一种批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液的方法与流程

1.本发明属于植物病害研究领域，具体地，本技术提供了一种批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液的方法及其应用。


背景技术：

2.玉米南方锈病是由多堆柄锈菌(puccinia polysora underw.)引起的一种气传病害，在多个地区均有发生。近年来，玉米南方锈病已成为影响玉米生产的主要病害之一，因此，人们对玉米多堆柄锈菌的研究和防治的重视逐渐增强。研究的对象也由实验室内少量植株逐渐转为大田内的大量植株，在大田尺度上开展玉米南方锈病研究，接种所需的孢子量远远大于实验室内开展相应研究所需孢子量。常规获取孢子的方法是人工目视挑取，费时费力且效率较低，对于需要进行大批量接种的大田试验，常规方法获取孢子并制备菌液的效率无法达到大田试验的要求，这也使得长期以来大田尺度上较大范围的玉米南方锈病试验一直受到菌液不足的限制。
3.中国专利201510765142.1公开了一种玉米多堆柄锈菌的单孢扩繁方法，其目的在于获得玉米多堆柄锈菌的纯菌系。中国专利201910852803.2公开了一种玉米多堆柄锈菌的接种扩繁方法，其目的在于对玉米多堆柄锈菌进行快速扩繁。上述两种方法均无法短时间内获取大量离体孢子并制成菌液。因此，亟需开发一种具有高效率、能够大批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液的方法。


