包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物的制作方法

1.本发明涉及包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物，更详细地，涉及如下的化妆品组合物，即，通过降低角质细胞和真皮细胞中炎症机制蛋白和炎症机制基因的表达，具有抗炎功能，并具有皮肤美白及皮肤保湿的功能。


背景技术：

2.1925年由古柯(coca)首次将对于食物和通过呼吸道暴露的物质出现皮肤炎、哮喘、高超热的倾向表述为特应性皮炎(atopy)。特应性疾病除了特应性皮炎以外，还有哮喘、特应性鼻炎、特应性结膜炎等。因环境污染物质的增加等原因，特应性皮炎的发病率在全世界呈迅速增加趋势，患病率达到总人口的20％。特应性皮炎患者由于日常生活受到限制，导致生活质量下降，治疗方面的经济负担增加，因此急需针对特应性皮炎治疗管理的对策。
3.特应性皮炎(atopic dermatitis)是一种主要从幼儿期或儿童期开始的伴有严重瘙痒症的复发性慢性皮肤疾病，是伴有家族史的常见皮肤疾病。症状从婴幼儿期，尤其是从出生2个月前后开始，其中约50％发生在出生后至2岁之前，而大部分在5岁之前出现症状，相反，在成年人中首次出现症状的例子非常罕见。对部分患者来说，伴随着成长，症状得到缓解或自然治愈，幼儿期发病患者中的一半以上在2岁之前就会好转。皮肤病变的形状及分布具有特征性的征象，并伴有瘙痒症(发痒症)、皮肤干燥症及特征性湿疹。在幼儿时期，会从脸部和四肢中展开的部分开始出现湿疹，但随着成长，特征性地在胳膊弯曲的部分和膝盖后面的弯曲部位会以湿疹的形式出现。成年人会出现折叠部位皮肤变厚的苔癣化(lichenification)，与幼小儿时期相比，在四肢以外的脸部、胸部、颈部等出现湿疹的情况较多。
4.这种特应性皮炎主要是伴随瘙痒和炎症的慢性炎症性皮肤疾病，虽然还没有明确查明诱导特应性皮炎的原因，但众所周知，是在遗传易感性、免疫学因素及环境因素的综合作用下发生的。对于特应性皮炎的发生，迄今为止报道的免疫学特性包括血液中免疫球蛋白(ige)抗体及白细胞介素-4细胞因子(il-4cytokine)的分泌量增加，γ干扰素细胞因子(ifn-γcytokine)的分泌量降低，在疾病初期，识别抗原的t细胞分泌白细胞介素-4(il-4)细胞因子、白细胞介素-5(il-5)细胞因子及白细胞介素-13细胞因子(il-13cytokine)，调节幼稚cd4 t(naivecd4 t)细胞分化成th2细胞，促进b细胞活化，增加免疫球蛋白的分泌。因此在特应性皮炎患者的血液中白细胞介素-4、白细胞介素-5及白细胞介素-13细胞因子及免疫球蛋白的数值表现得异常高。并且，th1型(th 1type)细胞因子如γ干扰素及白细胞介素-12降低。
5.相反，在后期发生的慢性特应性皮炎的情况下，随着继发性微生物感染导致γ干扰素细胞因子的表达水平增加，th1细胞免疫反应增加。γ干扰素细胞因子激活巨噬细胞及nk细胞，被激活的巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β等细胞因子以促进角质细胞的凋亡，并诱导慢性炎症，例如渗入皮肤组织等。
6.最近，除免疫学机制之外，皮肤屏障的损伤也成为特应性皮炎恶化的主要因素。表
皮中存在于最外层的角质层由角质细胞形成，并由分化的角质细胞及围绕它们的脂质层组成。这种皮肤屏障很容易因过度洗脸或洗澡等生活习惯或干燥的大气、污染物质等环境因素及如角质细胞的脂质合成能力低下等的内因性疾病而受损，从而诱导特应性皮炎。因此特应性皮炎表现出苔藓化、鳞屑及干燥等的症状。并且，在整个急性、慢性期都会产生瘙痒感，这在特应性皮炎的治疗中很重要，因为它会导致继发性皮肤症状的恶化，例如由于挠痒行为引起的创伤、继发感染等。
7.目前，作为特应性皮炎的治疗剂，主要使用抑制炎症反应和细胞因子产生的类固醇剂，但如果长期给药，可能会引发皮肤萎缩或生长迟缓等各种副作用，因此最近非类固醇剂的使用正在增加。但是，非类固醇剂也具有红斑、瘙痒、浮肿、溃烂及苔藓化等的症状和减弱免疫力等的多种副作用，很难从根本上治疗特应性皮炎。因此需要研究从安全性得到认证的天然物中寻找治疗效果高、副作用小的新物质。
8.本发明的发明人发现作为天然物质的膨润土其自身能降低皮肤角质细胞及真皮细胞中炎症诱导因子的表达，因此将其作为用于改善包括特应性皮炎在内的炎症的化妆品组合物。目前为止，没有试图用膨润土自身改善或治疗特应性皮炎的示例，也没有关于其对特应性皮炎的治疗效果的报道。


技术实现要素：

技术问题
9.本发明的目的在于，提供用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
10.更详细地，本发明的目的在于，提供具有预防或改善特应性皮炎效果的化妆品组合物，其通过降低在皮肤中诱导炎症的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的炎症机制蛋白的表达来抑制炎症反应。
