一种高纯度莫诺苷的制备方法与流程

1.本发明涉及莫诺苷提取制备技术领域，具体涉及一种高纯度莫诺苷的制备方法。


背景技术：

2.莫诺苷(c
17h26o11
)是一种环烯醚萜苷类化合物，其结构式如图1所示。主要来源于山茱萸的干燥成熟果肉——山萸肉。山萸肉是产自于陕西、山西、甘肃等地区的一种常见的中药材，以果肉入药，其味酸涩，具有补益肝肾、收敛固涩、健胃、益气血等功效。
3.山萸肉的主要有效成分是环烯醚萜苷类物质，其中以马钱苷和莫诺苷的含量最高，是评价山茱萸质量的重要指标之一。药典中规定，山茱萸饮片含马钱苷(c
17h26o10
)不得少于0.60％，但并未对莫诺苷的含量做出规定。有研究表明，莫诺苷具有抗氧化、促进神经生长，抗凝血、抗血小板聚集、保护内皮细胞和心肌细胞以及降血糖等多种药理作用，常作为神经保护类药物用于治疗或预防脑重大疾病，如脑卒中、脑缺血再灌注损伤等。
4.由于莫诺苷结构复杂，目前还未能实现人工合成，故现有纯品莫诺苷均是从山茱萸中提取得到，但是，山茱萸果实中含有大量多糖等物质，会对莫诺苷的提取产生一定的影响，不仅会导致提取难度增加，还由于提纯工序所需设备造价昂贵，导致成本增加。因此，从山茱萸中经济、廉价地获得大量莫诺苷纯品，具有非常重要的药用价值和经济价值。
5.例如，在专利(申请号为201810287050.0)山茱萸提取物同时制备高纯度莫诺苷和马钱苷的方法中，先后采用了大孔树脂、正相硅胶、反相硅胶、凝胶等分离方法，最终制得莫诺苷马钱苷，其步骤复杂，耗时；且由于山茱萸的高糖份导致需大量大孔树脂和乙醇来除糖，操作繁琐，费时费力，成本较高。在申请号为201710094742.9、200710113824.x的专利中也具有如上所述的相似缺陷。
6.在专利(申请号为201010557777.x)一种从山茱萸中提取莫诺苷和马钱苷的方法中，采用70％乙醇提取和正丁醇萃取的方法来获得莫诺苷和马钱苷的粗提物，但由于粗提物中所含糖份含量仍然较高，需要采用高速逆流色谱对粗提物进行精制，具有设备成本较高，流动性和固定性的形成条件不易摸索的缺点，且均为一次性使用，对环境污染较重。
7.在专利(申请号为201510438773.2)制备莫诺苷的方法中，采用渗漉的方法提取莫诺苷，严重制约了莫诺苷的大批量制备，而且主要以采用正相硅胶为固定相，二氯甲烷-甲醇为流动相的分离方法，消耗了大量二氯甲烷，
8.成本高，环境压力大，且产物纯度仅为70％。
9.在专利(申请号为201110280760.9)莫诺苷的制备方法中，采用水提醇沉的方法提取莫诺苷，由于莫诺苷在水中溶解度不佳，导致需多次加热回流提取，工作量大。醇沉技术消耗乙醇也较多。分离主要以大孔树脂为主，由于树脂的塔板理论数低，分离度不好，导致需反复多次大孔树脂分离，耗时长，成本高。
10.针对以上问题，以及山茱萸中含有大量糖份的特征，本发明建立了一种从中药材山茱萸中制备大量、高纯度莫诺苷的方法。


技术实现要素：

11.为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种高纯度莫诺苷的制备方法，该方法采用先除糖后提取的方案，使得粗提取物质量轻，含糖低，杂质少，极大减少了后期使用大孔吸附树脂除糖所使用的树脂用量和有机溶剂的用量，也极大降低了分离时间、用工成本；操作简单，环境污染小，用时短，适合用山茱萸大量制备高纯度莫诺苷。
12.为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
13.一种高纯度莫诺苷的制备方法，包括以下步骤：
