一种促进叶用银杏苗生长及药用有效成分积累的修剪方法与流程

1.本发明属于银杏种植技术领域，具体涉及一种促进叶用银杏苗生长及药用有效成分积累的修剪方法。


背景技术：

2.银杏(ginkgo biloba l.)又称白果树，为银杏科银杏属植物，是冰川时期存活在地球上的孑遗植物,素有“活化石”之称。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,gbe)由银杏叶片制备而成，主要成分是银杏黄酮类和萜内酯类化合物，其中黄酮类化合物在抗氧化、抗肿瘤等方面起着重要作用；银杏内酯是血小板活化因子的强拮抗剂，可以预防心血管疾病，对中枢神经系统具有保护作用。银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一。目前全球已经有130多个国家使用银杏叶制剂，国际市场对银杏叶片的需求稳定增长。但药典中对银杏叶提取物的质量标准越来越高，类黄酮和萜内酯的含量均要求达到一定的标准，而灰分含量则限制在一定水平。由于银杏幼苗叶片中含有高度活性成分，所以只有银杏播种后的实生小苗叶片主要用于生产gbe，但实生苗生长通常较弱，叶片产量低，劳动力成本高，此外由于施肥过多造成灰分超标，这些问题均限制了银杏叶作为药用原材料的销售和经济收益。
3.现有技术中一般通过改善栽培管理条件促进银杏叶片的生长和药用有效成分的积累，但是周期长，人力、物力长期投入量高。因此，有效地促进银杏叶片的生长和药用有效成分的积累，减少灰分含量，已成为银杏产业亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进叶用银杏苗生长及药用有效成分积累的修剪方法，其主要解决了对于2年生银杏苗长势弱的情况下，通过修剪提高其苗木的生长和药用有效成分的积累，从而提高其银杏苗木的产量和品质，提高经济效益。
5.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种促进叶用银杏苗生长及药用有效成分积累的修剪方法，包括如下步骤：
6.(1)选择适宜银杏生长的地方作为苗地；
7.(2)选取苗地上选择生长良好、无病虫害的银杏实生苗；
8.(3)对苗地银杏进行重剪处理；
9.(4)重剪处理进行后期栽培管理，包括定期浇水、施肥、中耕除草，以及进行病虫害防治。
10.其中，步骤(1)中选择气候湿润，四季分明，降水量和光照充足，地势开阔，土质为排水良好的优质土壤，适宜银杏生长的地方作为苗地。
11.作为优选，步骤(1)中苗地的土质为沙壤土或壤土。
12.其中，步骤(2)中选取苗地上选择生长良好、无病虫害的2年生银杏实生苗。本发明
中选用2年生苗目的是为了壮苗，对于银杏苗来说1年生苗长势太弱，三年生苗已经很茁壮了。
13.其中，步骤(3)中对苗地2年生银杏进行离地4-6cm重剪处理；优选为对苗地2年生银杏进行离地5cm重剪处理。
14.其中，步骤(3)中进行离地5cm的重剪处理，切口与水平线呈12-18
°
，切口平滑整齐；
15.进一步地，步骤(3)中重剪处理后，用红色油漆涂抹伤口，以隔绝病菌侵入。
16.其中，步骤(3)中正常生长的2年生银杏苗木作为对照植株选用30株，重剪处理过苗木选用30株，共计60株作为本发明材料。
17.其中，步骤(4)中后期栽培管理方法，方法如下：
18.1)四月上旬，中耕冬草后，使用agri-sc免深耕土壤调理剂和有机肥进行撒播施肥，将肥料翻整于地下，如遇干旱，需对苗林及时灌溉；
19.2)六月中旬，整理排水沟，防止梅雨季节和夏季强降雨，疏通水道；同时进行中耕除草，；
20.3)七月中旬，对银杏的株高、叶面积、地径等生长形态指标和单株叶产量进行测定；
21.4)八月上旬对苗林施肥，每年九月下旬开始银杏叶片的采收。
