防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种防治鸭病毒病的三联灭活疫苗，尤其涉及同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗，本发明进一步涉及该三联灭活疫苗的制备方法，属于防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备领域。


背景技术：

2.鸭圆环病毒主要侵害宿主的免疫系统，造成宿主免疫功能低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经济损失。鸭圆环病毒不能在各种细胞系及鸡胚中增殖，所以通过对鸭圆环病毒的分离纯化并以全病毒作为抗原制备疫苗困难较大。杆状病毒表达系统具备完整的翻译后修饰系统，明显优于细菌和酵母，且易于操作及大规模生产等。
3.新型鸭呼肠孤病毒病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病，自2017年以来，在山东、河南、江苏等地区的养鸭场中发现。其易感日龄多在5d-25d范围内，发病率一般在10％-70％之间，死亡率一般在50％-60％之间。日龄越小，发病和死亡率越高。在天气寒冷的环境下，发病率和死亡率都有明显升高。
4.鸭腺病毒病3型最初于2014年在广东流行逐渐扩大到全国各地特别是南方数省。该病仅见于番鸭，多在15～20日龄发病，发病率40％～50％，死亡率35％～43％。剖检病变的特征为肝脏肿大、色泽变淡或黄化、肝脏出血、坏死，心包积液、心肌出血或坏死，肾脏肿大、出血、坏死。目前，该病已给现地养殖户带来了巨大的经济损失。
5.近年来，中国养鸭产业快速发展、规模不断壮大，但养殖水平和技术相对落后，各种鸭流行性疫病相继发生。从检测中国不同省份的鸭子的病料来看，其中鸭圆环病毒、新型呼肠孤病毒和鸭腺病毒3型是鸭的三种常发疫病，给中国养殖业造成了巨大的经济损失。
6.迄今为止，对于这三种疫病尚未有效的措施进行防控，由此尽快研制出一种安全有效的三联灭活疫苗尤为关键。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一是提供一种安全且有效的同时防治新型鸭呼肠孤病毒病毒、鸭圆环病毒和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗；
8.本发明的目的之二是提供一种制备所述的三联灭活疫苗方法。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明首先提供了同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其中，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原和鸭腺病毒3型抗原。
11.所述的鸭圆环病毒抗原可以是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白；最为本发明一种优选的具体实施方式，优选为码子优化后的鸭圆环
病毒cap基因采用真核表达的方式得到重组鸭圆环病毒cap蛋白；
12.作为参考，本发明提供了一种制备重组鸭圆环病毒cap蛋白的方法，包括：构建携带鸭圆环病毒cap基因的重组杆状病毒穿梭载体；将重组杆状病毒穿梭载体转染sf9细胞得到重组杆状病毒；扩增重组杆状病毒。
13.所述的鸭呼肠孤病毒抗原优选是将新型鸭呼肠孤病毒s株(其微生物保藏编号为：cgmcc no.20000)在lmh细胞中进行增殖得到的病毒液。
14.所述鸭腺病毒3型抗原的制备可以是将鸭腺病毒3型生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液，得到鸭肝炎病毒抗原。
15.本发明中所用到的鸭腺病毒3型生产用毒种可以是任何一种通过商业途径购买得到的鸭腺病毒3型毒种，本发明中所用的鸭腺病毒3型生产用毒种是鸭腺病毒3型fz株，微生物保藏编号为：cgmcc no.21928，其分类命名是：鸭腺病毒3型，保藏时间是：2021年11月4日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
16.本发明的三联联灭活疫苗中，鸭呼肠孤病毒液不小于10
7.0
tcid
50
，鸭腺病毒3型不小于10
5.5
eld
50
，每羽份疫苗中ducv-cap蛋白含量不小于5μg。
17.本发明中所述的免疫佐剂可以任何一种常规的免疫佐剂，作为本发明的一种具体的实施方式，所述的免疫佐剂可以为白油、司班-80(span-80)、硬脂酸铝或吐温-80中的任何一种或多种。
18.本发明所述灭活疫苗部分还可包括冻干保护剂。
19.本发明进一步提供了一种制备所新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒病和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗的方法，包括：
20.(1)油相制备：取白油与司班-80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；
21.(2)水相制备：将灭活的鸭呼肠孤病毒抗原，鸭腺病毒3型抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温-80混匀直至吐温-80完全溶解；
22.(3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。
