一种蛇婆子子叶愈伤组织的诱导方法与流程

1.本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种蛇婆子子叶愈伤组织的诱导方法。


背景技术：

2.蛇婆子(waltheria indica l.sterculiaceae)属于梧桐科(sterculiaceae)蛇婆子属waltheria)，是一种略直立或匍匐状半灌木，广泛分布于非洲、南美和东南亚等热带和亚热带地区。主要分布于福建、台湾、广东、海南、广西、云南等地。研究发现蛇婆子含黄酮类化合物、生物碱和萜类等60多种化合物。蛇婆子具抗炎、抗菌、抗锥虫病、抗癌等作用。另外，其次生代谢物waltherione a具有抗根结线虫活性，具有很强农用活性。
3.愈伤组织是组织培养最常见的一种培养形式，愈伤组织是原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤组织培养具有多种用途，一方面可研究植物生长发育及分化的机制进行基因遗传转化，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良、种质保存和有用化合物生产的理想途径。
4.在蛇婆子的正常生长发育过程中，喹诺酮类生物碱主要集中在茎中，其产生量难以满足日益增长的药用需求，因此利用组培技术建立愈伤体系从而产生大量的次生代谢物质已成为研究热点。然而在植物组织中喹诺酮类生物碱的含量相对较低。建立高效的蛇婆子组织培养快速繁殖系统能够有效地解决喹诺酮类生物碱的自然资源短缺问题。然而现有蛇婆子组织培养技术还处于起步阶段，有关蛇婆子组织培养的报道很少，还存在蛇婆子愈伤组织的诱导率低、愈伤组织质量较差、活性物质含量较低等问题，严重制约了蛇婆子组织培养快速繁殖的研究进展。因此，建立高效的诱导蛇婆子外植体形成愈伤组织的组培体系，对加速蛇婆子育种及提高喹诺酮类生物碱含量都具有重要意义。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明提供一种蛇婆子子叶愈伤组织的诱导方法。
6.本发明技术方案主要包括以下内容：
7.一种蛇婆子子叶愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：
8.取外植体，在0.5～2.0mg/l 2，4-d的第一培养基上进行培养，得到松散型愈伤组织；将松散型愈伤组织转接到含有0.05～0.4mg/lα-萘乙酸的第二培养基上进行培养，即获得含有喹啉酮生物碱waltherione a的愈伤组织。
9.优选的，所述外植体包括蛇婆子叶片。本发明实施例中采用的是生长40-50d的蛇婆子子叶。
10.优选的，在第一培养基上培养的时间是5周。
11.优选的，在第二培养基上培养的时间是至少15d。
12.优选的，所述第一培养基为在基础培养基中添加6-ba、α-萘乙酸和0.5～2.0mg/l 2，4-d。
13.优选的，所述第二培养基为在基础培养基中添加naa、蔗糖和0.05～0.4mg/lα-萘乙酸。
14.更优选的，所述第一培养基为在基础培养基中添加1.0mg/l 6-ba、0.2mg/lα-萘乙酸和1.0mg/l 2，4-d。
15.更优选的，所述第二培养基为在基础培养基中添加0.1～0.2mg/lα-萘乙酸、0.1mg/l naa和30g/l蔗糖。
16.优选的，培养的条件是：温度26-28℃，光周期l/d为16/8h，相对湿度70％。
17.综合本发明的研究成果，提供一套可获得大量愈伤组织且含有较多waltherione a的蛇婆子子叶愈伤组织的诱导方法。其最优的操作方案如下：取蛇婆子叶片为外植体，在ms 1.0mg/l 6-ba 0.2mg/lα-萘乙酸 1.0mg/l 2，4-d的培养基上培养，培养到第5周有大量愈伤组织产生；将松散型愈伤组织转接到ms 0.1mg/l naa 30g/l蔗糖的培养基上，经过15d培养，即可获得大量愈伤组织且含有较多waltherione a。
18.本发明所取得的效果：
19.本发明提供了一种蛇婆子子叶愈伤组织诱导方法，该诱导方法能够显著提高蛇婆子子叶产生愈伤组织，愈伤组织诱导率为85～93.4％，得到较好效果
附图说明
