诺卡氏菌病的防治药物及其应用的制作方法

1.本发明属于水产养殖技术领域，涉及诺卡氏菌病的防治，具体涉及中草药提取物及其活性成分对诺卡氏菌病的防治。


背景技术：

2.诺卡氏菌病(nocardiosis)是由诺卡氏菌引起的一种人畜共患的慢性传染病，对水产养殖业和水产品安全的威胁极大。诺卡氏菌是一种广泛分布在土壤和水体环境中的革兰氏阳性菌，侵害鱼类的诺卡氏菌主要有鰤鱼诺卡氏菌(nocardia seriolae)、星状诺卡氏菌(n.asteroides)和杀鲑诺卡氏菌(n.salmonicida)。其中，鰤鱼诺卡氏菌是最常见的鱼类致病菌，能够引起淡水养殖的大口黑鲈、乌鳢、罗非鱼以及海水养殖的鰤、鲳、鲷、大黄鱼和石斑鱼等超过20种重要经济鱼类的感染。随着鱼类集约化养殖程度的提高，疾病发生日益严重，诺卡氏菌在养殖鱼类中的自然发病率可达13～30％，严重的可达60％，造成巨大的经济损失。
3.大多数致病菌为胞外菌，与胞外菌不同的是，诺卡氏菌感染鱼体后，可逃避吞噬细胞的杀灭而在胞内持久生存，导致天然免疫、抗体免疫和体液杀菌物质难以对其起作用。诺卡氏菌病是一种慢性肉芽肿性传染病，在感染早期没有明显的症状，而中后期发现时已经很难有效的治疗。因此，诺卡氏菌病是鱼类非常难以治疗、死亡率非常高的疾病，特效药物少、治疗周期长是该病主要特征。例如，诺卡氏菌感染大口黑鲈后可引起体表溃烂、鳍条充血、肌肉、鳃和内脏器官出现灰白色结节。目前主要的治疗手段为抗生素药物，但由于用药疗程长，容易导致耐药性的产生，同时抗生素残留也会引起环境和食品安全问题，因此急需安全有效且环境友好的防治方法。
4.中草药以及来源于中草药的天然产物具有易降解，活性功能丰富和不易产生耐药性等优点，将中草药或其天然化合物作为药物或饲料添加剂，在鱼类病害防治中应该具有很大的优势。厚朴(magnolia officinalis rehd.etwils)是药食同源目录中的中草药，兼具药性和可食性，具有抗炎、抗菌、杀虫、抗病毒等多种药理作用。因此，开发以厚朴提取物或其活性成分的水产养殖用药物，替代或部分替代抗生素的使用，对促进水产养殖业健康发展具有重要的意义。


技术实现要素：

5.目前尚未有厚朴提取物及其活性成分厚朴酚与和厚朴酚抗胞内菌诺卡氏菌药理作用的相关报道。本发明的目的在于探索厚朴提取物及其活性成分对诺卡氏菌的抑菌效果，开发以厚朴提取物或其活性成分厚朴酚、和厚朴酚为抑菌(杀菌)成分的可替代抗生素的药物。
6.基于上述目的，本发明提供了一种诺卡氏菌抑菌组合物，所述组合物对诺卡氏菌抑菌的有效成分包括厚朴提取物，或厚朴提取物与厚朴酚的组合，或厚朴提取物与和厚朴酚的组合，或厚朴提取物与厚朴酚、和厚朴酚的组合。
7.厚朴是药食同源目录中的中草药，其皮、花、种子及芽皆可入药。本发明所述厚朴提取物既可是厚朴全株或部分组织的提取物，也可是市售的厚朴提取物。原则上，只要能满足本发明技术方案及效果的需要，本发明对厚朴提取物的来源或制备方法不作特别的限定。同理，本发明对厚朴酚、和厚朴酚的来源或制备方法亦不作特别的限定。为了详细的阐述本发明技术方案及效果，本发明以举例说明的方式给出了厚朴提取物与厚朴酚、和厚朴酚的制备方法。