23.作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(1)中将取白油与司班-80按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后121℃高压蒸汽灭菌。
24.作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(2)的抗原混合液中控制鸭呼肠孤病毒液不小于10
7.0
tcid
50
，3型鸭腺病毒不小于10
5.5
eld
50
，每羽份疫苗中ducv-cap蛋白含量不小于5μg；抗原混合液与无菌吐温-80(tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀直至吐温-80完全溶解。
25.作为本发明的一种优选的实施方案，取油相3份放入组织匀浆机内慢速搅拌，同时徐徐加入水相2份，加完后再以10000r/min的转速搅拌4min-5min。
26.安全性试验检验结果表明，本发明制备的三联灭活疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应，具有良好的安全性。
27.根据本发明三联灭活疫苗免疫保护效力试验结果可见，与对照组相比，免疫组雏
鸭的抗体水平在28日时达到最高，中和抗体效价均不低于1:256。雏鸭免疫后21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以rt-qpcr方法检测全血中ducv核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10发病；雏鸭免疫后3周进行鸭腺病毒3型强毒株攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21攻毒对照组100％发病。
28.本发明提供的三联灭活疫苗不会产生抗原成份的相互干扰或影响，能够同时预防鸭呼肠孤病，鸭圆环病和鸭腺病毒3型，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
30.实施例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、3型鸭腺病毒病三联灭活疫苗的制备
31.1.毒种
32.新型鸭呼肠孤病毒s株(微生物保藏编号为：cgmcc no.20000，其分类命名是：新型鸭呼肠孤病毒，保藏时间是：2020年7月6日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。
33.2.灭活疫苗的制备及检验
34.2.1鸭圆环杆状病毒制备
35.2.1.1鸭圆环病毒cap基因的设计与合成
36.将鸭圆环病毒cap基因经密码子优化后，在序列两端添加ecorⅰ和hind iii酶切位点，委托生物公司克隆至pfastbacⅰ载体，形成重pfb-ducv-cap。
37.2.1.2重组穿梭杆粒rbacmid-ducv-cap的构建与制备
38.2.1.2.1重组穿梭杆粒的构建
39.将1μl重组质粒pfb-ducv-cap加入至200μl于冰上融化的dh10bac感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上2min，加入900μl的s.o.c培养基，37℃220rpm振荡培养4h，然后用s.o.c培养基做10-1
，10-2
，10-3
三个稀释度，每个稀释度取150μl均匀的涂布于lb选择性琼脂平板上，37℃温箱避光培养36-48h，直至清晰蓝白菌落出现。
40.2.1.2.2重组杆状病毒穿梭载体dna的提取
41.将lb选择性平板放于4℃冰箱2h，使菌落充分显色，将平板取出进行蓝白斑的筛选，挑取平板上较大的散在白色单菌落，重新划线接种于lb选择性平板进行第二次的蓝白斑筛选，37℃过夜培养后，同样，挑取平板上较大的散在白色单菌落接种至含50μg/ml的卡那霉素，7μg/ml的庆大霉素，10μg/ml的四环霉素的lb液体培养基中37℃220rpm振荡培养16个小时，提取杆粒dna。
42.2.1.2.3重组杆状病毒穿梭载体dna的pcr鉴定
43.以提取的重组杆状病毒穿梭载体dna为模板，利用ducv-cap-r/ducv-cap-f引物进
行pcr扩增。
44.表1 pcr扩增引物
[0045][0046]
循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，共设置30个循环；72℃延伸10min。预计pcr扩增片段长度约为774bp，验证正确的杆粒dna命名为rbacmid-ducv-cap。
[0047]
2.1.3重组杆粒转染sf9细胞
[0048]
转染前选择状态良好的sf9细胞铺于6孔板，取适量传代sf9细胞使用台盼蓝染色30s左右，滴于血球计数板观察细胞活性并计数。将细胞活性≥97％的细胞铺于6孔板，每孔106个细胞左右。2h(或过夜)后细胞贴壁，可用于转染。转染过程如下(细胞传代、转染均在无菌条件下操作)：
[0049]
1、准备两个灭菌的1.5ml ep管，各分装0.1ml无抗生素、无胎牛血清的sf-900培养基；
[0050]
2、分别加入3μl重组杆粒(2μg)、6μl转染试剂，轻轻混匀，室温静置5min。
[0051]
3、将含有转染试剂的培养基转移到含有杆粒的培养基中，轻轻混匀，室温静置20min；期间取出贴壁的sf9细胞，弃去原培养基，使用无抗生素、无胎牛血清的sf-900培养基轻轻洗两遍，每孔加入2ml无抗生素、无胎牛血清的sf-900培养基；
[0052]
