水稻粒型粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用的制作方法

usa.2012,109(52):21534-21539(zhang xiaojun,wang jianfei,huang ji,lan hongxia,wang cailin,yin congfei,wu yunyu,tang haijuan,qian qian,li jiayang,zhang hongsheng.与粒长相关的osppkl1基因的稀有等位基因产生了特大谷粒的增产水稻.美国科学院院刊.2012,109(52):21534-21539)。
10.三、gl7
11.wang y,xiong g,hu j,jiang l,yu h,xu j,fang y,zeng l,xu e,xu j,ye w,meng x,liu r,chen h,jing y,wang y,zhu x,li j,qian q.copy number variation at the gl7 locus contributes to grain size diversity in rice.nat genet.2015,47(8):944-948(wang yuexing,xiong guosheng,hu jiang,jiang liang,yu hong,xu jie,fang yunxia,zeng longjun,xu erbo,xu jing,ye weijun,meng xiangbing,liu ruifang,chen hongqi,jing yanhui,wang yonghong,zhu xudong,li jiayang,qian qian.gl7位点的拷贝数变异引起了水稻籽粒大小的多样性.自然
·
遗传.2015,47(8):944-948)。
12.四、glw7
13.si l,chen j,huang x,gong h,luo j,hou q,zhou t,lu t,zhu j,shangguan y,chen e,gong c,zhao q,jing y,zhao y,li y,cui l,fan d,lu y,weng q,wang y,zhan q,liu k,wei x,an k,an g,han b.osspl13 controls grain size in cultivated rice.nat genet.2016,48(4):447-456(si lizhen,chen jiaying,huang xuehui,gong hao,luo jianghong,hou qingqing,zhou taoying,lu tingting,zhu jingjie,shangguan yingying,chen erwang,gong chengxiang,zhao qiang,jing yufeng,zhao yan,li yan,cui lingling,fan danlin,lu yiqi,weng qijun,wang yongchun,zhan qilin,liu kunyan,wei xinghua,an kyungsook,an gynheung,han bin.osspl13基因控制栽培稻的籽粒大小.自然
·
遗传.2016,48(4):447-456)。
14.五、qtgw3
15.hu z,lu sj,wang mj,he h,sun l,wang h,liu xh,jiang l,sun jl,xin x,kong w,chu c,xue hw,yang j,luo x,liu jx.a novel qtl qtgw3 encodes the gsk3/shaggy-like kinase osgsk5/ossk41 that interacts with osarf4 to negatively regulate grain size and weight in rice.mol plant.2018,11(5):736-749(hu zejun,lu sun-jie,wang mei-jing,he haohua,sun le,wang hongru,liu xue-huan,jiang ling,sun jing-liang,xin xiaoyun,kong wei,chu chengcai,xue hong-wei,yang jinshui,luo xiaojin,liu jian-xiang.一新的qtl qtgw3编码类gsk3/shaggy激酶osgsk5/ossk41与osarf4互作负调控水稻籽粒大小和粒重.分子植物.2018,11(5):736-749)。
16.因此，克隆水稻粒型基因，开发相应的分子标记，通过分子育种改良水稻粒型，可以同时提高水稻产量和改良水稻品质。