14.s1、向山茱萸粉末中加水，然后在室温下浸提，浸提完成后过滤，收集滤渣备用；
15.s2、将s1的滤渣在提取溶剂中于40～60℃下浸提，浸提完成后过滤，
16.将滤液浓缩，得到莫诺苷粗提物a；
17.s3、将s2的莫诺苷粗提物a进行硅胶过柱分离，以二氯甲烷/甲醇为流动相进行梯度洗脱，收集含有莫诺苷的流份，浓缩得到莫诺苷粗提物b；
18.s4、将s3的莫诺苷提取物b用热水溶解，然后采用中压反相色谱柱进行分离，并对分离后的莫诺苷粗品进行重结晶，得到纯度》98％的莫诺苷纯品。
19.进一步，s1中，山茱萸粉末与水的用量比为2.5g：10～20ml。
20.进一步，s1、s2中，所述浸提是采用超声提取，所述超声提取的时间为0.5～3h。
21.进一步，s2中，所述提取溶剂为甲醇或乙醇；山茱萸粉末与提取溶剂的用量比为2.5g：10～20ml。
22.进一步，s3中，梯度洗脱程序如下：
23.将二氯甲烷与甲醇按照体积比9：1作为流动相去除杂质，之后将二氯甲烷与甲醇按照体积比6：1作为流动相收集含有莫诺苷的流份。
24.进一步，s4中，所述热水的温度为50～70℃。
25.进一步，s4中，所述中压反相色谱柱的填料是c18反相硅胶。
26.进一步，s4中，所述中压反相色谱柱的分离条件如下：
27.以体积比为1：9的甲醇/水溶液作为流动相，检测波长为240nm，流速为15ml/min。
28.进一步，s4中，所述重结晶是以甲醇溶解分离后的莫诺苷粗品，然后加入乙酸乙酯，静置后析晶，得到纯度》98％的莫诺苷纯品。
29.更进一步，乙酸乙酯与甲醇的体积比为7～9：1。
30.本发明的有益效果：
31.1、本发明采用逆向思维，首先采用冷水超声提取去除山茱萸中的糖份，然后在40～60℃下采用甲醇超声提取山茱萸中的莫诺苷。所得提取物中含糖量少，莫诺苷的含量高，极有利于后续的分离工作。然后采用正向硅胶对提取物进行分离，去除低级性部分以及残余的糖份和鞣质。由于莫诺苷的高极性性质非常适于反相色谱分离，经洗涤的提取物直接采用塔板理论数高、承载量大的反相中压制备色谱进行分离，得到纯度在90％以上的莫诺苷。经重结晶后，纯度可达98％以上。
32.2、由于山茱萸果实含有大量的糖份，严重干扰了莫诺苷的提取和制备。故本发明采用先水超声提取糖，而后甲醇超声提取莫诺苷的方法，极大的降低了后续去除糖份的工作量；而且所得提取物中莫诺苷含量高，糖份含量低。有助于后续的分离提纯。整个制备工艺操作简单，步骤少，成本低，对环境污染小，用时短，产量大，适用于山茱萸大量制备高纯
度的莫诺苷。
33.3、本发明采用的中压制备液相色谱对莫诺苷分离效果好，具有分离速度快、承载量大、成本低、所得产品纯度高的优点。超声辅助提取效率高，能耗低，适于莫诺苷的提取。
附图说明
34.图1是莫诺苷的结构式。
35.图2是实施例1分离的莫诺苷粗品的中压制备分离色谱图。
36.图3是实施例1制备得到的莫诺苷纯品的hplc色谱图。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优势更加清楚明白，以下结合附图及实施案例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1
40.一种高纯度莫诺苷的制备方法，包括以下步骤：
41.s1、预处理去除糖份
42.将干燥的山茱萸果实粉碎成颗粒状得到山茱萸粉末；取山茱萸粉末2.5kg，加入10l纯水浸没山茱萸粉末，然后在室温下进行超声糖份，超声时间为0.5h，纱网过滤；再将滤渣用清水洗涤，布氏漏斗抽滤至无水滴出，去除滤液，收集滤渣备用。
43.s2、甲醇加热提取莫诺苷