22.作为优选，所述中耕除草的除草锄土深度不超过5cm，避免伤害银杏根系，土层透气利于根系生长。
23.作为优选，所述八月上旬对苗林施肥为磷钾肥。
24.在现有技术中银杏的栽培管理，大多选择生长良好多年生的壮苗(5年以上)，目的是为了使苗木复幼。而在实际生产中2年生的银杏苗一般长势较差，本发明研究表明当进行修剪后，苗木的长势和药用品质都会显著提升。
25.本发明重点选用2年生银杏实生苗重剪处理是为了使幼苗复壮，对2年生银杏苗进行修剪处理后，苗木长势更加茁壮。本发明修剪处理可以促进银杏幼苗的生长，对2年生实生银杏苗进行修剪，会促进银杏苗生长及药用有效成分积累，满足药用生产上对银杏产量和品质的需求。该方法操作简便，成本低，简单易行，易于在生产上推广应用。
26.有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：
27.(1)本发明方法操作方便，简单易行，适合在生产上进行推广；
28.(2)相比于常规银杏的种植，修剪后的银杏苗木生长状态较好，叶片叶厚、叶面积、分枝数、地径等明显增加，总体产量都得到显著提高。
29.(3)修剪后银杏叶片灰分含量与未修剪的银杏叶片的灰分含量相比会有显著降低，更加利于药用生产上的需求。
30.(4)修剪后的银杏叶片中的药用有效成分显著增加，叶片品质更好，经济价值更高。
附图说明
31.图1为修剪后和未修剪银杏形态的变化对比，其中：a第三年的整体植株生长情况，修剪过的植株在左边，对照植株在右边，横杆代表25厘米；b-c田间修剪处理(b)和未修剪处
理(c)的植株；d-e叶片在修剪处理(d)和对照(e)处理后3年；f-g通过扫描电镜观察修剪植株(f)和对照组(g)的叶片；h处理后第三年修剪和未修剪植株，修剪植株的根在左侧，未修剪植株的根在右侧，横杆代表5厘米；i处理后第三年侧根数比较；j-l处理后3年枝条数(j)、株高(k)、地径(l)比较；m-o处理后3年叶片裂片(m)、叶面积(n)、叶厚(o)；使用小写字母表示相对于对照组在p《0.05的显著差异，其中i-j的柱形图中左边柱为control，右边柱为treatment。
32.图2修剪后和未修剪银杏叶片产量的变化对比，其中：a-e处理后3年spad值(a)、鲜叶重(b)、干叶重(c)、叶片含水量(d)、单株产量(e)比较；dw：干重，使用小写字母表示相对于对照组在p《0.05的显著差异，其中e的柱形图中左边柱为control，右边柱为treatment。
33.图3修剪后和未修剪银杏叶片灰分含量的变化对比，其中：a-f叶片总灰分(a)、钙离子(b)、镁离子(c)、磷离子(d)、钾离子(e)、铁离子(f)；使用小写字母表示相对于对照组在p《0.05的显著差异。
34.图4修剪后和未修剪银杏叶片中类黄酮积累的变化对比，其中：a-b修剪处理和未修剪处理的总黄酮含量(a)和总黄酮苷含量(b)；dw：干重，c-e处理后槲皮素(c)、山奈酚(d)、异鼠李素(e)的含量。
35.图5修剪后和未修剪银杏叶片和根系中萜内酯积累的变化对比，其中：a-e叶片修剪后第三年叶片中总萜内酯(a)、白果内酯(b)、银杏内酯a(c)、银杏内酯b(d)、银杏内酯c(e)的含量；f-j根系中总萜内酯(f)、白果内酯(g)、银杏内酯a(h)、银杏内酯b(i)、银杏内酯c(j)的含量；dw：干重，使用小写字母表示相对于对照组在p《0.05的显著差异。
36.图6修剪后和未修剪银杏叶片中类黄酮和萜类生物合成相关基因的表达对比，其中：a-q qrt-pcr分析涉及类黄酮(a-l)和萜内酯生物合成(m-q)的17个候选基因的表达量。
37.图7修剪后和未修剪银杏根中类黄酮和萜类生物合成相关基因的表达对比，其中：a-q qrt-pcr分析涉及类黄酮(a-l)和萜内酯生物合成(m-q)的17个候选基因的表达量。
具体实施方式
