病毒方法也可用于在细胞中表达蛋白质。例如，可以通过在脂质体转染(feigner等人,proc.nat’l.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等人,neuroscience letters 17:259,1990；brigham等人,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等人,methods in enzymology 101:512,1983)，无唾液酸血清类黏蛋白聚赖氨酸结合(wu等人,journal of biological chemistry 263:14621,1988；wu等人,journal of biological chemistry 264:16985,1989)，或在外科条件下通过微量注射(wolff等人，science 247:1465,1990)的情况下通过施用核酸将核酸分子引入细胞。其他非病毒基因转移方法包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可能有利于将dna递送入细胞。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸转移到体外可培养的细胞类型中(例如，自体或异种原代细胞或其后代)来实现，然后将细胞(或其后代)注射到靶组织或注射全身。还可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如，锌指核酸酶、巨核酸酶或tale核酸酶)衍生或获得重组受体。可通过rna电穿孔获得瞬时表达。
[0192]
用于多核苷酸治疗方法的cdna表达可由任何合适的启动子指导(例如，人巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)或金属硫蛋白启动子)，并由任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如，延伸因子lα增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要，已知在特定细胞类型中优先指导基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。所使用的增强子可包括但不限于表征为组织或细胞特异性增强子的增强子。或者，如果基因组克隆用作治疗的构建体，则可通过同源调控序列或(如果需要)通过源自异源的调控序列(包括上述任何启动子或调控元件)来介导调控。
[0193]
得到的细胞可以在与未修饰细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以进行扩增并用于多种目的。
[0194]ⅶ.基因组整合到免疫应答细胞中
[0195]
在某些实施方式中，本公开的tcr可整合到免疫应答细胞基因组的选定位点中。任何靶向基因组编辑方法都可用于将tcr整合到免疫应答细胞中基因组的选定基因座内。在某些实施方式中，所述tcr的表达由基因座内或其附近的内源性启动子/增强子驱动。在某些实施方式中，所述tcr的表达由整合到该基因座的外源性启动子驱动。整合tcr的基因座是根据基因座内基因的表达水平和基因座内基因表达的时间选择的。在细胞分化的不同阶段和分裂素/细胞因子微环境下，表达水平和时间可能不同，这是进行选择时需要考虑的因素之一。
[0196]
在某些实施方式中，crispr系统用于将tcr整合到免疫应答细胞基因组的选定基因座中。规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)系统是在原核细胞中发现的一种基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括cas9(一种能够利用crrna作为向导以修饰dna的蛋白质)、crispr rna(crrna，包含cas9用来引导其至宿主dna正确部分的rna以及与tracrrna结合的区域(通常为发夹环形式)，与cas9形成活性复合物)、反式激活crrna(tracrrna，与crrna结合并与cas9形成活性复合物)和dna修复模板的可选部分(引导细胞修复过程的dna，允许插入特定的dna序列)。crispr/cas9通常使用质粒转染靶细胞。crrna需要针对每项应用进行设计，因为这是cas9用来识别并直接结合细胞中目标dna的序列。携带tcr表达盒的修复模板也需要针对每项应用进行设计，因为它必须与切口两侧的序列重叠，并编码插入序列。多个crrna和tracrrna可以打包在一起形成一个单一的向导rna(sgrna)。这种sgrna可以与cas9基因结合在一起，制成质粒，以便转染到细胞中。使用crispr系统的方法在例如wo 2014093661 a2、wo 2015123339 a1和wo 2015089354 al中进行描述，其通过引用以其整体并入。
[0197]