11.本发明的再一目的在于，提供用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
12.本发明的另一目的在于，提供用于美白皮肤及改善肤色的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。解决问题的手段
13.为了解决如上所述目的，本发明提供用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
14.并且，为了解决如上所述目的，本发明提供用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
15.并且，为了解决如上所述目的，本发明提供用于美白皮肤及改善肤色的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
16.上述化妆品组合物可以由选自由如下剂型组成的组中的一种以上来制备：特应性皮炎用香皂、洁面泡沫、洁面乳、卸妆水、沐浴剂、化妆水乳、柔肤水、爽肤水、润肤乳、护肤霜、精华液、收敛剂、乳液、啫喱、口红、喷雾剂、洗发水、护发素、发膜、沐浴露、面膜、按摩剂、粉饼、袖珍粉饼、粉底霜、两用粉饼及隔离霜。
17.上述膨润土可以是层间离子被钙离子(ca
2
)取代的膨润土或层间离子被镁离子(mg
2
)取代的膨润土。
18.上述化妆品组合物可降低角质细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达。
19.上述化妆品组合物可降低真皮细胞中肿瘤坏死因子α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达。发明的效果
20.本发明的用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物具有降低角质细胞和真皮细胞中炎症机制蛋白和炎症机制基因的表达的效果。
21.并且，本发明的用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物具有提高皮肤的水分含量的有益效果，用于美白皮肤及改善肤色的化妆品组合物具有降低皮肤的红度、提亮皮肤亮度的有益效果。
附图说明
22.图1为按浓度比较实施例1的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图。
23.图2为按浓度比较实施例2的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图。
24.图3为按浓度比较实施例3的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图。
25.图4为比较实施例1及实施例4的不同浓度的膨润土在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表。
26.图5为比较实施例1至3的膨润土试样在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表。
27.图6为比较实施例4至6的膨润土试样在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表。
28.图7为比较实施例1至3的膨润土试样在hs68真皮细胞中的抗炎效果的图表。
29.图8为比较实施例4至6的膨润土试样在hs68真皮细胞中的抗炎效果的图表。
30.图9为比较实施例1至3的膨润土试样在hacat角质细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
31.图10为比较实施例4至6的膨润土试样在hacat角质细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
32.图11为比较实施例1至3的膨润土试样在hs68真皮细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
33.图12为比较实施例4至6的膨润土试样在hs68真皮细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
34.图13为本发明一实施例的膨润土试样的皮肤清洁力效果的实验结果。
具体实施方式
35.本发明提供用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
36.并且，本发明提供用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
37.并且，本发明提供用于美白皮肤及改善肤色的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