8.厚朴提取物制备的实施方式之一，加热超声回流提取法。具体方法：厚朴置于恒温烘箱55℃烘干至恒重，烘干后使用微型植物试样粉碎机粉碎，称取100g过筛(40-60目)，将其置于500ml圆底烧瓶；使用甲醇提取两次，每次溶剂为250ml，回流时长为3h，每隔30min进行超声5min，每次提取结束都将提取液过滤，并用旋转蒸发仪减压、加热浓缩，合并2次的浓缩提取物，最后置于恒温烘箱，55℃烘干至恒重，得到厚朴提取物。
9.厚朴提取物制备的实施方式之一，甲醇冷浸法。具体方法：如上将厚朴烘干，粉碎，称取100g过筛(40-60目)，置于3000ml锥形瓶中，加入1500ml甲醇，冷浸24h，抽滤后用旋转蒸发仪减压、加热浓缩，得到厚朴提取物。
10.厚朴提取物制备的实施方式之一，超临界萃取法。具体方法：如上将厚朴烘干，粉碎，将厚朴粉碎后投入萃取釜中，对萃取釜、解析釜ⅰ、解析釜ⅱ分别进行加热，当温度分别达到35℃、40℃、37℃时通过高压泵对萃取釜、两个解析釜进行加压，当压力分别达到22mpa、7.5mpa和6mpa时，开始循环萃取并保持恒温恒压，萃取时间为4h，每循环10min，从解析釜ⅰ、解析釜ⅱ放料，得到厚朴提取物。
11.厚朴酚与和厚朴酚制备的实施方式之一。具体方法：称取10g厚朴提取物浸膏溶解在60％乙醇溶液中，用真空旋转蒸发仪浓缩至干，浓缩产物取出静置后有大量晶体析出，用环己烷稀释浓缩物后过滤，随后用等体积的乙醇水溶液萃取3次，每次10min，合并萃取液后用旋转蒸发仪浓缩萃取液，取出后静置，再次用环己烷稀释，过滤后烘干；称取固体物于50ml圆底烧瓶中，加入50ml环己烷在60℃水浴中搅拌10min，过滤得到粉状固体，用乙酸乙酯重结晶后的块状晶体为厚朴酚；剩余滤液中析出的固体用环己烷60℃加热溶解后，降温至50℃，过滤析出得到的大量固体，用环己烷重结晶后的片状晶体为和厚朴酚。
12.厚朴酚与和厚朴酚的测定方法：精密称取1mg厚朴酚与和厚朴酚晶体，用甲醇溶解后定容至25ml，过滤0.45μm滤膜后作为样品制备液；精密称取厚朴酚与和厚朴酚标准品，一定量的甲醇溶解后定容，分别制成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml的厚朴酚与和厚朴酚的标准溶液；取20μl注入液相色谱-质谱联用仪(lc-ms)进行测定。流动相为甲醇-乙腈-水(50:20:40)，液相色谱柱为sinochromods-bp(4.6mm
×
150nm)，挂流量5ml/min，检测波长为292nm，柱温30℃，绘制标准曲线。将样品液进行液相-质谱分析仪，最终鉴定分离得到的产物为厚朴酚及和厚朴酚，纯度达到99％。
13.本领域普通技术人员易于知晓，厚朴提取物中的有效成分包括厚朴酚、和厚朴酚以及厚朴总酚。在本发明中，厚朴总酚可以理解为厚朴酚、和厚朴酚混合物的统称。基于动物实验研究结果，本发明提供了一种诺卡氏菌抑菌组合物，所述组合物对诺卡氏菌抑菌的有效成分包括厚朴酚，或和厚朴酚，或厚朴酚与和厚朴酚的组合。易于理解地，这一诺卡氏菌抑菌组合物，其有效成分更进一步或更为明确，为厚朴酚，或和厚朴酚，或厚朴酚与和厚朴酚的组合。所述厚朴酚或和厚朴酚可以通过人工合成，或是从厚朴提取物中纯化得到。