20.图1α-萘乙酸对蛇婆子愈伤组织影响；a:0.05mg/l；b:0.1mg/l；c:0.2mg/l；d:0.4mg/l。
21.图2α-萘乙酸对蛇婆子愈伤组织和waltherione a含量影响。
具体实施方式
22.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
23.实施例1蛇婆子子叶愈伤组织的诱导
24.1.植物材料的获得
25.1.1土壤消毒：播种前将土壤高温灭菌30min，有效杀灭土壤土传病害。
26.1.2培养土的培植：土壤消毒后置于通风处放置2-3d即可用于配制培养土。按照灭菌后的土壤与蛭石1:1的比例配制培养土，混合均匀后备用。
27.1.3播种与幼苗管理：蛇婆子种子采集于海南省昌江黎族自治县昌江湿地公园。选择生长状况良好的植株作为采种母株，采来的种子除去树叶、石块杂物后置于阴凉通风处储存备用，播种前用清水漂洗干净种子，然后用50-55℃温水浸泡24-48h，使种子充分吸水膨胀后即可点播于穴盘培养，种子点播后用喷壶喷水，保存土壤湿度，置于基地温室进行培养，光照采用自然光。
28.2.外植体的消毒方法：将生长40-50d的蛇婆子子叶在流水中冲洗2-3h，在超净工作台上，用75％酒精消毒40s后置于0.1％升汞溶液中消毒6-8min，并用无菌水冲洗5-6次；
29.3.接种：将无菌蛇婆子子叶切成1
×
1cm小块，接种于ms 1.0mg/l 6-ba 0.2mg/lα-萘乙酸 0mg/l 2，4-d培养基中，每瓶1块，接种10瓶。培养条件为：温度26-28℃，光周期l/d
＝16/8h，相对湿度70％。
30.从开始培养到褐化、死亡，叶片外围有极少量愈伤组织产生，愈伤组织诱导率为5～10％。
31.实施例2蛇婆子子叶愈伤组织的诱导
32.1外植体选择：选取实施例1外植体
33.2.接种：将无菌蛇婆子子叶切成1
×
1cm小块，接种于ms 1.0mg/l 6-ba 0.2mg/lα-萘乙酸 0.5mg/l 2，4-d培养基中，每瓶1块，接种10瓶。培养条件为：温度26-28℃，光周期l/d＝16/8h，相对湿度70％。
34.从开始培养到褐化、死亡，叶片外围有少量愈伤组织产生，愈伤组织诱导率为25～30％。
35.实施例3蛇婆子子叶愈伤组织的诱导
36.1外植体选择：选取实施例1外植体
37.2.接种：将无菌蛇婆子子叶切成1
×
1cm小块，接种于ms 1.0mg/l 6-ba 0.2mg/lα-萘乙酸 1.0mg/l 2，4-d培养基中，每瓶1块，接种10瓶。培养条件为：温度26-28℃，光周期l/d＝16/8h，相对湿度70％。
38.从开始培养到褐化、死亡，叶片外围有大量愈伤组织产生，愈伤组织诱导率为85～90％。
39.实施例4蛇婆子子叶愈伤组织的诱导
40.1外植体选择：选取实施例1外植体
41.2.接种：将无菌蛇婆子子叶切成1
×
1cm小块，接种于ms 1.0mg/l 6-ba 0.2mg/lα-萘乙酸 2.0mg/l 2，4-d培养基中，每瓶1块，接种10瓶。培养条件为：温度26-28℃，光周期l/d＝16/8h，相对湿度70％。
42.从开始培养到褐化、死亡，叶片外围有少量愈伤组织产生，愈伤组织诱导率为23～27％。
43.实施例5蛇婆子愈伤组织扩繁
44.1愈伤组织选择：选择实施例3愈伤组织
45.2接种：将1g左右愈伤组织接种到含有不同浓度α-萘乙酸 30g/l蔗糖的ms培养基中，每处理15瓶。培养条件为：温度26-28℃，光周期l/d＝16/8h，相对湿度70％。培养15d后称量每瓶中愈伤组织的重量并测定愈伤组织中waltherione a含量。waltherione a含量的测定方法为：采用高效液相色谱法，hypersil c18色谱柱，进样体积10.0μl；柱温30℃；流动相：v(甲醇)：v(水)＝50:50，流速1.0ml/min；经孔径0.22μm的滤膜过滤；检测波长254nm；保留时间约14.38min。
46.3结果：不同浓度的α-萘乙酸对蛇婆子愈伤组织诱导无明显差异，而对蛇婆子主要化合物waltherione a含量有明显差异，随着α-萘乙酸浓度增加，waltherione a含量呈现先上升后下降的趋势，具体情况见图1和图2。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。