一种发酵法制取大豆异黄酮苷元的方法与流程

1.本发明涉及一种发酵法制取大豆异黄酮苷元的制备方法以及一种大豆异黄酮苷元的制备方法。


背景技术：

2.大豆异黄酮是黄酮类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此大豆异黄酮又称植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。
3.大豆异黄酮(soy isoflavone)是一种植物化学素，属植物黄酮类，主要来源于豆科植物的荚豆类，大豆中的含量较高，为0.1％-0.5％。主要是指3-苯并吡喃酮为母核的化合物，大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，可以分为3类，即黄豆苷类(daidzingroups)、染料木苷类(genistingroups)、黄豆黄素苷类(glycitingroups)。每类以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在。游离型的苷元(aglycon)占总量的2％-3％，包括染料木黄酮(genistein)、黄豆苷元(daidzein)和黄豆黄素(glycitei n)。结合型的糖苷(glycosides)占总量的97％-98％，主要以染料木苷(geniste in)和黄豆苷(daidzin)及丙二酰染料木苷(6
′‑
o-ma-1onylgenistin)和丙二酰黄豆苷(6
′‑
o-malonyldaid-zin)形式存在，约占总量的95％。种植环境、加工方法、遗传因素等对大豆异黄酮的含量和成分有一定影响，表现为不同大豆品种中异黄酮总量及各组分比例的差异。
4.大豆异黄酮的主要结构形式是3-苯并吡喃酮为母核的化合物群。天然的大豆异黄酮主要分为游离型的苷元和结合型的糖苷两种。其中，结合型糖苷由酶或稀酸水解脱去糖基，可形成大豆异黄酮苷元。游离型大豆异黄酮苷元包括染料木苷元、大豆苷元和黄豆苷元。结合型大豆异黄酮糖苷分别为上述3种苷元的葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型。
5.目前，大豆异黄酮的生产方法如下：a、提取：多功能提取罐乙醇多次提取、合并提取液浓缩，得粗提物；b、粗提物用大量的水稀释后用树脂柱吸附、用高浓度乙醇解吸，得解析液，合并浓缩解析液得解析液水溶液；c、解析液水溶液结晶后离心得产品。此项工艺生产较简单，但得成品含量较低，并在此生产过程中产生大量污水。对环境保护带来不利的影响。
6.大豆异黄酮糖苷只有转化为大豆异黄酮苷元才能被吸收进入体内发挥作用，尽管大豆异黄酮对人体健康的功效受到高度关注，但由于大豆异黄酮苷元活性苷元在大豆异黄酮中所占比例少，分离纯化难度大、产率低、成本高。
7.目前，转化大豆异黄酮糖苷为大豆异黄酮苷元的方法主要有酸水解法和酶水解法两种。酸水解法要求温度高，水解反应缺乏专一性，除水解糖苷键外也能破坏异黄酮上的其它基团，造成异黄酮苷元结构不稳定引起活性消失，并且酸水解会对环境产生污染，所以酸
水解法研究虽多，但应用效果并不理想。酶水解法是用β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的β-糖苷键生成大豆异黄酮苷元，水解反应具有β-糖苷键专一性的优点，但是，该方法一方面还停留在研究游离酶水解异黄酮糖苷阶段，酶稳定性差，需要产β-葡萄糖苷酶的微生物菌株。另一方面大豆异黄酮苷元产品的转化率及纯度较低。cn200910116404.6公开了一种磁性纳米固定化酶催化生产大豆异黄酮苷元的方法，该方法通过磁性纳米固定化酶将大豆异黄酮糖苷转化为大豆异黄酮苷元，但是转化率低，大豆异黄酮苷元产品纯度低。