在某些实施方案中，锌指核酸酶用于将tcr整合到免疫应答细胞基因组的选定基因座中。锌指核酸酶(zfn)是一种人工限制性内切酶，由锌指dna结合结构域和dna切割结构域结合产生。锌指结构域可以被设计成靶向特定的dna序列，从而使锌指核酸酶能够靶向基因组内所需的序列。单个zfn的dna结合结构域通常包含多个单独的锌指重复序列，并且每个锌指重复序列可以识别多个碱基对。生成新锌指结构域的最常用方法是结合已知特异性的较小锌指“模块”。zfn中最常见的裂解结构域是来自ⅱ型限制性内切酶fokⅰ的非特异性裂解结构域。利用内源性同源重组(hr)机制和携带tcr表达盒的同源dna模板，zfn可用于将tcr表达盒插入基因组。当目标序列被zfn切割时，hr机器搜索受损染色体和同源dna模板之间的同源性，然后在染色体的两个断裂端之间复制模板序列，从而将同源dna模板整合到基因组中。使用zfn系统的方法在例如wo 2009146179 al、wo 2008060510 a2和cn 102174576 a中进行描述，其通过引用以其整体并入。
[0198]
在某些实施方式中，talen系统用于将tcr整合到免疫应答细胞基因组的选定基因座中。转录激活因子样效应物核酸酶(talen)是一种限制性内切酶，其可以通过基因工程切割特定的dna序列。talen系统基于与zfn几乎相同的原理工作。它们是通过结合转录激活因子样效应物dna结合结构域和dna切割结构域生成的。转录激活因子样效应物(tale)由33-34个氨基酸重复基序组成，具有两个对特定核苷酸具有强烈识别能力的可变位置。通过组
装这些tale的阵列，tale dna结合结构域可以被工程为结合所需dna序列，从而引导核酸酶在基因组中的特定位置切割。例如，在wo 2014134412 al、wo 2013163628 a2和wo 2014040370 al中描述的使用talen系统的方法，其通过引用以其整体并入。
[0199]
递送基因组编辑剂的方法可以根据需要而有所不同。在某些实施方式中，所选基因组编辑方法的组件作为一个或多个质粒中的dna构建体递送。在某些实施方式中，所述组分由病毒载体递送。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、微量注射、基因枪、穿刺感染、静水压、持续输注、超声法、磁转染、腺相关病毒、病毒载体的假型包膜蛋白、复制型载体顺式和反式作用元件、单纯疱疹病毒、和化学载体(例如寡核苷酸、脂质体、聚合物囊泡、多聚物、树枝状分子、无机纳米颗粒和细胞穿透肽)。
[0200]
可以在所选基因座内的任何地方进行修饰，也可以在任何可能影响整合tcr的基因表达的地方进行。在某些实施方式中，将修饰引入整合tcr的转录起始位点的上游。在某些实施方式中，在整合tcr的转录起始位点和蛋白质编码区之间引入修饰)在某些实施方式中，在整合tcr的蛋白质编码区下游引入修饰。
[0201]
ⅷ
.多肽和类似物及多核苷酸
[0202]
在本公开主题中还包括特异性结合到突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)及其功能片段的tcr，以及以增强其在免疫应答细胞中表达时的抗肿瘤活性的方式修饰的编码其的多核苷酸。本公开主题提供通过在序列中产生改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这些改变可能包括某些突变、删除、插入或翻译后修饰。本公开主题进一步包括本公开主题的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、翻译后修饰或两者都有而不同于本公开主题的天然存在的多肽。本公开主题的类似物通常可表现出与本公开主题的全部或部分天然存在的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的同一性或同源性。序列比较的长度为至少约5、约10、约15、约20、约25、约50、约75、约100或更多个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，概率分数在e-3
和e-100
之间表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这些修饰可能发生在多肽合成或加工过程中，或在用分离的修饰酶处理后。类似物也可以通过一级序列的改变而不同于本公开主题的天然存在的多肽。这些包括遗传变体，包括自然的和诱导的(例如，通过辐照或暴露于乙甲基硫酸盐或通过如sambrook,fritsch和maniatis,molecular cloning:a laboratory manual(2d ed.),csh press,1989或ausubel等人,上文中所描述的位点特异性突变的随机突变产生)。还包括环化肽、分子和类似物，其含有l-氨基酸以外的残基，例如d-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸，例如β(beta)或γ(gamma)氨基酸。
[0203]
除全长多肽外，本公开主题还提供本公开主题的任何一种多肽或肽结构域的片段。片段可以是至少约5、约10、约13或约15个氨基酸。在一些实施例中，片段为至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸或至少约50个连续氨基酸。在一些实施例中，片段为至少约60至约80、约100、约200、约300或更多连续氨基酸。本公开主题的片段可通过本领域普通技术人员已知的方法产生，或可由正常蛋白质加工过程产生(例如，从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或通过选择性mrna剪接或选择性蛋白质加工事件去除氨基酸)。
