一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法
技术领域
1.本发明涉及核黄素提取技术领域，特别是一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法。
背景技术：
2.核黄素(riboflavin)是一种黄色、光敏感、微溶于水的固体，是核醇与6，7-二甲基异咯嗪的缩合物，又名维生素b2(简称vb2)，是人体必需的一种水溶性维生素。大多数微生物和植物自身具有体内合成核黄素的功能，而人和动物都缺乏核黄素合成途径。而核黄素是人和动物的必需生长因子，具有广泛的生理功能，其在临床医疗、饲料加工、食品工业及化妆品制造领域具有重要价值。
3.目前国内外商品化的核黄素生产，几乎都是通过微生物发酵法进行的。然而天然的微生物生产核黄素的能力较弱，国内企业生产核黄素的菌株多为枯草芽胞杆菌基因工程菌株。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。枯草芽胞杆菌基因工程菌株虽然经过改造提升了核黄素产量，但改造过程中引入的外源基因易出现在核黄素产品中，使我国企业核黄素产品的出口受到了多个国家法规的限制。虽然市面上有多种核酸酶可以有效的水解溶解于水中的dna成分，但应用在核黄素生产领域时，由于核黄素粗品微溶于水，加入核酸酶后会面临酶解反应不充分的情况，问题依然没有得到解决。现有提取工艺为提高产量降低成本，未涉及专门去除转基因成分的步骤，因而导致了核黄素产品中转基因成分残留的风险。
4.因此，在制备核黄素产品过程中，需要对去除残留dna工艺进行研究，找到一种高效、清洁、合理应用核酸酶的方法对核黄素粗品进行处理，以获得不含转基因成分的核黄素产品。
技术实现要素：
5.本发明提供一种采用核酸酶去除核黄素粗品中的残留dna的工艺，去除了现有发酵法生产核黄素产品中存在的转基因成分残留，避免了核黄素产品出口受限的问题，同时进一步提高了核黄素产品的安全性。
6.本发明的技术方案为：一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法，包括以下步骤：
7.步骤1.调浆：将核黄素粗品加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度恒定在25～45℃之间；
8.步骤2.调ph：检测核黄素悬浊液ph，并依据检测结果向核黄素悬浊液中加入盐酸或氢氧化钠溶液，调节ph稳定在6～10；
9.步骤3.超声：保持搅拌及温度为25～45℃，向核黄素悬浊液施加90～110w功率的
超声并持续2～5h，然后调整超声功率至60～90w；
10.步骤4.酶解：保持温度稳定为25～45℃、ph稳定为6～10、超声功率稳定为60～90w，向核黄素悬浊液内加入全能核酸酶进行酶解反应，所述加入的全能核酸酶与核黄素粗品的比例为1：103～1：107，至反应完成；
11.步骤5.再调ph：依据步骤2的ph调节结果向核黄素悬浊液中加入盐酸或硫酸溶液，调节ph稳定在3～5；
12.步骤6.超声：保持搅拌及温度为25～45℃，向核黄素悬浊液施加100～200w功率的超声并持续1～2h，然后调整超声功率；
13.步骤7.再酶解：调整温度稳定至50～70℃，并保持ph稳定为3～5、超声功率稳定为100～200w，向核黄素悬浊液内加入5'-磷酸二酯酶进行酶解反应，所述加入的5'-磷酸二酯酶与核黄素粗品的比例为1：103～1：107，至反应完成；
14.步骤8.过滤：酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼；
15.步骤9.喷雾干燥：将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。
16.而且，步骤1中核黄素粗品为发酵液经过酸化、碱溶、离心、过滤，去除了菌体及大部分蛋白质、核酸等杂质，但未精制的核黄素。
17.而且，步骤1中核黄素粗品与水的比例为1：50～1：10。
18.而且，步骤4中反应完成所需时间为3～6h。
19.而且，步骤7中反应完成所需时间为2～3h。
20.与现有技术相比，本发明技术方案所具有的有益效果在于：
21.(1)本发明所提供的核黄素粗品的酶催化去除残留dna工艺，利用酶催化分解核酸的高效能力，结合适宜的反应条件，可以高效、清洁的去除核黄素产品中的转基因成分残留，提高安全性，扩大销售市场，提高了相关企业在核黄素市场的竞争力；
22.(2)利用全能核酸酶与5'-磷酸二酯酶不同的酶解特性，用不同的反应条件来最大化发挥其酶解效果，去除核黄素产品中的转基因成分残留，其中全能核酸酶在温度25～45℃、ph6～10、超声功率60～90w的条件下酶解效果最好，可将核酸降解成2～5个碱基的核苷酸，随后再用5'-磷酸二酯酶在温度50～70℃，ph3～5、超声功率100～200w的条件下，最大化利用其水解环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷的功能将2～5个碱基的核苷酸断裂成单核苷酸，配合实现去除核黄素中的所有残留dna的作用；
23.(3)步骤3及步骤6中给保持搅拌及温度的核黄素悬浊液施加一定功率的超声能改变核黄素悬浊液的物理性状，使其更适合进行后续步骤4及步骤7的酶解反应。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明进一步说明。
25.实施例1
26.将2kg核黄素粗品加入到100l水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到25℃；检测核黄素悬浊液ph为4.3，加入氢氧化钠溶液调ph到7；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在90w的超声波3h，然后调节超声功率到60w；保持温度在25℃，ph为到7，超声功率为60w，向核黄素悬浊液内加入2ml浓度100mg/l全能核酸酶进行酶解反应3h；酶解反应
