一种肾形虫种株长期保种及快速复苏的方法与流程

1.本发明属于功能物种种质资源长期保藏领域，具体涉及一种肾形虫种株长期保种及快速复苏的方法利，用0.22μm微孔滤膜对肾形虫种株进行长期保存和保种后利用蒸馏水和灭菌麦粒对样品进行复苏的方法。


背景技术：

2.现有技术报道的自由生纤毛虫的保种方法中的物种、保种方法、保种目的及效果如下表：
[0003][0004]
现有的保种方法存在的主要缺陷包括：
[0005]
(1)尚未建立一种针对肾形虫的长期保种和高效复苏方法。
[0006]
(2)以往采用自由生纤毛虫通用的保种方式，对仪器和条件要求较高，稳定性差，保种时间短，需要定期维护和反复复苏以保持活性；
[0007]
(3)以往的保种方式对运输条件要求高，不耐受长距离和高温及低温环境。
[0008]
原生动物的物种保存工作至关重要，是所有以原生动物为实验材料的科研工作的重要前提，目前已有的纤毛虫通用保种方法对肾形虫种株的保种效果并不理想，如何便捷高效的对肾形虫种株进行长期保存和迅速复苏为本发明需要解决的问题。


技术实现要素：

[0009]
鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了利用0.22μm微孔滤膜对肾形虫种株进行长期保存和保种后利用蒸馏水和灭菌麦粒对样品进行复苏的方法。
[0010]
本发明通过以下技术方案来实现：
[0011]
一种肾形虫虫株长期保种方法，其他在于，包括：
[0012]
(1)肾形虫的培养，挑取单个细胞进行单克隆培养，培养至对数生长期进行保种；
[0013]
(2)选取0.22μm微孔滤膜作为保种介质；
[0014]
(3)将0.22μm微孔滤膜置于过滤器上，将一定体积的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，取下滤膜，待干后，置于容器中保存。
[0015]
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)包括：可于有机质含量丰富的土壤中采集土样，利用“非淹没培养法”孵化土壤中的肾形虫，96小时后在体式显微镜下利用微吸管挑取肾形虫单个细胞。
[0016]
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)包括：挑取单个细胞后，在24孔板中每孔添加1ml蒸馏水和一颗麦粒，于20～25℃的恒温恒湿培养箱中建立单克隆培养系，72小时后将24孔板各孔的同种肾形虫混合转移至六孔板，每孔倒入10ml蒸馏水并加两颗灭菌后的麦粒，20～25℃的恒温恒湿培养箱中进行大量纯培养72小时，取对数生长期的虫体培养液进行保种。
[0017]
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)包括：将0.22μm微孔滤膜进行裁剪至和过滤装置的型号匹配的尺寸，后将0.22μm滤膜置于超净工作台中进行紫外灭菌20min后再进行保种。
[0018]
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(3)包括：取下滤膜，室温条件自然风干后，将滤膜折叠好置于离心管中，室温条件保存。
[0019]
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(3)包括：将0.22μm微孔滤膜置于过滤器上，将体积为10ml的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，用镊子取下微孔滤膜，室温条件下自然风干1小时，将风干后的滤膜折叠好置于15ml离心管中，室温条件保存。
[0020]
本发明进一步提供了一种肾形虫虫株快速复苏方法，将前述方法保护的肾形虫虫株，进一步通过步骤(4)复苏，步骤(4)包括：在肾形虫种株复苏时，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将附着虫体的微孔滤膜置于六孔板中，20-25℃恒温恒湿培养箱中培养96小时，镜检观察。
[0021]
作为本发明的一种优选技术方案，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将附着虫体的微孔滤膜置于六孔板中，20-25℃恒温恒湿培养箱中培养24小时，镜检观察虫体生长状态，继续培养至72小时肾形虫达到最大种群密度。
[0022]
作为本发明的一种优选技术方案，滤膜为0.22μm的混合纤维素(mce)微孔滤膜。
[0023]
通过大量的试验研究发现：利用规格为0.22μm的混合纤维素(mce)微孔滤膜保种14天、28天和170天三个时间点样品的复苏生长曲线都在72小时群密度达到最大，微孔滤膜保种效果受保种时间长度和保种温度的影响不显著，微孔滤膜可对肾形虫种株在室温条件下进行长期稳定的保种。
[0024]
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
[0025]
1)建立了一种适用于肾形虫种株的保种及复苏方法，有效解决了常规的4℃恒温恒湿培养箱肾形虫保种难度大、复苏时间长及远距运输不便等问题；
[0026]