14.再者，本发明提供了一种诺卡氏菌病的防治药物，所述药物对诺卡氏菌具有抑菌作用，其包括诺卡氏菌抑菌组合物和药学上可接受的组分。所述组合物对诺卡氏菌抑菌的有效成分包括厚朴提取物，或厚朴提取物与厚朴酚的组合，或厚朴提取物与和厚朴酚的组合，或厚朴提取物与厚朴酚、和厚朴酚的组合。并列地，本发明提供了一种诺卡氏菌病的防治药物，所述药物对诺卡氏菌具有抑菌作用，其包括诺卡氏菌抑菌组合物和药学上可接受的组分。所述组合物对诺卡氏菌抑菌的有效成分包括厚朴酚，或和厚朴酚，或厚朴酚与和厚朴酚的组合。本发明所述药学上可接受的组分具有广泛的含义，包括药剂学可接受的辅料或载体。所述载体或辅料是指药剂学领域常规的载体或辅料，包括但不限于稀释剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、填充剂或/和表面活性剂中的任何一种或多种。所述药物的剂型包括但不限于粉末剂、颗粒剂、药液、注射剂、或者其它形式的药物。
15.还有，本发明提供了所述诺卡氏菌抑菌组合物在制备诺卡氏菌病防治药物中的应用。作为所述应用的实施方式之一，所述药物用于水产养殖。进一步地，所述药物用于鱼类诺卡氏菌病的预防和治疗，这里所述的诺卡氏菌为可引起鱼类诺卡氏菌病的诺卡氏菌，所述鱼类为感染诺卡氏菌的所有鱼类。优选地，所述药物的具体方式包括但不限于作为拌喂粉末、饲料添加剂、浸浴药液、注射液等。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果或者优点：
17.本发明针对现有水产养殖中诺卡氏菌病防治技术的缺陷和不足，提出了采用中草药提取物及其活性成分防治诺卡氏菌病的技术思路。本发明首次揭示了厚朴提取物及其活性成分厚朴酚与和厚朴酚对诺卡氏菌具有显著的抑制作用。按照美国临床实验室国家标准委员会(nccls)推荐的标准微量稀释法测定，厚朴提取物对诺卡氏菌最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，mic)为2.50μg/ml，厚朴提取物中的活性成分厚朴酚与和厚朴酚的mic测定结果分别为0.19μg/ml、0.34μg/ml，低于利福平(水产禁用)、硫红霉素(水产禁用)、恩诺沙星、盐酸环丙沙星(水产禁用)、盐酸左氧氟沙星(水产禁用)、氟苯尼考、氟哌酸(水产禁用)等抗生素的mic。上述结果表明，厚朴提取物或其活性成分厚朴酚与和厚朴酚可以用于水产养殖，可以用于鱼类诺卡氏菌病的预防和治疗，具备直接开发防治诺卡氏菌药物的能力。
18.厚朴是药食同源目录中的中草药，厚朴提取物或其活性成分厚朴酚与和厚朴酚对水产动物具有较高生物安全性。以厚朴酚或和厚朴酚计，诺卡氏菌病的防治药物中厚朴酚或和厚朴酚的有效量通常至少约100mg/kg体重，而且在大多数情况下不超过400mg/kg体重，较佳地该剂量是约200mg/kg体重。在该剂量范围，诺卡氏菌病的防治药物对大多数水产动物，尤其是鱼类，均是安全的。
19.本发明开拓了厚朴提取物及其活性成分厚朴酚与和厚朴酚在水产养殖领域的新用途，具有广阔的潜在应用前景。一方面，可直接利用中药厚朴开发药食同源饲料添加剂防治鱼类诺卡氏菌病感染；还可以利用厚朴酚、和厚朴酚作为饲料添加剂或药物，或对厚朴酚、和厚朴酚进行药学上可接受的结构修饰，开发成用于防治诺卡氏菌的药物。
20.综上，本发明所述诺卡氏菌抑菌组合物，或诺卡氏菌病的防治药物，具有高效、安全无残留、易降解、低耐药等优点，为鱼类(水产动物)诺卡氏菌感染提供了新的治疗方法和途径。