[0204]
非蛋白质类似物具有设计的模拟本发明的蛋白质的功能活性的化学结构。根据本
公开主题的方法施用此类类似物。此类类似物可能超过原多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域中众所周知，并且可以根据这些方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，使得所得类似物在免疫应答细胞中表达时增加原多肽的抗瘤活性。这些化学修饰包括但不限于替换可替代的r基团和改变参考多肽的特定碳原子的饱和度。蛋白质类似物可相对抵抗体内降解，从而在施用后产生更长的治疗效果。用于测量功能活性的试验包括但不限于以下实施例中所述的试验。
[0205]
根据本公开主题，编码特异性结合突变型pik3ca肽(例如，人突变型pik3ca肽)的胞外结构域的多核苷酸可通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变自然存在的和重组的基因的序列，以在任何给定的表达系统中达到生产力的最高可能水平。涉及蛋白质表达不同阶段的因素包括密码子适应性、mrna结构和各种转录和翻译中的顺式元件。本领域技术人员已知的任何合适密码子优化方法或技术可用于修饰本公开主题的多核苷酸，包括但不限于optimumgene
tm
,encor优化和blue heron。
[0206]
ⅹ
.给药
[0207]
本发明公开的靶向pik3ca的tcr和包含其的免疫应答细胞可系统地或直接提供给用于治疗和/或预防肿瘤的受试者。在某些实施方式中，将本公开的靶向突变型pik3ca的tcr和包含其的免疫应答细胞直接注射到目标器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。可选地或额外地，本公开的靶向突变型pik3ca的tcr和包含其的免疫应答细胞例如通过施用于循环系统(例如，肿瘤脉管系统)而间接提供给目标器官。可在施用细胞和组合物之前、期间或之后提供扩增剂和分化剂，以增加体外或体内t细胞的产生。
[0208]
本公开主题的靶向突变型pik3ca的tcr和包含其的免疫应答细胞可在任何生理上可接受的载体内进行施用，通常是血管内施用，尽管它们也可被引入骨骼或其他方便的部位，在那里细胞可能找到一个合适的再生和分化部位(例如胸腺)。在某些实施方式中，可施用至少约1
×
105个细胞，最终达到约1
×
10
10
或更多。在某些实施方式中，可施用至少约1
×
106细胞。包含含有靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞的细胞群可包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(facs)，很容易地确定细胞群中免疫应答细胞的百分比。包含含有突变型pik3ca肽特异性tcr的转基因免疫应答细胞的细胞群的纯度范围可为从约50％至约55％、从约55％至约60％、从约65％至约70％、从约70％至约75％、从约75％至约80％、从约80％至约85％、从约85％至约90％、从约90％至大约95％、或者从约95％至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可通过注射、导管等引入免疫应答细胞。如果需要，还可以包括因子，包括但不限于白细胞介素，例如il-2、il-3、il-6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21，以及其他白细胞介素、集落刺激因子，例如g-、m-和gm-csf、干扰素，例如γ-干扰素。
[0209]
本公开的主题还提供包含本公开的免疫应答细胞的组合物，所述免疫应答细胞包含靶向突变型pik3ca的tcr。在某些实施方式中，所述组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。施用可以是自体或非自体。例如，包含靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞及包含其的组合物可从一名受试者中获得，并将其施用于同一受试者或不同的相容受试者。可通过局部注射(包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射或肠外给药)施用本公开主题的外周血衍生t细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生)。当施用本公开主题的药物组合物时(例如，包含含有靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞)，它可以单位剂
量注射形式(溶液、悬浮液、乳液)配制。
[0210]
ⅺ
.制剂
[0211]