完后，再加入硫酸溶液调ph到3；保持搅拌及温度25℃，向核黄素悬浊液施加功率在150w的超声波2h，然后调节超声功率到100w；调节温度到55℃，ph为到3，超声功率为100w，再向核黄素悬浊液内加入2ml浓度100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应2h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
27.实施例2
28.将50kg核黄素粗品加入到1500l水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到35℃；检测核黄素悬浊液ph为5.2，加入氢氧化钠溶液调ph到8；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在100w的超声波4h，然后调节超声功率到70w；保持温度在35℃，ph为到8，超声功率为70w，向核黄素悬浊液内加入100ml浓度100mg/l的全能核酸酶进行酶解反应5h；酶解反应完后，再加入盐酸溶液调ph到4；保持搅拌及温度35℃，向核黄素悬浊液施加功率在160w的超声波2h，然后调节超声功率到120w；调节温度到60℃，ph为到4，超声功率为120w，再向核黄素悬浊液内加入100ml浓度100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应3h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
29.实施例3
30.将1吨核黄素粗品加入到10吨水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到45℃；检测核黄素悬浊液ph为3.3，加入氢氧化钠溶液调ph到6；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在110w的超声波5h，然后调节超声功率到90w；保持温度在45℃，ph为到6，超声功率为90w，向核黄素悬浊液内加入5l浓度为100mg/l的全能核酸酶进行酶解反应6h；酶解反应完后，再加入盐酸溶液调ph到5；保持搅拌及温度45℃，向核黄素悬浊液施加功率在200w的超声波2h，然后调节超声功率到160w；调节温度到70℃，ph为到5，超声功率为160w，再向核黄素悬浊液内加入5l浓度为100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应3h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
技术领域
1.本发明涉及核黄素提取技术领域，特别是一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法。
背景技术：
2.核黄素(riboflavin)是一种黄色、光敏感、微溶于水的固体，是核醇与6，7-二甲基异咯嗪的缩合物，又名维生素b2(简称vb2)，是人体必需的一种水溶性维生素。大多数微生物和植物自身具有体内合成核黄素的功能，而人和动物都缺乏核黄素合成途径。而核黄素是人和动物的必需生长因子，具有广泛的生理功能，其在临床医疗、饲料加工、食品工业及化妆品制造领域具有重要价值。
3.目前国内外商品化的核黄素生产，几乎都是通过微生物发酵法进行的。然而天然的微生物生产核黄素的能力较弱，国内企业生产核黄素的菌株多为枯草芽胞杆菌基因工程菌株。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。枯草芽胞杆菌基因工程菌株虽然经过改造提升了核黄素产量，但改造过程中引入的外源基因易出现在核黄素产品中，使我国企业核黄素产品的出口受到了多个国家法规的限制。虽然市面上有多种核酸酶可以有效的水解溶解于水中的dna成分，但应用在核黄素生产领域时，由于核黄素粗品微溶于水，加入核酸酶后会面临酶解反应不充分的情况，问题依然没有得到解决。现有提取工艺为提高产量降低成本，未涉及专门去除转基因成分的步骤，因而导致了核黄素产品中转基因成分残留的风险。
4.因此，在制备核黄素产品过程中，需要对去除残留dna工艺进行研究，找到一种高效、清洁、合理应用核酸酶的方法对核黄素粗品进行处理，以获得不含转基因成分的核黄素产品。
技术实现要素：
5.本发明提供一种采用核酸酶去除核黄素粗品中的残留dna的工艺，去除了现有发酵法生产核黄素产品中存在的转基因成分残留，避免了核黄素产品出口受限的问题，同时进一步提高了核黄素产品的安全性。
6.本发明的技术方案为：一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法，包括以下步骤：
7.步骤1.调浆：将核黄素粗品加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度恒定在25～45℃之间；
8.步骤2.调ph：检测核黄素悬浊液ph，并依据检测结果向核黄素悬浊液中加入盐酸或氢氧化钠溶液，调节ph稳定在6～10；
9.步骤3.超声：保持搅拌及温度为25～45℃，向核黄素悬浊液施加90～110w功率的
超声并持续2～5h，然后调整超声功率至60～90w；
10.步骤4.酶解：保持温度稳定为25～45℃、ph稳定为6～10、超声功率稳定为60～90w，向核黄素悬浊液内加入全能核酸酶进行酶解反应，所述加入的全能核酸酶与核黄素粗品的比例为1：103～1：107，至反应完成；
11.步骤5.再调ph：依据步骤2的ph调节结果向核黄素悬浊液中加入盐酸或硫酸溶液，调节ph稳定在3～5；