4、将混合液均匀滴加到6孔板的一个细胞孔中，另一孔为正常细胞对照。转染第3～5天，观察细胞变化。
[0053]
2.1.4重组杆状病毒的扩增
[0054]
将状态良好的sf9细胞悬液传至细胞瓶，细胞贴壁后，接种10μl p0代病毒液。接毒约72h，sf9细胞开始出现病变，第5或6天，待细胞出现变大变圆、胞内颗粒状物非常明显时，收获病毒液，-80℃避光保存。
[0055]
2.1.5 ducv-cap蛋白的测定
[0056]
利用bradford蛋白定量测定试剂盒，采用微孔酶标仪法，测定ducv-cap蛋白浓度，试验严格按照说明书进行。
[0057]
2.1.6灭活及灭活检验
[0058]
2.1.6.1灭活
[0059]
收获的鸭圆环杆状病毒液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，充分混匀，37℃灭活24小时，期间每两个小时搅拌一次。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
[0060]
2.1.6.2灭活检验
[0061]
取灭活后的病毒液，接种于已形成良好单层的sf9细胞，置27℃培养观察4日，反复冻融2次后，再盲传2代，观察细胞病变情况。
[0062]
2.2鸭呼肠孤病毒制备
[0063]
2.2.1病毒液制备
[0064]
将状态良好的lmh细胞悬液传至细胞瓶，按培养基总量的2％将毒种接种长满单层的lmh细胞，置37℃5％co2培养箱中培养，吸附1小时后，补加血清含量为2％的dmem细胞培
养液，继续在37℃5％co2培养箱中培养。接毒后细胞培养40-48小时，当细胞病变达到80％以上时，收获细胞及细胞培养物。反复冻融2次后，使用tcid
50
方法检测病毒滴度。
[0065]
2.2.2病毒含量测定
[0066]
将lmh细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100μl(细胞含量4.0
×
105个/ml)，置37℃含5％co2培养箱中培养24h。将病毒液用dmem培养基作10倍系列稀释，取10-6
、10-7
、10-8
、10-9 4个稀释度，各加入培养24h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2％新生牛血清的dmem培养液，每孔100μl。置37℃含5％co2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按reed-muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(tcid
50
)。
[0067]
2.2.3灭活及灭活检验
[0068]
2.2.3.1灭活
[0069]
收获的鸭呼肠孤病毒液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，充分混匀，37℃灭活24小时，期间每两个小时搅拌一次。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
[0070]
2.2.3.2灭活检验
[0071]
取灭活后的病毒液，接种于已形成良好单层的lmh细胞，置37℃培养观察4日，反复冻融2次后，再盲传2代，观察细胞病变情况。
[0072]
2.3鸭腺病毒3型原液的制备及检验
[0073]
2.3.1制苗用鸭腺病毒3型病毒液的制备
[0074]
用灭菌生理盐水将鸭腺病毒3型生产用毒种做1000倍稀释，分别经尿囊腔接种11日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去24小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集24～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(eld
50
)测定。病毒含量应不低于10
5.5
eld
50
/0.2ml。
[0075]
2.3.2灭活及检验
[0076]
2.3.2.1灭活
[0077]
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻，分别边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
[0078]
2.3.2.2灭活检验
[0079]
取灭活后的病毒液，接种于11日龄易感番鸭胚，置37℃培养观察168h，记录番鸭胚存活情况，收获健活番鸭胚尿囊液再盲传1代，记录番鸭胚存活情况。
[0080]
2.4灭活疫苗的配制
[0081]
2.4.1油相制备
[0082]
取白油与司班-80(span-80)按照94：6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌至淡黄色且澄清透明后，121℃高压蒸汽灭菌备用。
[0083]
2.4.2水相制备
[0084]
将灭活检验合格的3种病毒液以等比例混合，鸭呼肠孤病毒液不小于10
7.0
tcid
50
，3型鸭腺病毒不小于10
5.5
eld
50
每羽份疫苗中ducv-cap蛋白含量不小于5μg。抗原液与无菌吐温-80(tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀，直至吐温-80完全溶解。
[0085]
2.5乳化
[0086]
取油相3份放入组织匀浆机内，慢速搅拌，同时徐徐加入水相2份，加完后再以10000r/min搅拌4min-5min。
[0087]
2.6成品检验