本发明公开的免疫应答细胞包括本发明公开的靶向突变型pik3ca的tcr及其组合物，可方便地作为无菌液体制剂提供，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，可缓冲至选定的ph值。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、及其适当混合物的溶剂或分散介质。
[0212]
根据需要，可通过将本公开主题的组合物(例如，包含含有本公开的靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞)加入含有各种量的其他成分的所需量的适当溶剂来制备无菌可注射溶液。此类组合物可与适当的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物也可冻干。所述组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，具体取决于给药途径和所需制剂。可参考标准文本，如1985年第17版“remington’spharmaceutical science”，通过引用并入本文，以制备合适的制剂，无需过度实验。
[0213]
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)确保预防微生物活动。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开的主题，所使用的任何溶媒、稀释剂或添加剂必须与包含本公开主题的一般靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞相容。
[0214]
所述组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。可使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂(例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质)来实现本公开主题的组合物的所需等渗性。氯化钠尤其适用于含有钠离子的缓冲液。
[0215]
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定水平。可以使用甲基纤维素，因为它能够容易且经济地获得，并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度取决于所选的试剂。重要的一点是，使用能达到选定粘度的量。显然，合适载体和其他添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如，液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浮液、凝胶或其他液体形式，例如时间释放形式或液体填充形式)。
[0216]
本领域技术人员将认识到，所述组合物的组分应选择为化学惰性，并且不会影响如本公开主题所述的免疫应答细胞的活性或效力。这不会给化学和药学原理方面的技术人员带来任何问题，或者可以通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及过度实验)从本公开和本文引用的文件中轻而易举地避免问题。
[0217]
关于本公开主题的免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是实现最佳效果所需的细胞数量。待施用的细胞数量因受试者而异。在某些实施方式中，向受试者施用从约104至约10
10
、从约105至约109、或从约106至约108个本公开主题的免疫应答细胞。更有效的细胞可以以更小的数量施用。在一些实施方式中，向人受试者施用本公开主题的至少约1
×
108、约2×
108、约3
×
108、约4
×
108和约5
×
108个免疫应答细胞。有效剂量的精确确定可能根据每个受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的病情。本领域技术人员可根据本发明和本领域知识轻而易举地确定剂量。
[0218]
本领域技术人员可以轻而易举地确定在组合物中的细胞和可选添加剂、溶媒和/或载体的数量，并在本公开主题的方法中施用。通常，任何添加剂(除活性细胞和/或试剂外)以约0.001％至约50％(按重量计)的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，并且活性成分以微克至毫克的顺序存在，例如从约0.0001wt％至约5wt％，从约0.0001wt％至约1wt％，从约0.0001wt％至约0.05wt％，从约0.001wt％至约20wt％，从约0.01wt％至约10wt％，或从约0.05wt％至约5wt％。对于施用于动物或人的任何组合物，以及任何特定给药方法，应通过例如在适当动物模型(例如，啮齿动物，如小鼠)中测定致死剂量(ld)和ld50来确定毒性；以及，组合物的用量，以及其中的组分和施用引起适当反应的组合物的时间。此类测定不需要根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文件进行过度实验。而且，连续给药的时间可以在无需过度实验的情况下确定。