12.步骤6.超声：保持搅拌及温度为25～45℃，向核黄素悬浊液施加100～200w功率的超声并持续1～2h，然后调整超声功率；
13.步骤7.再酶解：调整温度稳定至50～70℃，并保持ph稳定为3～5、超声功率稳定为100～200w，向核黄素悬浊液内加入5'-磷酸二酯酶进行酶解反应，所述加入的5'-磷酸二酯酶与核黄素粗品的比例为1：103～1：107，至反应完成；
14.步骤8.过滤：酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼；
15.步骤9.喷雾干燥：将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。
16.而且，步骤1中核黄素粗品为发酵液经过酸化、碱溶、离心、过滤，去除了菌体及大部分蛋白质、核酸等杂质，但未精制的核黄素。
17.而且，步骤1中核黄素粗品与水的比例为1：50～1：10。
18.而且，步骤4中反应完成所需时间为3～6h。
19.而且，步骤7中反应完成所需时间为2～3h。
20.与现有技术相比，本发明技术方案所具有的有益效果在于：
21.(1)本发明所提供的核黄素粗品的酶催化去除残留dna工艺，利用酶催化分解核酸的高效能力，结合适宜的反应条件，可以高效、清洁的去除核黄素产品中的转基因成分残留，提高安全性，扩大销售市场，提高了相关企业在核黄素市场的竞争力；
22.(2)利用全能核酸酶与5'-磷酸二酯酶不同的酶解特性，用不同的反应条件来最大化发挥其酶解效果，去除核黄素产品中的转基因成分残留，其中全能核酸酶在温度25～45℃、ph6～10、超声功率60～90w的条件下酶解效果最好，可将核酸降解成2～5个碱基的核苷酸，随后再用5'-磷酸二酯酶在温度50～70℃，ph3～5、超声功率100～200w的条件下，最大化利用其水解环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷的功能将2～5个碱基的核苷酸断裂成单核苷酸，配合实现去除核黄素中的所有残留dna的作用；
23.(3)步骤3及步骤6中给保持搅拌及温度的核黄素悬浊液施加一定功率的超声能改变核黄素悬浊液的物理性状，使其更适合进行后续步骤4及步骤7的酶解反应。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明进一步说明。
25.实施例1
26.将2kg核黄素粗品加入到100l水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到25℃；检测核黄素悬浊液ph为4.3，加入氢氧化钠溶液调ph到7；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在90w的超声波3h，然后调节超声功率到60w；保持温度在25℃，ph为到7，超声功率为60w，向核黄素悬浊液内加入2ml浓度100mg/l全能核酸酶进行酶解反应3h；酶解反应
完后，再加入硫酸溶液调ph到3；保持搅拌及温度25℃，向核黄素悬浊液施加功率在150w的超声波2h，然后调节超声功率到100w；调节温度到55℃，ph为到3，超声功率为100w，再向核黄素悬浊液内加入2ml浓度100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应2h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
27.实施例2
28.将50kg核黄素粗品加入到1500l水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到35℃；检测核黄素悬浊液ph为5.2，加入氢氧化钠溶液调ph到8；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在100w的超声波4h，然后调节超声功率到70w；保持温度在35℃，ph为到8，超声功率为70w，向核黄素悬浊液内加入100ml浓度100mg/l的全能核酸酶进行酶解反应5h；酶解反应完后，再加入盐酸溶液调ph到4；保持搅拌及温度35℃，向核黄素悬浊液施加功率在160w的超声波2h，然后调节超声功率到120w；调节温度到60℃，ph为到4，超声功率为120w，再向核黄素悬浊液内加入100ml浓度100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应3h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
29.实施例3
30.将1吨核黄素粗品加入到10吨水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，并调整温度到45℃；检测核黄素悬浊液ph为3.3，加入氢氧化钠溶液调ph到6；保持搅拌及温度，向核黄素悬浊液施加功率在110w的超声波5h，然后调节超声功率到90w；保持温度在45℃，ph为到6，超声功率为90w，向核黄素悬浊液内加入5l浓度为100mg/l的全能核酸酶进行酶解反应6h；酶解反应完后，再加入盐酸溶液调ph到5；保持搅拌及温度45℃，向核黄素悬浊液施加功率在200w的超声波2h，然后调节超声功率到160w；调节温度到70℃，ph为到5，超声功率为160w，再向核黄素悬浊液内加入5l浓度为100mg/l的5'-磷酸二酯酶进行酶解反应3h；酶解反应完后，将核黄素悬浊液过滤，收集滤饼，将滤饼加入到水中，搅拌均匀形成核黄素悬浊液，再进行喷雾干燥，得到核黄素成品。将核黄素粗品及成品分别进行q-pcr检测，粗品检出转基因成分，成品未检出转基因成分。
再多了解一些
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