具体实施方式
21.下面，结合具体的实施例对本发明的技术方案进行进一步的解释说明，但是，本发明并不限于下述的实施方式。
22.实施例1
23.本实施例阐述厚朴提取物及其活性成分厚朴酚与和厚朴酚对诺卡氏菌最小抑菌浓度(mic)的测定。
24.(1)实验菌株
25.从感染诺卡氏菌的大口黑鲈内脏中分离纯化得到1株诺卡氏菌，经分子生物学鉴定和生理生化鉴定为鰤鱼诺卡氏菌(n.seriolaeso)，保存于西北农林科技大学水产科学实验室。
26.(2)菌液培养
27.配置大豆酪蛋白液体培养基(tsb)：称取胰蛋白胨3.0g、大豆胨1.0g、氯化钠1.0g，加入200ml蒸馏水，加热溶解后冷却至室温，用5mol/l盐酸调节ph至7.3左右，121℃高压灭菌15分钟，待冷却至室温后备用。
28.在超净台酒精灯焰附近进行接种，放入恒温培养箱中28℃培养5d。取5ml培养的菌液置于10ml离心管中，用麦氏比浊法确定菌液浓度为1.0
×
108cfu/ml，用未接种的灭菌tsb培养基稀释至1.0
×
105cfu/ml备用。
29.(3)实验药物
30.厚朴提取物浸膏、厚朴酚、和厚朴酚采用本发明统一方法获得。利福平、硫氰酸红霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、盐酸左氧氟沙星、氟苯尼考、氟哌酸、西比氯铵、盐酸土霉素、新霉素、盐酸四环素、苯噻菌胺、氨苄西林、阿莫西林等抗生素购于上海麦克林生化科技有限公司。
31.(4)药液配制
32.母液配制：用分析天平准确称量一定量的厚朴提取物浸膏、厚朴酚、和厚朴酚以及上述抗生素，dmso溶解，浓度为20μg/ml，分装于1.5ml离心管中。
33.稀释液配制：母液过0.22μm的有机相滤膜，用无菌tsb培养基倍比稀释，用于mic测定。
34.(5)实验方法
35.按照美国临床实验室国家标准委员会(nccls)推荐的标准微量稀释法测定上述各药物对诺卡氏菌最小抑菌浓度(mic)。取96孔板，在超净台无菌条件下，根据实验药物的数目设定列数，在每列的每个孔中加入100μl诺卡氏菌液(1
×
105cfu/ml)；每列的第一个孔至第8个孔依次加入100μl倍比稀释后的药物溶液，选择3个空余孔加入100μl诺卡氏菌溶液以及100μl无菌tsb溶液作为对照，其余空余孔加入200μl无菌蒸馏水用于减少水汽蒸发。将96孔板盖好，置于28℃恒温培养箱中培养，5d后每孔加入50μl蓝色刃天青溶液，24h观察结果，根据刃天青氧化还原反应的原理，变为红色的孔说明有细菌生长，不变色的药物浓度即为药物抑制细菌生长最低浓度mic，每种药物的mic值测定重复3次。各药物mic值测定结果见表1。
36.表1药物对诺卡氏菌最小抑菌浓度(mic)的测定结果
[0037][0038]
如表1所示，厚朴提取物对诺卡氏菌最小抑菌浓度为2.50
±
0.4μg/ml，厚朴酚与和厚朴酚的mic测定结果分别为0.19μg/ml、0.39μg/ml，与大多数抗生素相近甚至远小于一些抗生素的mic，其中厚朴酚的mic值最低。因此，厚朴提取物、厚朴酚与和厚朴酚具有良好的抗诺卡氏菌效果。
[0039]
实施例2
[0040]
本实施例阐述厚朴提取物、厚朴酚与和厚朴酚作为饲料添加剂饲喂大口黑鲈，预防感染诺卡氏菌的效果。
[0041]