44.向s1的滤渣中加入10l甲醇至漫过样品，在50℃下超声提取1h，纱布过滤；滤渣继续用10l甲醇在50℃下超声提取1h，布氏漏斗抽滤至无甲醇滴出；合并两次甲醇滤液，减压浓缩，干燥，得到莫诺苷粗提物a，称重83g。
45.s3、硅胶过柱分离
46.将s2的莫诺苷粗提物a用适量甲醇使之完全溶解，用40-60目的正相硅胶进行拌样，蒸干；取300-400目正相硅胶干法装柱，进行硅胶上样分离；样品硅胶与分离硅胶的用量保持1：5。采用二氯甲烷/甲醇混合溶液为流动相，以体积比9：1和6：1进行梯度洗脱。先用体积比为9:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱以除去低极性部分；将前沿色素带洗脱完毕后，改用体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱，流出液通过薄层板与标准品点板对照来收集含有莫诺苷的流份。合并流份，减压浓缩，得到莫诺苷粗提物b，称重34g。
47.s4、中压反相制备色谱分离
48.将s3的莫诺苷提取物b用60ml60℃的热纯水溶解，然后采用上海三为液相制备色谱仪(型号pilot50)进行分离；色谱柱选用3.5
×
35cm中压柱(最高耐压3mp)，内充c18反相硅胶，设定检测波长240nm，流速15ml/min，流动相为以体积比为1:9的甲醇/水溶液，进样量3ml，对莫诺苷提取物b进行分离，收集出峰时间在19.5min左右的吸收峰即可。重复上述中压制备操作至莫诺苷提取物b完全得到分离，合并莫诺苷的提取液，减压浓缩，得到莫诺苷
粗品，称重14.5g。经hplc检测，纯度≥90％。中压制备分离色谱图如图2所示。
49.s5、重结晶
50.将s4的莫诺苷粗品进行重结晶操作，用少量甲醇(约40～60ml)溶解样品，然后快速加入8倍量的乙酸乙酯，静置过夜(约8～12h)进行结晶，即得纯度≥99％的莫诺苷纯品，称重11.7g。
51.莫诺苷纯品经hplc检测，纯度为99.6％，检测条件为：waters2545型液相色谱仪，色谱柱：waters sunfire c18 column(4.6x 250m，5um)；流动相：乙腈/水(1:9)，流速：0.8ml/min；检测波长：240m；进样量：10μl；结果如图3所示。
52.实施例2
53.一种高纯度莫诺苷的制备方法，包括以下步骤：
54.s1、预处理去除糖份
55.将干燥的山茱萸果实粉碎成颗粒状得到山茱萸粉末；取山茱萸粉末2.5kg，加入10l纯水浸没山茱萸粉末，然后在室温下进行超声糖份，超声时间为0.5h，纱网过滤；再将滤渣用清水洗涤，布氏漏斗抽滤至无水滴出，去除滤液，收集滤渣备用。
56.s2、甲醇加热提取莫诺苷
57.向s1的滤渣中加入10l甲醇至漫过样品，在60℃下超声提取2h，纱布过滤；滤渣继续用10l甲醇在60℃下超声提取1h，布氏漏斗抽滤至无甲醇滴出；合并两次甲醇滤液，减压浓缩，干燥，得到莫诺苷粗提物a。
58.s3、硅胶过柱分离
59.将s2的莫诺苷粗提物a用适量甲醇使之完全溶解，用40-60目的正相硅胶进行拌样，蒸干；取300-400目正相硅胶干法装柱，进行硅胶上样分离；样品硅胶与分离硅胶的用量保持1：5。采用二氯甲烷/甲醇混合溶液为流动相，以体积比9：1和6：1进行梯度洗脱。先用体积比为9:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱以除去低极性部分；将前沿色素带洗脱完毕后，改用体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱，流出液通过薄层板与标准品点板对照来收集含有莫诺苷的流份。合并流份，减压浓缩，得到莫诺苷粗提物b。