38.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
39.实施例1
40.1.实施方法
41.步骤一：银杏修剪种植流程
42.(1)试验地点的选择
43.试验地点选择江苏省邳州市四户镇银杏产业基地(34
°
35
′
n,117
°
59
′
e)。基地地势平坦，气候湿润，土壤肥沃，排水灌水系统良好，适宜银杏生长，苗地土质为沙壤土。
44.基肥主要选择家杂肥、绿肥、厩肥、人畜粪尿、饼肥等迟效性的有机肥，配施适量的氮磷复合肥。
45.(2)试验材料的选择
46.试验材料选择银杏基地内生长发育良好，株高、叶面积等形态相似的2年生银杏苗。
47.(3)试验材料的处理
48.于2019年1月中旬对2年生银杏苗进行离地5cm处的重剪处理，植株离地5cm以上部
位全部截掉，切口与水平线呈12-18
°
，切口平滑整齐。苗木重剪后，用红色油漆涂抹伤口，以隔绝病菌侵入，不进行重剪处理的为对照组。
49.(4)后期管理
50.后期的管理对照组和处理组保持一致，定期浇水、锄草、施肥。具体方法如下：
51.1)四月上旬，中耕冬草后，进行撒播施肥，使用agri-sc免深耕土壤调理剂200克瓶装兑水至60-100kg直接喷施于1亩面积的田地和有机肥60kg/亩，将肥料翻整于地下，在干旱期，每5-7天用水泵抽水灌溉，灌水量以灌透而地面不积水为宜，每次施肥后均灌溉一次。如遇大雨暴雨,及时排除积水,做到雨停田干。
52.2)六月中旬，整理排水沟，防止梅雨季节和夏季强降雨，疏通水道；同时进行中耕除草，除草锄土深度不超过5cm，避免伤害银杏根系，土层透气利于根系生长。
53.3)七月中旬，对苗木的株高、叶面积、地径等生长形态指标进行测定和单株叶产量。
54.4)八月上旬对苗林施肥，主要施以磷钾肥，磷钾肥组成及用量为：晶体二胺1.5kg/亩、硝酸钾1.5kg/亩、氮磷钾复合肥20kg/亩。每年九月下旬开始银杏叶片的采收。
55.实施例2
56.采收的银杏叶片的相关指标测定
57.选择实施例1中同一批次正常生长银杏作为对照植株30株(即不采用实施例1中的步骤3，无剪切处理)，实施例1中重剪处理银杏植株30株，按实施例1中的方法对照组和处理组保持一致，定期浇水、锄草、施肥。
58.在每年的7月份，对银杏植株的株高、叶面积、地径和单株叶产量等生长形态指标进行测定；对银杏叶片总灰分和灰分中离子含量进行测定：利用恒温干燥箱将叶片烘干至恒重，研磨成粉末后取1g置于马弗炉中，先400℃烧制5小时使粉末炭化，后转600℃继续烧制3小时以上直至完全灰化无炭粒，取出称重计算总灰分含量。将所得灰分利用4％盐酸进行加热溶解并稀释定容至50ml，取其中1ml上清液利用elan drc-e等离子体质谱仪定量检测银杏灰分中铁、磷、镁、钙、钾离子的含量，总灰分含量(％)＝灰分质量/干物质质量
×
100％，灰分在《中国药典(2020)》中严格规定总灰分不得超过10％。通过高效液相色法(hplc)对银杏叶片黄酮醇苷和萜内酯进行测定；对银杏干鲜重等产量指标进行数据统计；对银杏叶片和根中类黄酮和萜内酯中的关键基因进行qrt-pcr分析。采用li-6400便携式光合仪对所试银杏叶片进行光合特性测定。测定时间为中午12:00到下午3:00，每个处理组选取植株中上部长枝上成熟叶片，朝向随机。测定时先对银杏叶片进行暗适应20min，再测定相应叶绿素含量。所有数据都进行3次重复，使用excel和spss 24.0等软件进行数据统计和分析。
59.1、修剪处理对植株生长(银杏形态)的影响
60.(1)银杏植株修剪后的形态变化分析
61.如图1所示，数据统计分析发现修剪后叶片、根系和幼苗整体生长形态均发生显著变化。修剪可以产生更高的植株，更多的分枝数量，更厚的茎和更多的侧根数量(图1a-e)。其中，虽然修剪后的株高在第一年下降了17％，第二年下降了36％，但在第三年反而增加了8％(图1k)。此外，修剪后植株的地径在修剪后3年内继续增加18％、8％和35％(图1l)。同样，与对照相比，修剪后3年枝条数量也显著增加(图1j)。更为意外的是，修剪也刺激了银杏