(1)饲料制备
[0042]
称取一定量的厚朴提取物，50％乙醇溶解后，均匀喷洒至基础饲料(购自广东粤海饲料有限公司的加州鲈专用饲料，粒径2.5mm，不含厚朴提取物及其活性成分厚朴酚与和厚朴酚)，使其含量分别为250、500、1000mg/kg(厚朴提取物/饲料)。
[0043]
称取一定量的厚朴酚、和厚朴酚、恩诺沙星，以同样的方法制成高中低剂量的含药饲料，药剂含量分别为400、200、100mg/kg(厚朴提取物/饲料)。乙醇自然挥发后，4℃保存。
[0044]
(2)实验方法
[0045]
选择健康的大口黑鲈，平均体重20
±
2.0g，随机分为对照组，阴性对照组和药物处理组(厚朴提取物、厚朴酚、和厚朴酚、恩诺沙星)，其中药物处理组均设置低中高三个含量处理组，每组设置3个平行，每个平行20尾鱼。阴性对照组每尾鱼腹腔注射100μl无菌pbs，对照组和药物处理组每尾鱼均腹腔注射100μl无菌pbs配制的半数致死浓度的诺卡氏菌悬液。对照组和阴性对照组饲喂不含药物的基础饲料，厚朴提取物的高、中、低处理组分别饲喂含1000、500、250mg/kg厚朴提取物的饲料，恩诺沙星、厚朴酚、和厚朴酚的高、中、低处理组分别饲喂含400、200、100mg/kg药物的饲料，投饵率为3％，每天2次。于实验第14天，每个平行
随机选择5尾鱼在无菌条件下采集肝脏，制作匀浆液后涂布tsa培养基进行诺卡氏菌检测和计数，计算感染率，感染率＝检出诺卡氏菌鱼数量/总数
×
100％。结果见表2。随后改为饲喂不含药物的基础饲料，在实验第28天统计各组存活率，存活率＝(总数-死亡数量)/总数
×
100％。结果见表2。
[0046]
表2大口黑鲈饲喂不同饲料的诺卡氏菌感染情况及存活率
[0047][0048]
由表2可知，对照组大口黑鲈诺卡氏菌攻毒后14天的感染率达到100％，28天存活率仅为24.4％；虽然饲喂高含量的恩诺沙星组存活率较高，但仍能够检测到诺卡氏菌感染；而饲喂高含量的厚朴提取物和中高含量的厚朴酚、和厚朴酚的大口黑鲈诺卡氏菌感染率均为0％。综合存活率分析，在饲料中添加500mg/kg厚朴提取物，或200mg/kg厚朴酚/和厚朴酚对大口黑鲈鲈鱼的诺卡氏菌病具有高效的治愈效果，优于抗生素恩诺沙星。
[0049]
实施例3
[0050]
本实施例将厚朴提取物及其活性成分厚朴酚、和厚朴酚制成注射剂，测定预防感染诺卡氏菌的效果。
[0051]
(1)药物溶液配置
[0052]
将厚朴提取物、厚朴酚、和厚朴酚、恩诺沙星分别用dmso溶液配置浓度为5mg/ml的注射剂。
[0053]
(2)实验方法
[0054]
选择健康的乌鳢，平均体重30
±
3.4g，随机分为对照组，阴性对照组和药物处理组(恩诺沙星、厚朴提取物、厚朴酚、和厚朴酚)。药物处理组均设置低中高三个浓度处理组，每组三个平行，每个平行20尾乌鳢。阴性对照组注射50μl无菌pbs溶液，对照组和药物处理组每尾鱼均腹腔注射50μl半数致死浓度的诺卡氏菌pbs悬液。厚朴提取物的高、中、低处理组连续7天肌肉注射50μl无菌pbs稀释的药物溶液，含量分别为200、100、50mg/kg(药物含量/鱼体重)。恩诺沙星、厚朴酚、和厚朴酚处理中的高、中、低处理的注射含量分别为100、50、25mg/kg(药物含量/鱼体重)。对照组和阴性对照组连续7天肌肉注射50μl含等量dmso的无