38.上述化妆品组合物可以由选自由如下剂型组成的组中的一种以上来制备：特应性皮炎用香皂、洁面泡沫、洁面乳、卸妆水、沐浴剂、化妆水乳、柔肤水、爽肤水、润肤乳、护肤霜、精华液、收敛剂、乳液、啫喱、口红、喷雾剂、洗发水、护发素、发膜、沐浴露、面膜、按摩剂、粉饼、袖珍粉饼、粉底霜、两用粉饼及隔离霜。
39.上述膨润土可以是层间离子被钙离子(ca
2
)取代的膨润土或层间离子被镁离子(mg
2
)取代的膨润土。
40.上述化妆品组合物可降低角质细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达。
41.上述化妆品组合物可降低真皮细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达。
42.本发明的实施方式
43.在以下说明中，仅对理解本发明的实施例所需的部分进行说明，应注意的是，在不混淆本发明的主旨的范围内省略对其他部分的说明。
44.对在以下描述的本说明书及发明要求保护范围中所使用的术语或单词不应以常规或词典上的含义来限定地进行解释，而是应立足于发明人可以为了以最佳的方法来说明自身的发明而适当地对术语的概念下定义的原则，以符合本发明的技术思想的含义和概念来解释。因此，记载于本说明书的实施例和附图所示的结构仅仅为本发明的最优选的一实施例，而并不代表本发明的全部技术思想，因此，需要理解的是，在本技术时间点，还可以存在可代替这些的多种等同技术方案和变形例。
45.以下，将详细说明本发明。
[0046][0047]
本发明提供用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
[0048]
并且，本发明提供用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
[0049]
并且，本发明提供用于美白皮肤及改善肤色的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物。
[0050]
在本发明中，膨润土作为蒙脱石系列黏土矿物之一，除非另有指定，则包含蒙脱土矿物。
[0051]
上述膨润土(bentonite)是以蒙脱土(montmorillonite)为主要组成矿物的一种黏土矿物，蒙脱土和膨润土名称来源于法国的蒙特莫里隆地区和美国怀俄明州本顿地区，蒙脱土在矿物学分类中属于半群矿物，是一种si-4面体层和al-8面体层具有2∶1形态的结晶结构的微细集合体。
[0052]
在膨润土层间存在的阳离子种类大部分为ca
2
及mg
2
离子，少量存在na

、h

、k

等，而2价阳离子与4面体二氧化硅层的结合力强于1价阳离子，因此离子交换容量小，进而与水接触时膨润度发挥低。
[0053]
本发明的化妆品组合物包含上述膨润土作为有效成分，可抑制炎症反应，并具有皮肤保湿及皮肤美白等效果。
[0054]
本发明的化妆品组合物抑制角质细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1等炎症相关因子的表达。具体地，根据本发明的一实施例，在用膨润土处理的实验组中，确认到通过脂多糖(lps)诱导的
肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达得到抑制。
[0055]
本发明的化妆品组合物抑制真皮细胞中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1等炎症相关因子的表达。具体地，根据本发明的一实施例，在用膨润土处理的实验组中，确认到通过脂多糖(lps)诱导的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达得到抑制。
[0056]
本发明的化妆品组合物具有皮肤保湿效果，并具有美白皮肤及改善肤色的效果。具体地，根据本发明的一实施例，在用膨润土处理的人体皮肤中，确认到皮肤亮度及黄度增加，红度降低。并且，在用膨润土处理的人体皮肤中测定水分含量结果，确认到水分含量增加。
[0057][0058]
在本发明的一实施例中，膨润土可使用层间离子被钙离子(ca
2
)取代的膨润土或层间离子被镁离子(mg
2
)取代的膨润土。
[0059]
以往，包含膨润土提取液的化妆品和应用其的精华液、护肤霜、脸部喷雾及面膜已经上市，但与膨润土自身的特应性皮炎治疗效果相关的研究不足。对此，本发明人发现了膨润土自身的炎症反应抑制效果及特应性皮炎治疗效果，确认到在层间离子被钙离子(ca
2
)取代的钙基膨润土或层间离子被镁离子(mg
2
)取代的镁基膨润土中尤其具有这种效果，从而完成了本发明。
[0060]
在本发明的一实施例中，优选地，上述膨润土的粒度为0.01μm至200μm。若上述膨润土的粒度不足0.01μm，则制备工序困难，由于过于微细，因而存在抗炎效果、美白皮肤及改善肤色效果微弱的问题。并且，在上述膨润土的粒度超过200μm的情况下，可能会刺激皮肤而引起皮肤问题，因此优选上述范围内的粒度。
[0061]