幼苗的侧根(图1h)，修剪后侧根数量显著增加了约200％(图1i)。因此，修剪后植株的株高、地径、分枝数和须根数在处理后的每一年都有较大的增加。
62.叶片是叶用银杏幼苗的重要特征，采用本发明的实施例1的方法发现修剪后银杏叶片的形状和大小发生了显著变化(图1d-e)。与对照相比，修剪组大部分叶片出现3个叶裂，修剪后叶片叶裂增加200％(图1m)。第一年平均叶面积达到43.76cm2，第二年为70.36cm2，第三年达到64.68cm2，与对照相比显著增加(图1n)，对照组第一年约为47.7cm2，第二年为66.98cm2，第三年约56.16cm2。同样，银杏叶的厚度也随对照增加(图1o)。此外，通过扫描电镜观察了叶片下表皮上的气孔，发现修剪后的气孔比对照大，密度大(图1f，图1g)。
63.2、修剪处理对银杏叶片产量的影响
64.如图2所示，修剪处理对银杏的光合作用具有显著影响。通过测定了银杏叶片中叶绿素的相对含量，修剪处理后银杏叶片spad值显著高于对照。修剪后spad值达到38.1，是对照的1.15倍(图2a)，修剪后鲜叶重为8.76
±
0.19g，比对照增加13％(图2b)。同样，与对照相比，修剪后叶片干重为1.85
±
0.08g，增加了10％(图2c)，叶片含水量增加了9％(图2d)。修剪后第一年，单株平均叶产量为41.5g左右，而对照为61.2g左右，下降32％。而在修剪后第二年，单株平均叶产量增加到171.7g，第三年单株平均叶产量达到274.44g，远高于对照(图2e)。数据结果说明，修剪处理可以有效提高银杏植株的叶绿素、叶片含水量和叶片产量。
65.3、修剪处理对银杏叶片灰分含量的影响
66.灰分是指植物中矿质元素和氧化物的总含量。因为《中国药典(2020)》中严格规定总灰分不得超过10％。本发明检测修剪后的灰分含量，发现修剪后银杏叶片的总灰分含量相比于对照组显著下降了10％(图3a)。在灰分中检测到了5种离子，钙离子的含量是最高的，在37.36mg/g-44.52mg/g,虽然铁离子的含量是最低的,仅仅只有0.27mg/g-0.70mg/g(图3b，f)。与对照相比，修剪后钙离子的含量为43.13mg/g,增长了17％，镁离子的含量为13.68mg/g，提高了16％(图3c)，磷离子含量为18.05mg/g，提高了25％(图3d)。而钾离子含量为34.52mg/g，下降17％；铁离子含量为0.29mg/g，下降59％(图3e-f)。本实施例中钙离子、镁离子、磷离子的增长和钾离子、铁离子的下降，证明修剪有利于银杏叶片中灰分含量的下降，使叶用银杏更容易达到药用的标准，可以为田地肥料的施用起到一定的参考作用，合适的肥料施用更有利于银杏苗木的生长。
67.4、修剪处理对叶片类黄酮含量的影响
68.为了确定银杏修剪后叶片药用成分的变化，测定银杏叶片中类黄酮的含量。通过高效液相色法(hplc)对银杏叶片黄酮醇苷含量进行测定。
69.如图4所示，为了确定银杏叶修剪后药用成分的变化，测定了银杏叶中类黄酮的含量。总黄酮含量在修剪后显著增加。对照组的含量为32.08mg/g，修剪组的含量为39.79mg/g，增加了24％(图4a)。进一步检测了银杏叶中黄酮醇苷的含量，与黄酮醇苷含量对照为6.67mg/g相比，修剪后为7.99mg/g，提高了约20％(图4b)。其中，槲皮素含量对照为1.41mg/g，修剪后为1.68mg/g，增加约16％(图4c)。此外，对照组山奈酚含量为1.11mg/g，而修剪组山奈酚含量为1.31mg/g，比对照高约15％(图4d)。修剪后叶片中异鼠李素含量也显著增加。对照组为0.14mg/g，修剪组为0.18mg/g，比对照提高22％左右(图4e)。数据结果说明，修剪处理可以有效提高银杏叶片中类黄酮含量。