[0088]
2.6.1无菌检验
[0089]
按现行《中国兽药典》附录进行检验。
[0090]
2.6.2安全检验
[0091]
取1日龄健康易感雏鸭20羽，随机分为2组，一组为试验组，在其颈部皮下注射2ml灭活疫苗；另一组为对照组，在其颈部皮下注射等量生理盐水。接种后每日观察试验动物精神、采食、有无不良反应。
[0092]
3.试验结果
[0093]
3.1鸭圆环杆状病毒制备
[0094]
3.1.1 ducv-cap蛋白的测定
[0095]
根据测得的不同浓度标准品od值，以od值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程，计算ducv-cap蛋白浓度为2.3mg/ml。
[0096]
3.1.2灭活检验
[0097]
灭活后的鸭圆环杆状病毒接种sf9细胞，并盲传2代，细胞均无病变产生，结果表明病毒液灭活完全。
[0098]
3.2鸭呼肠孤病毒制备
[0099]
3.2.1鸭呼肠孤病毒病毒含量测定
[0100]
将鸭呼肠孤病毒种毒接种长满单侧的lmh细胞，培养44小时收获，反复冻融2次，测定病毒含量为10
7.5
tcid
50
/ml。
[0101]
3.2.2灭活检验
[0102]
灭活后的呼肠孤病毒接种lmh细胞，并盲传2代，细胞均无病变产生，结果表明病毒液灭活完全。
[0103]
3.3鸭腺病毒3型原液的制备
[0104]
3.3.1鸭腺病毒3型病毒含量测定
[0105]
将鸭腺病毒3型病毒液做10倍系列稀释，每个稀释度接种易感鸭胚5枚，每枚0.2ml，培养观察168h，记录鸭胚的死亡情况。按reed-muench法计算病毒液的病毒含量为10
5.83
eld
50/
0.2ml。
[0106]
3.3.2灭活检验
[0107]
灭活后的鸭肝炎病毒接种10日龄易感鸭胚，并盲传1代，鸭胚均全部健活，结果表明病毒液灭活完全。
[0108]
3.4成品检验
[0109]
3.4.1无菌检验
[0110]
按现行《中国兽药典》附录对灭活疫苗进行无菌检验。结果表明成品无菌检验合格。
[0111]
3.4.2安全检验
[0112]
疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应。
[0113]
试验例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、3型鸭腺病毒病三联灭活疫苗的效力检验
[0114]
1试验方法
[0115]
1.1鸭呼肠孤病毒部分
[0116]
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗1ml，接种3周后同样方式进行加强免疫1次。第2组不免疫，作空白对照。首免后每周采血分离血清，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平。
[0117]
1.2鸭圆环病毒部分
[0118]
1日龄健康易感雏鸭30只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组10只为攻毒对照组，每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。免疫后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射鸭圆环病毒1.0ml。攻毒后21日翅静脉采血。按新鲜血液与抗凝剂6:1的比例加入抗凝剂，用rt-qpcr方法检测全血中ducv核酸拷贝数。免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
[0119]
1.3鸭腺病毒3型部分
[0120]
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组不免疫，作空白对照。接种后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射鸭腺病毒3型0.5ml，隔离饲养10日，剖检各组鸭只观察肝脏病变(3型鸭腺病毒病发病标准：剖检雏鸭可见肝脏肿大、色泽变淡或黄化)。免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
[0121]
2检验结果
[0122]
2.1鸭呼肠孤病毒部分抗体水平
[0123]
雏鸭免疫后每周采血，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在28日时达到最高，中和抗体效价均不低于1:256。
[0124]
表2血清中鸭呼肠孤病毒抗体水平
[0125][0126]
注：
“‑”
代表阴性
[0127]
2.2鸭圆环病毒部分
[0128]
雏鸭免疫后21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以rt-qpcr方法检测全血中ducv核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10发病，结果见表3。
[0129]
表3鸭圆环病毒免疫攻毒保护结果
[0130][0131]
注：“ ”代表ct≤26，判为阳性，
“‑”
ct＞26判为阴性。
[0132]
2.3鸭腺病毒3型部分
[0133]
雏鸭免疫后3周进行攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21攻毒对照组100％发病。
[0134]
表4鸭腺病毒3型攻毒保护结果
[0135]
[0136]
注：“ ”代表发病，
“‑”
代表健康。