在本发明的一实施例中，上述膨润土可包含50重量百分比至70重量百分比的二氧化硅(sio2)、10重量百分比至25重量百分比的氧化铝(al2o3)、1重量百分比至5重量百分比的氧化铁(fe2o3)及3重量百分比至6重量百分比的氧化镁(mgo)。
[0062]
并且，在本发明的一实施例中，上述膨润土还可包含选自由0重量百分比至5重量百分比的氧化钙(cao)、0重量百分比至5重量百分比的氧化钾(k20)及0重量百分比至5重量百分比的氧化钠(na2o)组成的组中的至少一种。
[0063]
在本发明中，术语“有效成分”是指可单独表现出所需活性或与自身没有活性的载体一同表现出活性的成分。
[0064]
在本发明中，术语“特应性皮炎”是指慢性、复发性的炎症性皮肤疾病，是伴有瘙痒症、皮肤干燥症和特征性湿疹的疾病。上述特应性皮炎以包括本领域中分为特应性皮炎的所有疾病的含义来使用，而不管其发生的直接、间接原因。通常，特应性皮炎根据其发病时期或发病对象分为幼儿特应性皮炎、小儿特应性皮炎、成人特应性皮炎、孕妇特应性皮炎，本发明的特应性皮炎被定义为包括上述所有类型的特应性皮炎。
[0065]
在本发明中，有“特应性皮炎”的情况是指因特应性皮炎导致皮肤的感染部位发生变化的状态，这种状态包括被视为皮肤疾病的状态和不被视为皮肤疾病的状态。
[0066]
在本发明中，“预防”是指通过将本发明的组合物适用于特应性皮炎来抑制或阻断
皮肤上的特应性皮炎症状，从而预先防止特应性皮炎症状的发生。并且，在本发明中，“改善”以包括减轻、预防或治疗特应性皮炎症状的含义来使用。
[0067][0068]
根据本发明的一实施例中，上述组合物可以由选自由如下剂型组成的组中的一种以上来制备：特应性皮炎预防或改善用香皂、洁面泡沫、洁面乳、卸妆水、沐浴剂、化妆水乳、柔肤水、爽肤水、润肤乳、护肤霜、精华液、收敛剂、乳液、啫喱、口红、喷雾剂、洗发水、护发素、发膜、沐浴露、面膜、按摩剂、粉饼、袖珍粉饼、粉底霜、两用粉饼及隔离霜，但不限于此。
[0069]
根据本发明的一实施例中，在上述剂型为糊剂、霜或凝胶的情况下，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等。
[0070]
根据本发明的一实施例中，在上述剂型为粉末或喷雾的情况下，作为载体成分，可利用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，尤其，在喷雾的情况下，可进一步包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。
[0071]
根据本发明的一实施例中，在上述剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳浊化剂，例如可利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐脂肪酸酯。
[0072]
根据本发明的一实施例中，在上述剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可利用液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇；悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或西黄蓍胶等。
[0073]
根据本发明的一实施例中，在含有表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸甲酯、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
[0074]
优选地，相对于100重量百分比的总化妆品组合物，用于上述化妆品组合物的膨润土的含量为0.01重量百分比至35重量百分比。
[0075]
相对于100重量百分比的上述化妆品组合物，在包含膨润土不足0.01重量百分比的情况下，具有抗炎效果、美白皮肤及改善肤色效果微弱的问题，在包含膨润土超过35重量百分比的情况下，根据膨润土物理化学特性(膨胀性(swelling))，由于高粘度问题而存在难以制备化妆品组合物的问题，因而优选含量在上述范围内。
[0076][0077]
实施例
[0078]
以下，通过实施例更详细地说明本发明。但是，这些实施例用于示例性地实施本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例，
[0079][0080]
实施例1：准备膨润土试样
[0081]
为了测定膨润土的抗炎效果及特应性皮炎改善效果，将韩国庆州阳南面地区产出的韩国产膨润土的干燥粉末溶解在0.5％的二甲基亚砜(dmso)后，再用培养基或3次蒸馏水稀释，用于实验。
[0082]
如在下表1中记载，将层间离子被钙离子取代的膨润土分离成粒度为50μm以下、10
μm～25μm、0.1μm～0.5μm的膨润土作为实施例1至3，将层间离子被镁离子取代的膨润土分离成粒度为50μm以下、10μm～25μm、0.1μm～0.5μm的膨润土作为实施例4至6，并进行了实验。