[0219]
ⅻ
.治疗方法
[0220]
本文提供治疗受试者体内肿瘤的方法。所述方法包括以达到预期效果的有效量施用本公开的免疫应答细胞，无论是缓解现有病情还是预防复发。对于治疗而言，施用量是产生预期效果的有效量。有效量可在一次或一系列给药中提供。有效量可在大丸剂中或通过持续灌注提供。
[0221]
对于使用抗原特异性t细胞的过继免疫治疗，通常输注约106个至约10
10
个范围内的(例如，约109个或约106个)细胞剂量。将免疫应答细胞给药进入受试者体内和随后分化后，特异性针对一种特定抗原(例如突变型pik3ca肽)的免疫应答细胞被诱导。t细胞的“诱导”可包括抗原特异性t细胞(例如通过缺失或无能)的失活。失活对于(例如在自身免疫性疾病中)建立或重建耐受性尤其有用。本公开主题的免疫应答细胞可通过本领域已知的任何方法进行施用，包括但不限于胸膜给药、静脉给药、皮下给药、血管内给药、肿瘤内给药、鞘内给药、胸膜内给药、腹腔给药、和直接向胸腺给药。在某些实施方式中，将免疫应答细胞和包含其的组合物经胸膜内施用于需要的受试者。
[0222]
本公开主题提供使用包含靶向突变型pik3ca的tcr的免疫应答细胞(例如t细胞)的各种方法。例如，本发明公开的主题提供减少受试者体内肿瘤负荷的方法。在某些实施方式中，减少肿瘤负荷的方法包括向受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞。本公开的免疫应答细胞可减少受试者体内的肿瘤细胞数量、减小肿瘤大小和/或根除肿瘤。
[0223]
本公开主题还提供增加或延长患有肿瘤的受试者存活期的方法。在某些实施方式中，增加或延长患有肿瘤的受试者存活期的方法包括向受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞。
[0224]
可使用本公开主题的免疫应答细胞抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗有反应的癌症。治疗的癌症的非限制性示例包括任何pik3ca突变的癌症，包括但不限于乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肛门癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、非黑色素瘤皮肤癌和唾液腺癌。在某些实施方式中，所述癌症为乳腺癌。
[0225]
此外，本公开主题提供增加免疫激活细胞因子产生的方法，以响应主题中的癌细胞。在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用本公开的免疫应答细胞。免疫激活细胞
(freshney，1987)；“methods in enzymology”“handbook of experimental immunology”(weir，1996)“gene transfer vectors for mammalian cells”(miller和calos，1987)；“current protocols in molecular biology”(ausubel，1987)；“pcr:the polymerase chain reaction”(mullis，1994)；“current protocols in immunology”(coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，因此，在制造和实施本发明时可以考虑这些技术。将在下面的部分中讨论用于特定实施方式的特别有用的技术。
[0234]
提出以下实施例是为向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物以及试验、筛选和治疗方法的完整公开和描述，并非旨在限制发明人视为其发明的范围。
[0235]
实施例1：
[0236]
为鉴定自然加工和呈递的pik3ca表位，发明人通过在cos-7猴细胞系中将人hla-a*03:01与野生型(wt)或突变型pik3ca共电穿孔生成瞬时转染子。参见图1。然后用抗ⅰ类抗体结合细胞表面肽-mhc复合物，将其剥离细胞表面，通过lc/ms/ms纯化并测序洗脱的肽。
[0237]
如图2(上面板)所示，轮廓线分析描绘用突变的pik3ca和hla-a*03:01的组合电穿孔的转染子组中的富集信号。在野生型 pik3ca或突变的pik3ca hla-a*69:01中均未检测到信号。如图2(下面板)所示，在突变的pik3ca hla-a*03:01组中检测到的富集信号的肽碎片色谱表明，富集的肽的序列是一段序列为“alhggwttk”(seq id no:11)9个氨基酸的肽。肽中的氨基酸在p2位置由组氨酸替换为亮氨酸。
[0238]
基于hla-a*03:01上装载的最小表位的序列信息，进行差示扫描荧光以确定wt和突变肽与hla-a*03:01的生物物理相互作用的稳定性。结果在图3中示出。如图3所示，与wt肽相比，突变肽的结合在热稳定性上显著更高。此外，还生成wt和突变肽的肽mhc复合物的晶体结构，如图4所示。通过用突变型pik3ca、突变特异性cd8