技术实现要素：

4.玉米多堆柄锈菌在玉米叶片上产生孢子堆，并将夏孢子保存其中，完全成熟后孢子堆会开裂并释放夏孢子。常规获取夏孢子的方法包括抖落法、水洗法等，上述方法只能收集到已开裂孢子堆中的夏孢子，极大的限制了所获取的孢子数量。未开裂孢子堆中的夏孢子也具有侵染能力，常规的挑取法(用接种针或接种铲刮取)效率很低，难以满足快速大量制备菌液的需要。
5.针对以上问题，发明人尝试改进了玉米多堆柄锈菌菌液的制备方法，发现将适合的发病叶片风干后打碎，将未开裂孢子堆中的夏孢子充分暴露，并以吐温-80的水溶液进行孢子提取，可以实现大量快速提取同时保持其活性。
6.一方面，本技术提供了一种批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液的方法，包括：将发病叶片风干并粉碎制成叶片粉末；将叶片粉末溶于含有吐温-80的水溶液中；过滤；用清水洗涤滤渣。
7.进一步地，所述将发病叶片风干包括将发病叶片置于阴凉通风干燥处风2-6天，优选3-5天。
8.进一步地，所述将发病叶片风干包括：将叶片展平，平铺于吸水纸上；置于阴凉通风干燥处风干5天；期间每隔12小时翻一次叶片。
9.进一步地，所述粉碎为利用农用粉碎机将风干后的发病叶片粉碎，得到玉米叶片
粉末，优选玉米叶片粉末的直径小于0.5mm。
10.进一步地，所述吐温-80的水溶液浓度为0.01-0.03％，优选0.02％。
11.进一步地，所述玉米叶片粉末与吐温-80的水溶液质量比为1:20-1:50，优选1:30。
12.进一步地，所述过滤为双层医用纱布过滤。
13.进一步地，用清水洗涤滤渣为用清水洗涤滤渣3次，每次用水量小于已滤菌液的1/10。
14.进一步地，所述方法包括汰选叶片，去除含有其他植物病原菌的叶片的步骤，优选通过病害症状判断和/或通过光学显微镜观察孢子特征判断进行汰选。
15.另一方面，本技术提供了上述方法在玉米南方锈病及其防治研究中的应用。
16.所述发病叶片采集自田间自然发病且发病较重(发病区域面积占叶片总面积的30％以上)，发病区域相对集中的区域，叶面整洁无杂物。
附图说明
17.图1为本发明实施例1中风干后玉米叶片的图片。
18.图2为本发明实施例1中粉碎后叶片粉末的图片。
19.图3为本发明实施例1中玉米叶片接菌后病害显症的图片。
20.图4为本发明对比例1中玉米叶片接菌后病害显症的图片。
21.图5为本发明对比例2中玉米叶片接菌后病害显症的图片。
具体实施方式
22.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
23.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
24.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.实施例1批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液的方法
26.使用以下方法批量快速制备玉米多堆柄锈菌菌液：
27.(1)采集发病叶片：采集玉米多堆柄锈菌侵染导致的发病叶片。
28.(2)叶片风干：将步骤(1)采集的发病叶片置于阴凉通风干燥处风干5天，风干时将叶片展平，平铺于吸水纸上，每隔12小时翻一次叶片。
29.(3)汰选叶片：将步骤(2)风干的叶片(如图1所示)进行汰选，去除含有其他植物病原菌的叶片，确定是否含有其他植物病原的方法是通过光学显微镜观察孢子特征判断。
30.(4)叶片粉碎并溶于吐温-80水溶液中：使用农用粉碎机将步骤(3)得到的叶片粉碎制成直径小于0.5mm的叶片粉末(如图2所示)，将叶片粉末溶于0.02％的吐温-80水溶液中，叶片粉末与水溶液的质量比为1:30。
31.(5)水溶液过滤：将水溶液通过双层医用纱布进行过滤，并用清水洗涤滤渣3次并将滤渣内的液体挤净，滤出的溶液即为制备的玉米多堆柄锈菌菌液。
32.(6)田间接种：挑选健康植株，用海绵擦沾水去除玉米叶片表面的角质，使用喷雾器将制备好的菌液喷施于叶片上，10天后观察发病症状(如图3所示)。
33.以两人处理鲜重5kg的发病玉米叶片为例，菌液的制备周期为6.5天，分别为：采集叶片1天(以工作8小时计，下同)；叶片风干5天；粉碎叶片1小时；叶片粉末溶于水1小时；过滤2小时。
34.对比例1常规方法制备玉米多堆柄锈菌菌液
35.以以下方法制备玉米多堆柄锈菌菌液，采用传统的接种针挑取方法获取孢子并制备菌液：
36.(1)采集发病叶片：采集玉米多堆柄锈菌侵染导致的发病叶片。
37.(2)收集玉米多堆柄锈菌孢子：采用人工目视的方式确定发病区域，使用接种针(接种铲)在产孢区域挑取(刮取)发病叶片的夏孢子，将获取到的孢子置于洁净干燥的容器中(如离心管等)。
38.(3)孢子悬浮液制备：将收集到的孢子溶于0.02％的吐温-80水溶液中，并充分搅拌。
39.(4)田间接种：挑选健康植株，用海绵擦沾水去除玉米叶片表面的角质，间使用喷雾器(或小喷壶)将制备好的菌液喷施于叶片上，10天后观察发病症状(如图4所示)。与图3对比可以看出，喷施两种方法制备的菌液均可以使叶片正常发病，且不会引起其他病害。
40.同样以两人处理鲜重5kg的发病玉米叶片为例，菌液的制备周期约为13天，分别为：采集叶片1天；挑取玉米多堆柄锈菌孢子12天；孢子悬浮液制备1小时。
41.对比本发明和常规方法的菌液制备效率，待处理发病叶片鲜重为5kg时，本发明的菌液制备效率是常规方法的2倍，在待处理叶片更多时，本发明的效率优势将更加明显。另外，本发明所需的人工工作量大大降低。
42.实施例3对比本发明和常规方法孢子利用率高低
43.将对比例1的方法挑取孢子之后的叶片风干，然后经过实施例1中相同的步骤(粉碎、溶于水、过滤、洗涤)后，接种于田间健康叶片上，发现田间叶片仍可以正常发病(如图5所示)。表明人工挑取孢子的方法无可避免的会遗漏孢子，从而降低孢子的利用率。
44.虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。