60.s4、中压反相制备色谱分离
61.将s3的莫诺苷提取物b用60ml70℃的热纯水溶解，然后采用上海三为液相制备色谱仪(型号pilot50)进行分离；色谱柱选用3.5
×
35cm中压柱(最高耐压3mp)，内充c18反相硅胶，设定检测波长240nm，流速15ml/min，流动相为以体积比为1:9的甲醇/水溶液，进样量3ml，对莫诺苷提取物b进行分离，收集出峰时间在19.5min左右的吸收峰即可。重复上述中压制备操作至莫诺苷提取物b完全得到分离，合并莫诺苷的提取液，减压浓缩，得到莫诺苷粗品。经hplc检测，纯度≥90％。
62.s5、重结晶
63.将s4的莫诺苷粗品进行重结晶操作，用少量甲醇(约40～60ml)溶解样品，然后快速加入9倍量的乙酸乙酯，静置过夜(约8～12h)进行结晶，即得纯度99.3％的莫诺苷纯品，称重12.4g。莫诺苷纯品经hplc检测纯度，检测条件与实施例1基本相同。
64.实施例3
65.一种高纯度莫诺苷的制备方法，包括以下步骤：
66.s1、预处理去除糖份
67.将干燥的山茱萸果实粉碎成颗粒状得到山茱萸粉末；取山茱萸粉末2.5kg，加入10l纯水浸没山茱萸粉末，然后在室温下进行超声糖份，超声时间为0.5h，纱网过滤；再将滤渣用清水洗涤，布氏漏斗抽滤至无水滴出，去除滤液，收集滤渣备用。
68.s2、甲醇加热提取莫诺苷
69.向s1的滤渣中加入10l甲醇至漫过样品，在40℃下超声提取3h，纱布过滤；滤渣继续用8l甲醇在40℃下超声提取0.5h，布氏漏斗抽滤至无甲醇滴出；合并两次甲醇滤液，减压浓缩，干燥，得到莫诺苷粗提物a。
70.s3、硅胶过柱分离
71.将s2的莫诺苷粗提物a用适量甲醇使之完全溶解，用40-60目的正相硅胶进行拌样，蒸干；取300-400目正相硅胶干法装柱，进行硅胶上样分离；样品硅胶与分离硅胶的用量保持1：5。采用二氯甲烷/甲醇混合溶液为流动相，以体积比9：1和6：1进行梯度洗脱。先用体积比为9:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱以除去低极性部分；将前沿色素带洗脱完毕后，改用体积比为6:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相进行洗脱，流出液通过薄层板与标准品点板对照来收集含有莫诺苷的流份。合并流份，减压浓缩，得到莫诺苷粗提物b。
72.s4、中压反相制备色谱分离
73.将s3的莫诺苷提取物b用60ml50℃的热纯水溶解，然后采用上海三为液相制备色谱仪(型号pilot50)进行分离；色谱柱选用3.5
×
35cm中压柱(最高耐压3mp)，内充c18反相硅胶，设定检测波长240nm，流速15ml/min，流动相为以体积比为1:9的甲醇/水溶液，进样量3ml，对莫诺苷提取物b进行分离，收集出峰时间在19.5min左右的吸收峰即可。重复上述中压制备操作至莫诺苷提取物b完全得到分离，合并莫诺苷的提取液，减压浓缩，得到莫诺苷粗品。经hplc检测，纯度≥90％。
74.s5、重结晶
75.将s4的莫诺苷粗品进行重结晶操作，用少量甲醇(约40～60ml)溶解样品，然后快速加入7倍量的乙酸乙酯，静置过夜(约8～12h)进行结晶，即得纯度99.0％的莫诺苷纯品，称重10.8g。莫诺苷纯品经hplc检测纯度，检测条件与实施例1基本相同。
76.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。