技术实现要素：

8.基于上述问题，本发明提供一种发酵法制取大豆异黄酮苷元的方法，该方法制取的大豆异黄酮苷元的含量及转化率高。
9.一种发酵法制取大豆异黄酮苷元的方法，包括以下步骤：
10.s21,取大豆异黄酮、水和转化复合酶；
11.s22,用水稀释大豆异黄酮，稀释液用酸调ph，加入转化复合酶，酶解得浸膏；
12.s23,浸膏灭活；
13.s24,灭活后的浸膏用板框过滤器过滤得滤饼；
14.s25,将滤饼干燥，干燥后的物料粉碎。
15.进一步地，所述转化复合酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶的混合物，内切葡聚糖酶：外切葡聚糖酶：葡萄糖苷酶重量比为0.01-99.5：0.01-99.5：0.01-99.5。
16.进一步地，所述s22中，ph为2-6。
17.进一步地，所述酶解温度为20-70℃，酶解时间为24-72h。
18.本发明还提供一种大豆异黄酮苷元的制备方法。
19.一种大豆异黄酮苷元的制备方法，包括以下步骤：
20.s1，萃取液浸膏的制取：
21.s11,取大豆的脱脂胚芽和乙醇，将大豆的脱脂胚芽和乙醇送入连续逆流提取设备进行连续逆流提取，，得提取液；
22.s12,将提取液在浓缩回收乙醇，得提取浸膏；
23.s13,用乙酸乙酯萃取提取浸膏，得萃取液浸膏；
24.s14,将萃取液浸膏干燥，获得大豆异黄酮；
25.s2，大豆异黄酮苷元的制取：
26.s21,取s13制备的萃取液浸膏、纯化水和转化复合酶；
27.s22,用纯化水稀释萃取液浸膏，稀释液用酸调ph，加入转化复合酶，在下，得浸膏；
28.s23,浸膏灭活；
29.s24,灭活后的浸膏用板框过滤器过滤得滤饼；
30.s25,将滤饼干燥，干燥后的物料粉碎。
31.进一步地，所述转化复合酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶的混合物，内切葡聚糖酶：外切葡聚糖酶：葡萄糖苷酶重量比为0.01-99.5：0.01-99.5：0.01-99.5。
32.进一步地，所述s22中，ph为2-6，酶解温度为20-70℃，酶解时间为24-72h。
33.进一步地，所述s11中，连续逆流提取的提取时间为2-10h。
34.进一步地，所述连续逆流提取温度为控制在40-70℃；所述s12中，浓缩回收温度为
60-80℃。
35.进一步地，述s13中，萃取温度为55-60℃。
36.发明原理及有益效果：
37.本发明在提取阶段，通过连续逆流方式提取大豆的脱脂胚芽提高大豆异黄酮糖苷的提取率；在转化阶段，通过转化复合酶将大豆异黄酮转化为大豆异黄酮苷元，其中，内切葡聚糖酶将纤维素降解成无定型纤维素，外切葡聚糖酶将无定型纤维素水解成纤维寡糖，葡萄糖苷酶将纤维寡糖水解成单糖，去掉大豆异黄酮配糖基上的糖基，大豆异黄酮苷元转化率达99.5％以上、大豆异黄酮苷元产品纯度90％以上。
具体实施方式
38.下面将对本发明作进一步说明。
39.本具体实施方式中，乙醇为市场购买的95％的乙醇。
40.一种大豆异黄酮苷元产品的方法，包括以下步骤：
41.s1，萃取液浸膏的制取，包括以下步骤：
42.s11,取大豆的脱脂胚芽和乙醇(乙醇作为提取剂)，将大豆的脱脂胚芽和乙醇送入连续逆流提取设备进行连续逆流提取，提取时间为2-10h，连续逆流提取设备温度控制在40-70℃，得提取液。
43.s12,将提取液在60-80℃下浓缩回收乙醇，得提取浸膏，提取浸膏取样检测，大豆异黄酮。
44.s13,用乙酸乙酯萃取提取浸膏，萃取温度为55-60℃，萃取3次，合并浓缩萃取液，得萃取液浸膏。
45.s2，大豆异黄酮苷元的制取，包括以下步骤：
46.s21,取s13制备的萃取液浸膏、纯化水和转化复合酶(转化复合酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶的混合物，内切葡聚糖酶：外切葡聚糖酶：葡萄糖苷酶重量比为0.01-99.5：0.01-99.5：0.01-99.5)。
47.s22,用纯化水稀释萃取液浸膏，稀释液用酸调ph至2-6，加入转化复合酶，在20-70℃下酶解24-72h。
48.s23,酶解后升温到80-100℃条件下1-3h使转化复合酶失去活性。
49.s24,失活后的浸膏用板框过滤器过滤得滤饼。