70.5、修剪处理对叶片和根系中萜内酯含量的影响
71.如图5所示，为了确定银杏修剪后药用成分的变化，对修剪后叶片和根系中萜内酯含量进行了测定。对照组叶片中萜内酯含量为4.45mg/g，修剪后叶片中萜内酯含量为4.79mg/g，提高了7-8％(图5a)。总萜内酯各组分中，银杏内酯b含量差异最大；对照组为1.95mg/g，修剪后为2.08mg/g(图5d)。银杏内酯a、银杏内酯c、白果内酯含量对照分别为0.84mg/g、0.15mg/g、1.52mg/g，修剪后分别为0.91mg/g、0.19mg/g、1.62mg/g(图5b
–
c，图5e)。
72.由于萜类化合物主要在根中合成，因此测定了根中萜类内酯的含量。修剪后根中总萜内酯含量为4.45mg/g，比对照组的3.19mg/g，增加了28-29％(图5f)。与对照组相比，银杏内酯a、b、c含量分别为0.70mg/g、0.75mg/g、0.75mg/g。而修剪后各组分含量分别达到0.63mg/g、0.89mg/g、1.43mg/g(图5h-j)。其中银杏内酯a含量降低，仅为对照的0.9倍。修剪组银杏内酯b、银杏内酯c含量分别增加了1.05倍和1.19倍，且修剪组白果内酯含量也显著增加(图5g)。以上结果表明，修剪处理可有效提高银杏根中萜类内酯的含量。
73.6、修剪处理后银杏叶片中类黄酮和萜类生物合成相关基因的表达对比
74.如图6所示，对银杏叶片类黄酮和萜类生物采用qrt-pcr检测，检测了8个筛选到的与类黄酮和萜类生物合成相关的关键酶基因在修剪后的动态表达变化，发现类黄酮生物合成相关基因上游gbpal和gbchs的表达水平在修剪后的叶片中显著高于对照(图6j-k)。在类黄酮代谢途径中间的3个基因gbfls、gblar和gbf3'h的表达量在叶片修剪后显著升高(图6a-c、图6g-i、图6l)。叶片中类黄酮代谢途径下游的gbanr较对照增加(图6d-f)。
75.修剪处理对银杏叶片萜内酯生物合成途径中3个关键酶基因表达影响的比较分析，在mva通路中，叶片中gbhmgr和gbaact的表达量较对照增加(图6n-q)。同时，还检测到修剪后叶片中mep通路中gbhds的下调(图6m)。
76.7、修剪处理后根中类黄酮和萜类生物合成相关基因的表达对比
77.如图7所示，修剪后根中类黄酮和萜类生物合成相关基因的表达变化不像在叶中的变化那么显著，只有少数基因表现出显著差异。其中，如类黄酮生物合成相关基因上游gbpal和gbchs，修剪处理后其表达水平甚至下降(图7j-k)。同样，除gb_12934、gbfls、gblar、gbf3'h、gbans、gbanr外，类黄酮代谢途径中下游基因gbf3h的表达量与对照组相比均无显著差异(图7a-c、图7d-f、图7g-h、图7l)。在所选的类黄酮生物合成相关基因中，只有gb_12934(gbf3h)的表达量在修剪后显著降低(图7i)。修剪处理对银杏根中萜内酯生物合成途径中3个关键酶基因表达影响的比较分析在mva和mep两条通路中，包括gbhds、gbhmgr、gbaact，这些基因的表达与对照相比无显著差异(图7m-q)。
78.综上，银杏次生代谢产物丰富，在经济树种中占有重要地位。本发明通过修剪有效刺激银杏植物营养或生殖生长和次生代谢产物积累的过程；本发明从形态学改变、叶片产量增加、类黄酮和萜类含量增加等多方面促进了银杏幼苗的生长和次生代谢产物的积累。同时还鉴定了一些与类黄酮生物合成相关的结构基因，包括gbchs、gbf3'h、gbfls等，以及与萜类生物合成相关的关键基因，gbaact在修剪处理下显著上调。此外，药用有效成分含量的的变化可能与其相关通路基因表达量的变化相关。