[0083][0084]
表1编号试样名称元素粒度实施例1bgp40b-p-ca.s钙型膨润土～50μm实施例2bgp40b-p-ca钙型膨润土10～25μm实施例3bgp40b-p-ca.nps钙型膨润土0.1～0.5μm实施例4bgp40b-p-mg.s镁型膨润土～50μm实施例5bgp40b-p-mg镁型膨润土10～25μm实施例6bgp40b-p-mg.nps镁型膨润土0.1～0.5μm
[0085][0086]
实施例2：准备细胞
[0087]
为了进行膨润土的细胞毒性评价，确认抗炎效果、特应性皮炎抑制效果，准备作为人源性皮肤角质细胞的hacat细胞株和作为人体真皮(foreskin)来源的成纤维细胞(fibroblast)的hs68细胞株。
[0088]
人角质细胞(hacat)购自韩国细胞系库(korean cell line bank；seoul，korea)并使用，真皮细胞(hs68)购自美国典型培养物保藏中心(atcc，american type culture collection，保藏编号：1635)，并使用。
[0089][0090]
实验例1：膨润土的细胞毒性实验
[0091]
为了测试根据实施例1至3的膨润土试样的细胞毒性，在人类角质细胞(hacat cell)和人类包皮细胞(hs68 cell)中测定了细胞毒性。
[0092]
细胞毒性实验是为了设定待进行细胞实验的物质的有效处理浓度而进行的实验，是为了进行在人工皮肤模特中可用于化妆品组合物的膨润土的刺激抑制效果实验而确定浓度的实验。
[0093]
将hacat角质细胞和hs68真皮细胞在96孔板(well plate)中以2x104细胞/孔(cells/well)的浓度分注后，在37℃、5％二氧化碳细胞培养条件下培养24小时。去除培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs，phosphate buffered saline)洗涤后，维持12小时的饥饿状态后，放入新的培养基，用不同浓度的膨润土处理后反应48小时。为了测定细胞的存活率，去除培养基，用pbs洗涤后，每孔(well)用20μl的5mg/mlmtt溶液处理，反应4小时后，用二甲基亚砜(dmso，dimethyl sulfoxide)进行溶解，在570nm处测定吸光度。
[0094]
图1为按浓度比较实施例1的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图，图2为按浓度比较实施例2的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图，图3为按浓度比较实施例3的膨润土试样在hacat角质细胞和hs68真皮细胞中的细胞毒性结果的柱状图。
[0095]
参照图1至图3，作为钙型膨润土的实施例1至3的膨润土试样，在hacat角质细胞中的浓度为2000μg/ml以上的情况下，相对存活率为80％以下，因而确认到细胞毒性。在生长
相对敏感的hs68真皮细胞中，确认到表现细胞毒性的浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、100μg/ml以上。
[0096]
因此，在随后进行的抗炎效果确认实验中，以在角质细胞中1000μg/ml以下和在真皮细胞中100μg/ml以下的浓度进行膨润土处理。
[0097][0098]
实验例2：膨润土的抗炎效果
[0099]
实验例2-1：不同浓度的膨润土的抗炎效果
[0100]
为了测试膨润土的炎症改善效果，将实施例1及实施例4的膨润土试样分别与作为免疫活性物质的lps(lipopolysaccharide，脂多糖)按浓度混合，在hacat角质细胞中反应24小时后，通过蛋白质印迹法(western blot(免疫印迹，immunoblot))对作为炎症相关基因的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6蛋白的表达量进行检查。
[0101]
试样处理前，将hacat角质细胞以1х105细胞/孔的浓度分注在细胞培养皿中，稳定24小时后，维持12小时饥饿状态。将实施例1及实施例4的膨润土试样以200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的浓度预处理后，对未处理对照组除外的实验组及阳性对照组进行lps处理，并反应12小时。从细胞中分离蛋白质，进行十二烷基硫酸纳(sds，sodium dodecyl sulfate)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page，poly acrylamide gel electrophoresis)后，通过蛋白质印迹法定量分析作为炎症相关因子的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6和作为管家(housekeeping)基因的β-肌动蛋白(β-actin)。