菌pbs溶液。为减少应激，每次操作前用0.1mg/l的丁香酚对乌鳢进行麻醉后注射。第14天时，每个平行取5条鱼在无菌条件下解剖取肝脏，制作匀浆液后涂布tsa培养基进行诺卡氏菌计数，统计感染率，感染率＝检出诺卡氏菌鱼数量/总数
×
100％，28天后统计存活率，存活率＝(总数-死亡数量)/总数
×
100％实验结果见表3。
[0055]
表3，乌鳢注射不同药物的诺卡氏菌感染情况及存活率
[0056][0057]
由表3可知，对照组乌鳢诺卡氏菌攻毒后14天的感染率达到100％，28天存活率仅为26.7％；连续7天注射100mg/kg恩诺沙星的乌鳢体内检测不到诺卡氏菌感染，存活率可以达到100％；连续7天注射高浓度厚朴提取物以及中高浓度的厚朴酚、和厚朴酚处理组的诺卡氏菌感染率均为0。综合存活率分析，对感染诺卡氏菌的乌鳢连续7天注射200mg/kg的厚朴提取物或者50mg/kg的厚朴酚或和厚朴酚，可以获得优于恩诺沙星的治疗效果，有效治疗乌鳢诺卡氏菌感染。
[0058]
实施例4
[0059]
本实施例将厚朴提取物及其活性成分厚朴酚、和厚朴酚制成浸浴药液，测定预防感染诺卡氏菌的效果。
[0060]
(1)药物溶液配置
[0061]
将厚朴提取物、厚朴酚、和厚朴酚、恩诺沙星分别用甲醇配置浓度为5mg/ml的浸浴药液。
[0062]
(2)实验方法
[0063]
选择健康的金鲳，平均体重2
±
0.4g，随机分为对照组，阴性对照组和药物处理组(恩诺沙星、厚朴提取物、厚朴酚、和厚朴酚)。药物处理组均设置低中高三个浓度处理组，每组三个平行，每个平行20尾金鲳，置于10l的长方形鱼缸中。阴性对照组注射50μl无菌pbs溶液，对照组和药物处理组每尾鱼均腹腔注射50μl半数致死浓度的诺卡氏菌pbs悬液。随后对照组置于正常养殖海水中，药物处理组金鲳置于不同浓度的药物溶液中。厚朴提取物高、中、低浓度处理组中厚朴提取物的含量分别为40、20、10mg/l，恩诺沙星、厚朴酚、和厚朴酚
高、中、低处理组的药物浓度分别为10、5、2.5mg/l。药物处理组药浴时间持续7天，用充气泵对所有的鱼缸进行曝气并每天更新药液。随后更换为正常的养殖海水。第14天时，每个平行取5条鱼在无菌条件下解剖取肝脏，制作匀浆液后涂布tsa培养基进行诺卡氏菌计数，统计感染率，感染率＝检出诺卡氏菌鱼数量/总数
×
100％。28天后统计存活率。存活率＝(总数-死亡数量)/总数
×
100％。实验结果见表4。
[0064]
表4金鲳浸浴不同药物的诺卡氏菌感染情况及存活率
[0065][0066][0067]
由表4可知，对照组金鲳诺卡氏菌攻毒后14天的感染率达到100％，28天存活率仅为28.9％。连续7天浸浴10mg/l的恩诺沙星并不能完全清除金鲳体内的诺卡氏菌。而浸浴7天40mg/l厚朴提取物处理组金鲳的诺卡氏菌感染率为0，存活率为100％，浸浴7天5mg/l和10mg/l的厚朴酚以及和厚朴酚金鲳的诺卡氏菌感染率为0％，且5mg/l浸浴的存活率均可以达到100％。因此，对感染诺卡氏菌的金鲳浸浴40mg/l的厚朴提取物或者5mg/l的厚朴酚/和厚朴酚可以有效治疗金鲳的诺卡氏菌感染。
[0068]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。