2)该方法包括利用微孔滤膜作为保种介质对肾形虫进行低成本保种方法和利用蒸馏水进行复苏的便捷方法；
[0027]
3)该方法的复苏效率高，且不受时间和温度的限制，使虫体密度在72小时达到最大种群密度，且生长状态较好。
附图说明
[0028]
图1.本发明肾形虫虫株长期保种及快速复苏的方法过程示意图；
[0029]
图2.微孔滤膜4℃保种后复苏的生长曲线；
[0030]
图3.微孔滤膜常温保种后复苏的生长曲线；
[0031]
图4.微孔滤膜不同保种温度及时间的复苏效果差异显著性分析；
具体实施方式
[0032]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0033]
实施例1
[0034]
参照图1的制备过程：
[0035]
1.材料与方法
[0036]
1.1膨胀肾形虫(colpoda inflata)
[0037]
本实验选择了肾形虫属模式物种膨胀肾形虫为实验生物。水陆两生型原生动物，广泛分布于全球的土壤、江河湖泊及海洋等各种生境中，具有特殊的包囊生殖方式，是毒理学和细胞生物学的理想实验材料。
[0038]
1.2虫株的培养
[0039]
挑取单个细胞，小麦粒培养液，20-25℃的恒温恒湿培养箱中建立单克隆培养体系，后进行大量纯培养，取对数生长期的虫液进行物种保存。
[0040]
1.3虫株的保存
[0041]
根据过滤器的型号大小对微孔滤膜和定性滤纸进行裁剪后，将0.22μm微孔滤膜(0.22μm的混合纤维素(mce)微孔滤膜)平铺于过滤器上，取一定体积的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，用镊子取下滤膜，室温条件自然风干1小时后，将滤膜折叠好置于15ml离心管中，室温和4℃条件分别进行保存。
[0042]
1.4虫株的复苏
[0043]
在肾形虫种株复苏时，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将室温和4℃条件下附有虫体的微孔滤膜平铺在六孔板中，于20-25℃恒温恒湿培养箱中培养96小时，镜检观察并计数。
[0044]
1.4数据分析
[0045]
将记录所得生长数据利用excel进行整理，根据下式计算原生动物的种群增长率r＝(ln n
t-ln n0)/t,式中n0、n
t
，分别为实验开始时和t时某种原生动物的个体数。由计算的r值便可得出该种原生动物种群的自然增长方程，再按g＝ln 2/r计算世代时间。利用spss进行差异显著性分析，利用origin进行生长曲线图的绘制。
[0046]
2.结果
[0047]
2.1保种介质的选择
[0048]
保种时选择了微孔滤膜(0.22μm的混合纤维素(mce)微孔滤膜)、定性滤纸和聚酯
海绵块(1m3)三种材料为介质，三种保种介质的过滤时间和保种复苏7天、14天和28天时nt在72小时时刻的种群密度进行分析(表1)，定性滤纸进行虫体过滤时间约为微孔滤膜的7倍，而聚酯海绵块的吸水时间长达12小时，约为微孔滤膜的20倍，从保种后复苏效果来看，微孔滤膜的效果最佳，且过滤用时最短，是较为理想的保种介质。
[0049]
表1三种保种介质的过滤时间和复苏后的48小时的虫体细胞密度比较
[0050][0051]
2.2微孔滤膜4℃的保种效果验证
[0052]
选取4℃保种时间为14天、28天和170天三个时间点的滤膜样品进行复苏，统计虫体变化量绘制生长曲线。
[0053]
三个保种时间点样品的复苏生长曲线(图2)都在72小时种群密度达到最大值，虫体密度在3867-4334cells/ml之间，96小时种群密度显著降低；
[0054]
上述结果表明，半年内微孔滤膜4℃下保种时间不会对虫体复苏效果产生显著影响，微孔滤膜可对肾形虫虫株进行长期稳定的保种。
[0055]
2.3微孔滤膜常温条件的保种效果验证
[0056]
选取保种时间为14天、28天和170天三个时间点的保种样品进行复苏，统计虫体变化量绘制生长曲线。
[0057]
三个保种时间点滤膜样品的复苏生长曲线(图3)都在72小时达到最大的种群密度，该时刻的种群密度在3600-4134cells/ml之间，后种群密度呈下降趋势；
[0058]
上述结果表明，半年内微孔滤膜常温下的保种时间不会对虫体复苏效果产生显著影响，微孔滤膜可对肾形虫种株进行长期稳定的保种。
[0059]
2.4两种温度条件和对保种效果影响的比较
[0060]
微孔滤膜在4℃和常温条件保种后复苏的种群增长率(表2)显示，4℃保种复苏后种群增长率在0.039-0.041之间，世代时间为16.83-17.86之间，常温条件保种复苏后种群增长率为0.037-0.041之间，世代时间为16.85-18.74，三个保种时间在两种保种条件下肾形虫种群增长率结果显示(图4)微孔滤膜在14天、28天和170天两种条件下的保种效果差异不显著。
[0061]
表2三个保种时间在两种保种条件下肾形虫种群增长率(r)和世代时间(g)变化
[0062][0063]
上述结果表明，微孔滤膜是较为理想的肾形虫种株保种介质，在保种过程中不受保种时间和温度条件的限制。
[0064]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。