50.s25,将滤饼干燥，干燥后的物料粉碎得大豆异黄酮苷元产品。
51.s12中，提取浸膏的大豆异黄酮含量≥6％，大豆异黄酮提取率≥99.2％。
52.s13中，萃取液浸膏的大豆异黄酮含量为80-90％，苷元大豆异黄酮苷元为含量在2-3％。
53.s25中，大豆异黄酮苷元产品的大豆异黄酮苷元含量为90-98.5％，转化率为99.5-99.8％。
54.实施例1萃取液浸膏的制取
55.①
取东北非转基因大豆的脱脂胚芽100g和600ml乙醇(乙醇作为提取剂)，将东北非转基因大豆的脱脂胚芽和乙醇送入连续逆流提取设备进行连续逆流提取，连续逆流提取设备温度控制在50℃，得提取液。
56.连续逆流提取时间为9h。
57.②
将提取液在70℃下浓缩回收乙醇，得提取浸膏，提取浸膏取样检测，大豆异黄酮含量6.18％，大豆异黄酮提取率99.5％。
58.③
用200ml乙酸乙酯萃取提取浸膏，萃取温度为55-60℃，萃取3次，合并浓缩萃取液，得萃取液浸膏。萃取液浸膏取样检测，大豆异黄酮含量为88.96％，苷元大豆异黄酮苷元为含量在2.05％。
59.本实施例中，
②
浓缩回收的乙醇可以重复作为提取液使用。
60.实施例2
61.将实施例1制备的萃取液浸膏离心分离，干燥，获得大豆异黄酮产品。
62.实施例3大豆异黄酮苷元的制取
63.①
取东北非转基因大豆的脱脂胚芽100g和600ml乙醇(乙醇作为提取剂)，将东北非转基因大豆的脱脂胚芽和乙醇送入连续逆流提取设备进行连续逆流提取，连续逆流提取设备温度控制在50℃，得提取液。
64.连续逆流提取时间为10h。
65.②
将提取液在70℃下浓缩回收乙醇，得提取浸膏，提取浸膏取样检测，大豆异黄酮含量6.23％，大豆异黄酮提取率99.6％。
66.③
用200ml乙酸乙酯萃取提取浸膏，萃取温度为55-60℃，萃取3次，合并浓缩萃取液，得萃取液浸膏。萃取液浸膏取样检测，大豆异黄酮含量为88.86％，苷元大豆异黄酮苷元为含量在2.01％。
67.④
取
③
制备的萃取液浸膏、萃取液浸膏5倍重量的纯化水和萃取液浸膏重量8
‰
的转化复合酶(转化复合酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶的混合物，内切葡聚糖酶：外切葡聚糖酶：葡萄糖苷酶重量比为0.01-99.5：0.01-99.5：0.01-99.5)。
68.⑤
用纯化水稀释萃取液浸膏，稀释液用酸调ph至2-6，加入转化复合酶，在50℃下酶解24。
69.⑥
酶解后升温到80-100℃条件下1-3h使转化复合酶失去活性。
70.⑦
失活后的浸膏用板框过滤器过滤得滤饼。
71.⑧
将滤饼干燥，干燥后的物料粉碎得大豆异黄酮苷元产品，大豆异黄酮苷元产品取样检测，大豆异黄酮苷元含量为96.48％，转化率为9.6％。
72.对比实施例1
73.①
取东北非转基因大豆的脱脂胚芽100g和600ml乙醇(乙醇作为提取剂)，将东北非转基因大豆的脱脂胚芽和乙醇送入提取罐，提取罐设备温度控制在50℃，提取时间10h，得提取液。
74.②
将提取液在70℃下浓缩回收乙醇，得提取浸膏，提取浸膏取样检测，大豆异黄酮含量4.86％，大豆异黄酮提取率91.4％。
75.③
用200ml乙酸乙酯萃取提取浸膏，萃取温度为55-60℃，萃取3次，合并浓缩萃取液，得萃取液浸膏。萃取液浸膏取样检测，大豆异黄酮含量为48.7％，苷元大豆异黄酮苷元为含量在2.04％。
76.对比实施例2
77.①
取东北非转基因大豆的脱脂胚芽100g和600ml乙醇(乙醇作为萃取剂)，将东北
非转基因大豆的脱脂胚芽和乙醇充分润湿后放入超临界流体萃取装置的萃取釜中萃取，萃取压力30mpa，萃取温度50℃，二氧化碳流量6l/h，萃取时间10小时，得初萃取液。
78.②
将初萃取液在70℃下浓缩回收乙醇，得初萃取浸膏，初萃取浸膏提取样检测，大豆异黄酮含量4.78％，大豆异黄酮提取率90.4％。
79.③
用200g乙酸乙酯萃取初提取浸膏，萃取温度为55-60℃，萃取3次，合并浓缩萃取液，得萃取液浸膏。该萃取液浸膏取样检测，大豆异黄酮含量为47.5％，苷元大豆异黄酮苷元为含量在2.12％。
80.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。