[0102]
图4为比较实施例1及实施例4的不同浓度的膨润土在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表。
[0103]
参照图4，用实施例1的膨润土试样处理的结果，在脂多糖诱导的hacat角质细胞组中，作为炎症相关因子的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6蛋白的表达量降低，用实施例4的膨润土试样处理的结果，脂多糖诱导的hacat角质细胞组中肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6蛋白的表达量降低。因此，在诱导炎症的角质细胞中，可确认到钙型膨润土、镁型膨润土的抗炎效果。
[0104][0105]
实验例2-2：在人源性hacat皮肤角质细胞株中不同粒度的膨润土的抗炎效果
[0106]
在hacat皮肤角质细胞株中，为了确认不同粒度的钙型膨润土和镁型膨润土试样的抗炎效果，用实施例1至6的膨润土试样对诱导免疫的hacat角质细胞处理后，通过蛋白质印迹法定量分析炎症相关基因。
[0107]
将实施例1至6的膨润土试样分别与作为免疫诱导物质的细胞因子肿瘤坏死因子-α和γ干扰素按粒度混合，在hacat角质细胞中反应24小时后，通过蛋白质印迹法(western blot(免疫印迹，immunoblot))对炎症相关基因的表达量进行检查。试样处理前，将hacat角质细胞以1х105细胞/孔的浓度分注在细胞培养皿中，稳定24小时后，维持12小时饥饿状态。将实施例1至6的试样以100μg/ml的浓度预处理后，对未处理对照组除外的实验组及阳性对照组用肿瘤坏死因子-α(10ng/ml)和γ干扰素(10ng/ml)处理，并反应12小时。从细胞中分离蛋白质，进行十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过蛋白质印迹法定量分析作为炎症相关因子的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10、核细胞趋化蛋白-1和作为管家基因的β-肌动蛋白。
[0108]
图5为比较实施例1至3的膨润土试样在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表，图6为比较实施例4至6的膨润土试样在hacat角质细胞中的抗炎效果的图表。
[0109]
参照图5及图6，在用实施例1至3的钙型膨润土处理的所有粒度的试样中，肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10及单核细胞趋化蛋白-1的表达相对于阳性对照组整体上全部降低。并且，在粒度为50μm以下的实施例1的钙型膨润土中免疫相关因子的蛋白质表达相对降低较多。虽然相对于实施例2的10μm～25μm膨润土，在实施例3的0.1μm～0.5μm钙型膨润土处理组中，白细胞介素-8除外的所有免疫因子的表达均降低，但与50μm以下的情况相比，所有免疫因子的表达表现得更高。
[0110]
在用实施例4至6的镁型膨润土的所有粒度的试样中，白细胞介素-8除外的炎症相关因子的表达相对于阳性对照组整体上降低。当观察单核细胞趋化蛋白-1免疫因子表达的减幅时，确认到镁型膨润土中抗炎效果最佳的膨润土是粒度为50μm以下的实施例4。
[0111][0112]
实验例2-3：在人源性hs68真皮细胞株中不同粒度的膨润土的抗炎效果
[0113]
在人源性hs68真皮细胞株中，为了确认不同粒度的钙型膨润土和镁型膨润土试样的抗炎效果，用实施例1至6的膨润土试样对肿瘤坏死因子-α/γ干扰素诱导免疫的hs68真皮细胞处理后，通过蛋白质印迹法定量分析炎症相关基因。
[0114]
将实施例1至6的膨润土试样分别与作为免疫诱导物质的细胞因子的肿瘤坏死因子-α和γ干扰素按粒度混合，在hs68真皮细胞中反应24小时后，通过蛋白质印迹法对炎症相关基因的表达量进行检查。试样处理前，将hs68真皮细胞以1х105细胞/孔的浓度分注在细胞培养皿中，稳定24小时后，维持12小时饥饿状态。将实施例1至6的试样以100μg/ml的浓度预处理后，对未处理对照组除外的实验组及阳性对照组用肿瘤坏死因子-α(10ng/ml)和γ干扰素(10ng/ml)处理，并反应12小时。从细胞中分离蛋白质，进行十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过蛋白质印迹法定量分析作为炎症相关因子的肿瘤坏死因子-α、环氧合酶-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10、单核细胞趋化蛋白-1和作为管家基因的β-肌动蛋白。
[0115]
图7为比较实施例1至3的膨润土试样在hs68真皮细胞中的抗炎效果的图表，图8为比较实施例4至6的膨润土试样在hs68真皮细胞中的抗炎效果的图表。