t细胞克隆体外致敏健康供体pbmc，鉴定并分离出21lt2-2。其tcr序列通过10
×
基因组测序获得，该序列被克隆到逆转录病毒载体中并转导给同种异体的供体pbmc。
[0239]
为测试分离的tcr的反应性和限制性元件，用单个ⅰ类hla分子和wt或突变型pik3ca电穿孔cos-7细胞，并与用21lt2-2 tcr转导的供体t细胞共培养。参见图5。从炎症细胞因子tnf-α的上调可以看出，在hla-a*03:01的背景下，21lt2-2 tcr反应性对突变体h1047l pik3ca的组合具有特异性。
[0240]
接下来，进行研究以测定最初从cd8

t细胞分离的21lt2-2 tcr在没有cd8

辅助受体的情况下是否也在cd4

t细胞内发挥功能。tcr

cd8和cd4亚群被分离，并与两种类型的目标i)加工和呈递的抗原或ii)被动脉冲最小肽共培养。研究表明，分离的tcr不依赖于cd8辅助受体，因为它在cd8

(见图6)和cd4

(见图7)t细胞亚群中都发挥作用，如cd107a和tnf-α的突变特异性上调所示。缺乏辅助受体依赖性通常与高亲和力tcr相互作用有关。此外，还表明21lt2-2tcr可以识别、加工和呈递抗原，以及被动脉冲最小表位。
[0241]
接下来，进行研究以确定最小表位中包含的对pmhc-tcr相互作用和识别十分关键的氨基酸残基(见图8)。在9个氨基酸序列的每个位置产生丙氨酸肽替换，并与未替换的突变序列进行比较，研究识别的丧失。数据显示，除p4处的甘氨酸外，所有位置都对pmhc-tcr相互作用和识别十分关键。如本文所观察到的，大部分关键残基的保留可能限制可结合并触发21lt2-2 tcr的交叉反应肽的数量。如图9所示，使用scanprosite工具扫描人蛋白质组
以寻找匹配序列的搜索没有得到任何结果。
[0242]
实施例2：
[0243]
发明人旨在建立具有独特免疫学特性的hla-a*03:01突变型pik3ca特异性tcr文库，以鉴别用于临床开发的最佳候选者。基于21lt2-2的发现结果，生成与hla-a*03:01复合的突变型pik3ca肽的定制dextramer试剂(与荧光团结合的肽-mhc复合物的高阶结构)。图10显示经鉴别的突变型pik3ca特异性tcr经逆转录病毒转导的供体t细胞的dextramer染色图谱，其在cd8

tcr

t细胞上设门。三种tcr 21lt2-2、0606t1-2、1022t8来自三个独特的健康供体。它们都用dextramer染色呈阳性。1022t8的染色图谱与21lt2-2和0606t1-2不同，可能表明tcr亲和力较低。
[0244]
pik3ca新抗原特异性tcr 21lt2-2、0606t1-2、1022t8经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后的第4-6天，t细胞与已被用编码hla-a*03:01的rna与wt或突变型pik3ca rna电穿孔的人工抗原呈递细胞(aapc)共培养。通过炎症性细胞因子tnf-α的产生来评估突变特异性反应的存在。结果如图11和12所示。图11所示的细胞设门在cd8

tcr

细胞上，图12所示的细胞设门在cd4

tcr

细胞上。如图11所示，除21lt2-2之外，0606t1-2和1022t8都可以识别由hla-a*03:01呈递的内源性加工和呈递的突变抗原。如图12所示，与21lt2-2类似，0606t1-2与辅助受体无关，可在cd4