17.水稻gl4基因编码蛋白含有3个kelch重复结构域。kelch结构域的一级结构存在8个关键保守位点，包括4个疏水氨基酸、2个紧接连续的甘氨酸和隔开一段序列后的2个有固定间隔的芳香族氨基酸(goebel sj,johnson gp,perkus me,davis sw,winslow jp,paoletti e.the complete dna sequence of vaccinia virus.virology.1990,179(1):247-266)。该gl4蛋白与二穗短柄草的含kelch结构域蛋白4同源性高(88％相似度)。但其功
能至今尚不清楚。


技术实现要素：

18.本发明要解决的技术问题在于提供一种调控水稻粒型和粒重的水稻粒型粒重基因gl4及其编码的蛋白质，并基于此开发其相关应用。
19.为解决上述技术问题，本发明提供基因在调控植物粒型、粒重中的应用，所述基因具有如(a)、(b)、(c)所示的序列：
20.(a)seq id no：1所示的基因组核苷酸序列；
21.(b)seq id no：2所示的cdna核苷酸序列；
22.(c)在(a)、(b)所示的核苷酸序列的中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成的可编码具有调控粒型粒重功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物；
23.所述粒型为粒长。
24.作为本发明应用的改进：正调控植物(水稻)粒型、粒重，即，使得粒长增加、千粒重增加。
25.本发明还同时提供了上述基因编码的蛋白在调控植物粒型粒重中的应用，所述蛋白如(a)或(b)所示的序列：
26.(a)seq id no：3所示的氨基酸序列；
27.(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
28.其中的seq id no：3所示的蛋白质具有662个氨基酸，属于富含kelch结构域(即seq id no：3中的第128～172位、第180～233位、第236～288位)的新蛋白。
29.其中seq id no：1所示的93-11基因组核苷酸序列共有6164个核苷酸，seq id no：2所示的93-11cdna序列共有1989个核苷酸(包括终止子tag)。
30.为了验证候选基因gl4的功能，构建了基因互补载体；所述基因互补载体为pcambia1300载体；所述用于构建互补载体的基因引物为：
31.com-f：aataagcttactaattacatggaatgcgtgtaaattg；
32.com-r：agaagcttcatttcgtacggaggagaacaactg；
33.进一步地，由于上述基因属于正调控基因，因此可通过过表达来提高水稻粒长粒重；所述基因过表达载体为pcambia1300s载体；所述用于构建过表达载体的基因引物为：
34.over-f：aagggtaccatggggaagaagcagaagaagcc；
35.over-r：tgctctagatcgaaccaaagctatctcatgcc；
36.此处的应用，主要是将基因过表达通过转基因的方法转入水稻中以提高水稻的粒长粒重。
37.另一方面，本发明提供了一种与水稻粒型粒重基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为p4-1、p4-2、p4-3、p4-4、p4-5、p4-6、p4-7、4-8或p4-9；所述各分子标记对应的引物序列分别为：
38.p4-1：
39.f,5
’‑
tgggtcttcaaaaaatgttcagtgg-3’40.r,5
’‑
accccgcctaaactccatgaatc-3’；
41.p4-2：
42.f,5
’‑
tatagattcatcgtactaaggc-3’43.r,5
’‑
tgagatttattgttttgtgtg-3’；
44.p4-3：
45.f,5
’‑
agaagtagtgcagagtacagtc-3’46.r,5
’‑
agtactcctatcctttaataatatg-3’；
47.p4-4：
48.f,5
’‑
atacgtagcgtttggttatagc-3’49.r,5
’‑
ttcggttttgaactcaacttc-3’；
50.p4-5：
51.f,5
’‑
tgcttgaagaggagaatggtgg-3’52.r,5
’‑
agctcctgagttccttgcgtc-3’；
53.p4-6：
54.f,5
’‑
ttacattatcgaattatgcacgatac-3’55.r,5
’‑
tgatacccgaacttcctgactg-3’；
56.p4-7：