[0116]
参照图7及图8，在用实施例1至3的钙型膨润土处理的情况下，相对于仅用肿瘤坏死因子-α/γ干扰素处理的hs68真皮细胞阳性对照组，炎症相关因子的表达表现出整体降低的趋势。并且，在用实施例2的10μm～25μm粒度的钙型膨润土处理的实验组中，确认到最佳的肿瘤坏死因子-α的表达抑制效果。相同实验组的白细胞介素-10表达相对于其他实验组明显增加，确认到这是由作为干预抗炎的代表性细胞因子的白细胞介素-10的表达引起的肿瘤坏死因子-α抑制效果。在环氧合酶-2和单核细胞趋化蛋白-1的情况下，在实施例1中表现出最低的表达量。
[0117]
在用实施例4至6的镁型膨润土处理的情况下，单核细胞趋化蛋白-1除外的所有炎症相关基因的表达相对于阳性对照组全部降低。实施例4及实施例5的镁型膨润土的肿瘤坏死因子-α表达量降低至未处理阴性对照组相同的水平。考虑到在10μm～25μm粒度的钙型膨润土中表现最佳的肿瘤坏死因子-α的表达抑制效果，确认到在粒度为10μm～25μm的情况下，在真皮细胞中抑制肿瘤坏死因子-α的效果最佳。
[0118][0119]
实验例3：膨润土的特应性皮炎抑制效果
[0120]
实验例3-1：在人源性hacat皮肤角质细胞株中特应性皮炎抑制效果
[0121]
为了在人源性hacat皮肤角质细胞株中确认钙型膨润土和镁型膨润土试样的特应性皮炎抑制效果，用实施例1至6的膨润土对肿瘤坏死因子-α/γ干扰素诱导免疫反应的细胞处理后，通过逆转录聚合酶链反应(rt-pcr，real time-polymerase chain reaction)技术定量分析作为特应性皮炎相关基因的ccl17(趋化因子chemokine(c-c motif)配体(ligand17)；胸腺活化调节趋化因子(tarc，thymus-and-activation-regulated chemokine))和ccl21(趋化因子chemokine(c-c motif)配体(ligand)21；巨噬细胞来源的趋化因子(mdc，macrophage-derived chemokine))。
[0122]
将实施例1至6的膨润土分别与作为免疫诱导物质的细胞因子肿瘤坏死因子-α和γ干扰素按粒度混合，在hacat皮肤角质细胞中反应24小时后，通过逆转录聚合酶链反应技术分析炎症相关基因的表达量。试样处理前，将hacat角质细胞以1х105细胞/孔的浓度分注在细胞培养皿中，稳定24小时后，维持12小时饥饿状态。将膨润土试样以100μg/ml的浓度预处理后，对未处理对照组除外的实验组及阳性对照组用肿瘤坏死因子-α(10ng/ml)和γ干扰素(10ng/ml)处理，并反应12小时。将未处理的实验组设定为阴性对照组，将用肿瘤坏死因子-α/γ干扰素单独处理的实验组设定为阳性对照组。反应12小时后，在细胞中利用英杰试剂(reagent)分离总核糖核酸(total rna)后，利用随机六聚物(random hexamer)和ⅱ阴性逆转录酶(superscript ii reverse-transcriptase)逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。使用合成的互补脱氧核糖核酸(cdna)作为模板(template)，通过聚合酶链式反应(pcr)调查作为特应性皮炎相关基因的ccl17、ccl21及基本代谢功能调节基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的表达量。
[0123]
图9为比较实施例1至3的膨润土试样在hacat角质细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表，图10为比较实施例4至6的膨润土试样在hacat角质细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
[0124]
参照图9及图10，在用实施例1及实施例3的钙型膨润土处理的hacat角质细胞中，ccl17信使核糖核酸(mrna)的表达量相对于炎症诱导阳性对照组分别降低2.56倍、3.12倍，ccl21信使核糖核酸表达量相对于阳性对照组分别降低1.39倍、1.76倍。
[0125]
并且，在用实施例4至6的镁型膨润土处理的情况下，ccl17的表达量降低1.80～4.92倍，ccl21信使核糖核酸的表达量也在所有实验组中降低。因此，确认到实施例1、实施例3至6的膨润土抑制人源性皮肤角质细胞中特应性皮炎相关因子的表达，并且确认到其中粒度为0.1μm～0.5μm的钙型膨润土最有效。
[0126][0127]
实验例3-2：在人源性hs68真皮细胞株中特应性皮炎抑制效果
[0128]
在人源性hs68真皮细胞株中，为了确认钙型膨润土和镁型膨润土试样的特应性皮炎抑制效果，将肿瘤坏死因子-α/γ干扰素诱导免疫反应的细胞用实施例1至6的膨润土试样处理后，通过逆转录聚合酶链反应技术定量分析特应性皮炎相关基因ccl17和ccl21。实验以与上述实验例3-1的利用hacat角质细胞株的实验方法相同的方法进行。