t细胞中发挥作用；1022-t8是一种辅助受体依赖的tcr，这表明它可能比21lt2-2和0606t1-2具有更低的亲和力。
[0245]
此外，还检测了与细胞溶解能力相关的原型标记cd107a的表达。如图13所示，tcr转导细胞上调cd107a的表达以响应于hla-a*03:01和突变型pik3ca的共表达。
[0246]
突变型pik3ca特异性tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与表达hla-a*03:01的靶细胞孵育，并用丙氨酸替换的肽(10μg/ml)脉冲。wt和天然突变型pik3ca 9-mer肽用作对照，以确定每个tcr的反应范围。细胞被设门在cd8

tcr

上。与未修饰的9个氨基酸的突变序列(表；p2中的突变)相比，当用丙氨酸替换的肽脉冲时，识别率损失》50％，表明该位置的天然氨基酸对tcr识别的重要性。结果如图14a-14c所示。如图14a-14c所示，对于21lt2-2，除位置4处的甘氨酸残基外，9个氨基酸序列中的所有氨基酸似乎对pmhc-tcr相互作用十分关键。此外，如图14a-14c所示，对于0606t1-2，p2、p3和p4替换似乎允许tcr发挥功能。此外，如图14a-14c所示，对于1022t8，所有位置似乎对tcr功能均十分关键，因为每个位置的丙氨酸替换导致功能损失》50％。
[0247]
发明人基于tcr反应性的损失衍生出位置基序，以建立用于tcr识别和测定交叉反应性的关键残基。图14a-14c中的数据以图形格式显示在图15中。虚线表示50％的最大反应性。基于此，用于确定潜在交叉反应性的基序显示在右侧，“x”表示用于tcr识别的非重要残基。默认情况下，位置1被指定为“x”，因为该位置的天然氨基酸是丙氨酸，因此不适用于本测试。
[0248]
在分辨出最小肽序列中的关键残基后，发明人使用scanprosite工具搜索所有uniprotkb/swiss prot(10-apr-19的2019_03释放:559,634个条目)数据库序列，以在人蛋白质组中对于21t2-2查找包含基序x-l-h-x-g-w-t-t-k[seq id no:48]的蛋白质，对于0606t1-2查找包含基序x-x-x-x-g-w-t-t-k[seq id no:49]的蛋白质，对于1022t8查找包含基序x-l-h-g-g-w-t-t-k[seq id no:50]的蛋白质。参见图16a。未在人蛋白质组中检测到匹配潜在交叉反应序列的21lt2-2和1022t8的查询结果。获得一个从跨膜蛋白87b
(ivfmgwttk[seq id no；47])衍生的0606t1-2的查询结果。参见图16b。发明人合成此肽并在hla-a*03:01 靶细胞上脉冲。使用天然突变型9-mer肽(alhggwttk[seq id no:11])作为对照。通过0606t1-2 tcr未识别到交叉反应肽。
[0249]
此外，发明人研究pik3ca突变型特异性tcr是否能够识别突变肽的替代长度。突变的pik3ca特异性tcr经逆转录病毒整合到健康供体t细胞的基因组中。在转导后第4-6天，t细胞与hla-a*03:01

抗原呈递细胞一起孵育，并用8-mer和10-mer突变的pik3ca肽池(1μg/ml)脉冲。由seq id no 11中所示氨基酸序列组成的wt和9-mer肽用作对照。细胞已在cd8

tcr

表达上设门。tnfα产生过程中的突变型肽特异性上调表明对替代肽长度的识别。8-mer突变的pik3ca肽由lhggwttk[seq id no:51]中所示氨基酸序列组成。10-mer突变的pik3ca肽由dalhggwttk[seq id no:52]中所示氨基酸序列组成。结果示于图17中。如图17所示，所有三种tcr均能识别8-mer和10-mer突变的pik3ca肽。
[0250]
从前面的描述可以明显看出，可以对本文所述的发明进行变更和修改以使其适用于各种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
[0251]
本说明书中通过登录号或参考号提及的所有专利、出版物和序列均通过引用并入本文中，其程度与每项独立专利、出版物和序列明确且单独地表示通过引用并入的程度相同。