57.f,5
’‑
tgtggcagaattgtgggacac-3’58.r,5
’‑
actttatatctgatttaggcacgtttac-3’；
59.p4-8：
60.f,5
’‑
tagattggtttttatgaaacg-3’61.r,5
’‑
tgctgtcacagtttatcacac-3’；
62.p4-9：
63.f,5
’‑
tcctacgatttctcaatcctg-3’64.r,5
’‑
tgaattccttcaattttagagc-3’。
65.再一方面，本发明提供了上述与水稻粒型粒重基因紧密连锁的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用，所述应用为辅助选择与水稻粒型粒重相关性状。
66.上述分子标记是在进行水稻粒型粒重基因定位克隆过程中得到的与其紧密连锁的分子标记，因此，可通过上述获得的分子标记进行分子标记辅助选择育种，如筛选、鉴定与水稻粒型粒重相关性状。
67.实现本发明的具体技术步骤如下：
68.一、gl4基因的精细定位和候选基因确定：
69.利用粒长和粒重上存在显著差异的亲本培矮64s与93-11(图1，图2)构建了大规模的重组自交系(ril)群体。结合ril核心群体的高密度遗传图谱，我们检测到水稻第4号染色体上新的控制稻谷粒长和粒重的qtl——qgl4(图3a)。利用培矮64s为轮回亲本的大规模bc4f2群体将该qtl进一步精细定位于两个插入缺失(indel)标记p4-7和p4-8之间约9.3kb的物理距离内(图3b)，其中只有1个开放阅读框(orf)，编码产物与含kelch结构域的未知功能蛋白同源性高，暂命名为gl4。dna测序发现，亲本培矮64s和93-11的gl4编码区1989bp内存在2个引起氨基酸改变的单核苷酸多态(snp)(图3c)。
70.二、gl4基因的鉴定和功能分析：
71.通过转基因技术，结果表明本发明获得了粒长和千粒重显著增加的转基因互补培矮64s水稻植株和过表达培矮64s水稻植株(图5
–
图8)，并且过表达培矮64s水稻植株的基因转录水平表达量显著升高(图9)，证明了本发明正确克隆了gl4基因。氨基酸序列分析表明gl4编码包含kelch结构域蛋白，对93-11背景的gl4基因为培矮64s类型的近等基因系nil-gl4
培矮64s
和93-11的籽粒观察发现，粒长和千粒重也显著减小(图10；图11)，证明该基因编码蛋白调控水稻粒型。
72.本发明采用图位克隆技术利用水稻bc4f2群体首次在水稻中克隆到粒型粒重基因gl4并通过转基因互补实验和过表达实验以及近等基因系鉴定了基因的功能。gl4基因的克隆和应用，可有效调控水稻粒型粒重和产量，gl4基因也可应用于其它单子叶植物中用于调控粒型粒重和产量。同时本发明有助于水稻粒型粒重调控机理的阐明，并为水稻高产优质育种奠定扎实的理论基础。
73.综上，公开了水稻粒型粒重基因gl4(seq id no：1、2)、其编码的蛋白质(seq id no：3)及上述基因或蛋白质在调控植物粒型和粒重中的应用。本发明还公开了与上述基因紧密连锁的分子标记及其应用。gl4基因的克隆和应用，可通过调控水稻粒型粒重，有效提高水稻的产量。
附图说明
74.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
75.图1是水稻品种培矮64s和93-11的粒型表型；其中a为培矮64s的籽粒，b为93-11的籽粒，c-1cm标尺；
76.图2是水稻品种培矮64s和93-11的粒长和千粒重比较；a平均值
±
标准差(n＝100)，b平均值
±
标准差(n＝3)；
77.图3gl4基因的定位图；其中竖线上方标注分子标记，竖线下方数字代表交换个体数，atg和tag分别表示gl4基因的起始子和终止子；
78.图4pcambia1300-gl4互补载体图谱(a)和pcambia1300s-gl4过表达载体图谱(b)；
79.图5是培矮64s和gl4互补t0代转基因水稻的粒型表型；其中a为培矮64s的籽粒，b、c、d为转gl4互补株系的籽粒，e-1cm标尺；
80.图6是培矮64s和gl4过表达t0代转基因水稻的粒型表型；其中a为培矮64s的籽粒，b、c、d为转gl4过表达株系的籽粒，c-1cm标尺；
81.图7是培矮64s和转gl4互补载体株系的粒长和千粒重比较；a平均值
±
标准差(n＝100)，b平均值
±
标准差(n＝3)；
82.图8是培矮64s与转gl4过表达载体株系的粒长和千粒重比较；a平均值
±
标准差(n＝100)，b平均值
±
标准差(n＝3)；
83.图9是培矮64s与转gl4过表达载体株系的gl4转录水平的表达比较；平均值
±
标准差(n＝3)；
84.图10是93-11和近等基因系nil-gl4
培矮64s