[0129]
图11为比较实施例1至3的膨润土试样在hs68真皮细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表，图12为比较实施例4至6的膨润土试样在hs68真皮细胞中的特应性皮炎抑制效果的图表。
[0130]
参照图11及图12，在hs68真皮细胞中，相比于仅用肿瘤坏死因子-α/γ干扰素处理的阳性对照组，在用实施例1至3的钙型膨润土处理的所有实验组中，观察到ccl17信使核糖核酸的表达量降低。ccl21信使核糖核酸表达量在实施例2及实施例3中也分别降低2.29倍、2.80倍。
[0131]
镁型膨润土的也在所有实验组中ccl17的表达相对于阳性对照组抑制。ccl21信使核糖核酸表达量也相对于所有阳性对照组降低，确认到在粒度为0.1μm～0.5μm的情况下抑制效果最佳。
[0132][0133]
实验例4：膨润土的皮肤清洁力试验
[0134]
实验例4-1：含有膨润土清洁产品的清洁力试验
[0135]
以10名实验参与者作为对象，进行了含有膨润土清洁产品的人体功效试验。在试验部位适用清洁产品后，利用分光测色仪(chromameter)评估试验部位的肤色变化。并且，利用偏光皮肤镜(polarized dermoscopy)对皮肤照片进行了视觉评估。实验每天进行1次，持续2周，将清洁产品涂抹在左臂部分。作为对照组，以不清洗的右臂进行比较评估。
[0136]
图13为本发明一实施例的膨润土试样的皮肤清洁力效果的实验结果。
[0137]
参照图13，对10名受试者手臂内侧皮肤的皮肤亮度及黄度测定的结果，经过2周的实验后皮肤亮度平均增加约0.77，黄度未观察到显著差异。对皮肤的红度测定的结果，平均降低约0.31％，皮肤水分含量平均增加1.523％。
[0138][0139]
实验例4-2：膨润土自身的清洁力试验
[0140]
为了确认在上述实验例4-1中清洁产品的美白及保湿效果是由产品所含的膨润土自身引起的效果，仅对膨润土原料单独进行清洁力试验。以10名试验参与者作为对象，使用膨润土5％(w/v)、10％(w/v)、25％(w/v)作为试验物质，以与上述实验例4-1相同的方法进行了人体功效试验。
[0141]
下表2至表4分别为使用膨润土5％(w/v)、10％(w/v)、25％(w/v)作为试验物质进行人体功效试验的结果的整理表。
[0142][0143]
表2
[0144][0145]
表3涂抹前平均数涂抹后平均数变更平均数亮度67.8768.020.156红度8.968.70-0.256黄度27.1427.360.219水分含量11.5712.961.389
[0146][0147]
表4 涂抹前平均数涂抹后平均数变更平均数亮度67.4668.110.651红度8.758.22-0.536黄度26.6727.480.805水分含量11.8412.590.746
[0148][0149]
在10名受试者中有1名敏感性受试者的左臂内侧发生红疹，因而暂停试验。参照上表2至表4，对9名受试者的手臂内侧皮肤的皮肤亮度及黄度测定的结果，经过2周的实验后皮肤亮度及黄度整体增加。尤其5％(w/v)膨润土的皮肤亮度增加最大，20％(w/v)膨润土的黄度增加最大。
[0150]
对红度测定的结果，经过2周的实验后红度整体降低，尤其20％(w/v)膨润土的红度降低最大。对水分含量测定的结果，经过2周的实验后水分含量整体增加，尤其10％(w/v)膨润土的水分含量增加最大。
[0151]
对皮肤照片的视觉评估结果，在使用所有浓度的膨润土的皮肤中，可确认到9名受试者的皮肤亮度增加的结果。
[0152][0153]
以上，说明了根据本发明一实施例的用于预防或改善特应性皮炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物的具体实施例，显然，在不脱离本发明的范围的限度内可以进行各种实施变形。
[0154]
因此，本发明的范围不应局限于所述的实施例而定，而是应视为后述的发明要求保护范围和具有与该发明要求保护范围等同或等价变形的所有保护范围均属于本发明的
思想范畴。
[0155]
即，应当理解，上述实施例在所有方面均为例示性的，而并非为限定性的。相对于详细说明，本发明的范围通过后述的发明要求保护范围来呈现，从发明要求保护范围的表示、范围以及其等同概念导出的所有变更或变形形态应当解释为包含于本发明的范围之内。
[0156]
产业上的可利用性
[0157]
本发明的用于抗炎的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物具有降低角质细胞和真皮细胞中炎症机制蛋白和炎症机制基因的表达的效果。
[0158]
并且，本发明的用于皮肤保湿的包含膨润土作为有效成分的化妆品组合物具有提高皮肤的水分含量的有益效果，用于美白皮肤及改善肤色的化妆品组合物具有降低皮肤的红度并提亮皮肤亮度的有益效果。