的粒型表型；其中a为93-11的籽粒，b为nil-gl4
培矮64s
的籽粒，c-1cm标尺；
85.图11是93-11和近等基因系nil-gl4
培矮64s
的粒长和千粒重比较；a平均值
±
标准差(n＝100)，b平均值
±
标准差(n＝3)。
具体实施方式
86.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
87.实施例1：
88.1、水稻材料
89.籼稻品种为(oryza sativa l.indica)“93-11”和“培矮64s”，93-11背景的gl4基因替换为培矮64s类型的近等基因系nil-gl4
培矮64s
。
90.近等基因系nil-gl4
培矮64s
(93-11遗传背景下indel标记p4-6～p4-8之间被培矮64s片段代换)由染色体片段代换系cssl-qgl4与93-11连续回交4代并自交结合indel标记p4-1～p4-9辅助筛选得到。染色体片段代换系cssl-qgl4是由培矮64s与93-11连续回交5代并自交的bc5f2筛选得到，步骤详见zhang b,shang l,ruan b,zhang a,yang s,jiang h,liu c,hong k,lin h,gao z,hu j,zeng d,guo l,qian q.development of three sets of high-throughput genotyped rice chromosome segment substitution lines and qtl mapping for eleven traits.rice.2019,12(1):33。
91.2、indel标记精细定位gl4基因
92.采用水稻微量dna的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组dna。取0.2g水稻叶片，液氮冷冻研磨成粉状，转移至1.5ml离心管里提取dna，获得的dna沉淀溶解于150μl超纯水中。每一pcr反应用2μl dna样品。
93.gl4基因的初定位：将培矮64s与93-11杂交，f1代开始自交单粒传13代产生ril群体。结合ril核心群体的高密度遗传图谱，检测到水稻第4号染色体上新的控制稻谷粒型和粒重的qtl——qgl4(图3a)。
94.gl4基因的精细定位：利用培矮64s为轮回亲本的大规模bc4f2群体，同时在目标区间根据培矮64s和93-11的参考序列设计引物，筛选出具有多态的引物(表1)，将该qtl进一步精细定位于两个indel标记p4-7和p4-8之间约9.3kb的物理距离内(图3b)。
95.3、基因预测和比较分析：
96.通过rgap网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)分析，该区间内存在1个orf，基因组测序发现，亲本培矮64s的如seq id no：4的基因组核苷酸序列与93-11的如seq id no：1的基因组核苷酸序列间共存在11个snp和1个indel，包括如seq id no：2的编码区1989bp内的2个引起氨基酸改变的snp：snp1为93-11的a
175
变为培矮64s的g
175
(由异亮氨酸变为缬氨酸)，snp2为93-11的c
841
变为培矮64s的t
841
(由精氨酸变为半胱氨酸)(图3c)。因此，该orf可能是该性状的候选基因。
97.表1定位发展的分子标记
no：6所示的终止子tag后1318个核苷酸共9719个核苷酸，将该序列连接到常规双元表达载体pcambia1300中(图4a)，所得命名为pcambia1300-gl4；
110.用pcr扩增93-11的如seq id no：2所示的cdna核苷酸序列(从起始子atg至终止子tag共1989bp)，然后将该序列连接到常规双元表达载体pcambia1300s中(图4b)，所得命名为pcambia1300s-gl4。
111.通过农杆菌介导的植物转化方法将此载体(即，上述pcambia1300-gl4、pcambia1300s-gl4)分别转入培矮64s，各得到转基因植株3株，pcambia1300-gl4载体对应所得称为基因互补系植株，pcambia1300s-gl4载体对应所得称为基因过表达系植株。可委托武汉伯远生物科技有限公司完成。
112.按照常规水稻栽培方式在转基因圃内进行种植直至收获。所有转基因互补t0代植株和过表达t0代植株的表型均为粒长和千粒重显著增加(图5，图6，图7，图8)，并且过表达t0代植株的基因转录水平的表达量显著升高(图9)。由此说明，该orf就是控制粒型和粒重性状的候选基因gl4。
113.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。