利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的方法及装置与流程

1.本发明涉及蛋白质晶体学和结构生物学领域，特别涉及一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的方法及装置。


背景技术：

2.蛋白质结构解析不仅有利于蛋白质结构与功能间的关系分析，而且有助于基于蛋白质结构指导的药物、疫苗设计及可控的药物递送。现已解析的大多数蛋白质结构是通过x射线晶体衍射技术得到的，高质量的蛋白质晶体是利用x射线晶体衍射技术成功解析蛋白质结构的关键。蛋白质结晶是由蛋白质晶核形成到晶体生长的过程，然而由于蛋白质分子几何形状较复杂、分子间相互结合位点很多，难于控制晶核形成和生长，导致蛋白质结晶的成功率较低、很难制备高质量的蛋白质晶体，使得蛋白质结晶技术成为蛋白质结构解析的瓶颈。
3.目前，围绕如何可控制备高质量的蛋白质晶体，研究者们探索了多种不同方法。传统的蛋白质结晶方法有批量结晶法、蒸汽扩散法和液液扩散法，然而基于上述传统方法的蛋白质结晶过程不可控且结晶成功率较低，因此围绕提高蛋白质结晶的可控性和结晶成功率，研究者们通过外加电场、磁场、微重力场、机械振动等方式进行了研究。上述外加物理场的结晶方法进行的蛋白质结晶在结晶效率、产率及质量方面有所提高，但是在采用上述方法进行蛋白质结晶时，基于上述方法的蛋白质结晶机理还没有弄清，导致上述方法的适用性受限。
4.因此，亟需研制可控制备蛋白质晶体的装置和方法，以期解决很难可控制备高质量蛋白质晶体的难题。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的方法及装置。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的方法，具体包括以下步骤：
7.(1)利用光镊技术形成的光阱捕获并聚集样品室蛋白质溶液中的蛋白质分子，利用拉曼技术实现对蛋白质结晶过程的微弱的拉曼光谱信号的原位探测，通过解算拉曼光谱信号解析蛋白质的结晶机理；
8.(2)根据步骤(1)得到的蛋白质结晶机理，通过调控光场、调整激光功率、实时调控蛋白质溶液浓度实现蛋白质的可控结晶，具体为：通过在30mw-500mw范围内调整形成光阱的捕获激光功率改变蛋白质的结晶速度；通过在5ng/ul-1mg/ml范围内调整蛋白质溶液的浓度，改变蛋白质的结晶晶体尺寸；通过调整光场为线偏光或圆偏光，改变蛋白质的结晶晶体构型。
9.进一步地，所述的蛋白质溶液中蛋白质分子的尺寸是nm量级到μm量级。
10.一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的装置，包括第一激光器、第一半波片、第一准直透镜、第二准直透镜、第一二向色镜、第二二向色镜、高数值孔径物镜、样品室、第一聚焦透镜、照明光源、第三二向色镜、电荷耦合器件ccd、第二激光器、第二半波片、第三准直透镜、第四准直透镜、第一反射镜、第二反射镜、第五准直透镜、针孔、第六准直透镜、陷波滤波器、第二聚焦透镜、光谱仪、电子倍增探测器emccd；所述的第一激光器出射捕获激光，经过第一准直透镜和第二准直透镜进行扩束准直，依次经过第一二向色镜、第二二向色镜和高数值孔径物镜形成三维稳定捕获光阱，在样品室中捕获并聚集蛋白质溶液中的蛋白质分子，第二激光器出射拉曼激发激光，经过第三准直透镜和第四准直透镜进行扩束准直，依次经过第一反射镜、第一二向色镜、第二二向色镜和高数值孔径物镜聚焦在光阱捕获的蛋白质分子上，激发蛋白质分子的拉曼光谱信号，蛋白质结晶过程的拉曼光谱信号依次经过第二二向色镜、第三二向色镜、第二反射镜、第五准直透镜、针孔、第六准直透镜、第二聚焦透镜入射到耦合有电子倍增探测器emccd的光谱仪上。
11.进一步地，所述的样品室用于放置蛋白质溶液。
12.进一步地，用于形成光阱的第一激光器为1064nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
13.进一步地，用于拉曼激发的第二激光器为532nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
14.本发明的有益效果为：本发明方法利用光镊技术可捕获并聚集微小样品、并对样品非接触无损伤的特性，可实现蛋白质的结晶。本发明提出的装置光路结构简单、成本低、光路调试容易且方便使用者在光路中增加元器件以扩增装置的应用功能。在此基础上，通过调控光场、调整激光功率、蛋白质溶液浓度等参数可实现蛋白质的可控结晶，所以利用拉曼光镊技术实现蛋白质的可控结晶是一种新的思路和方法。本发明的理论和实验研究成果不仅可为蛋白质晶体学的研究者提供高效可控的结晶新技术，而且可为生物制药、疫苗研发等领域的学者提供结构指导。本发明采用光学方法实现蛋白质的可控结晶，拓展了拉曼光镊技术的应用，可用于蛋白质结晶领域。
附图说明
15.图1为本发明装置的一种结构示意图；
16.图2为本发明方法流程图；
17.图3为蛋白质结晶过程图；
18.图中，第一激光器1、第一半波片2、第一准直透镜3、第二准直透镜4、第一二向色镜5、第二二向色镜6、高数值孔径物镜7、样品室8、第一聚焦透镜9、照明光源10、第三二向色镜11、电荷耦合器件ccd12、第二激光器13、第二半波片14、第三准直透镜15、第四准直透镜16、第一反射镜17、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、陷波滤波器22、第二聚焦透镜23、光谱仪24、电子倍增探测器emccd25。
具体实施方式
19.以下结合附图和实施例对本发明进行进一步阐述。
20.如图1所示，本发明提供了一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的装置，包括装
置包括第一激光器1、第一半波片2、第一准直透镜3、第二准直透镜4、第一二向色镜5、第二二向色镜6、高数值孔径物镜7、样品室8、第一聚焦透镜9、照明光源10、第三二向色镜11、电荷耦合器件ccd 12、第二激光器13、第二半波片14、第三准直透镜15、第四准直透镜16、第一反射镜17、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、陷波滤波器22、第二聚焦透镜23、光谱仪24、电子倍增探测器emccd 25；通过所述第一激光器1出射捕获激光，经过第一准直透镜3和第二准直透镜4进行扩束准直，依次经过第一二向色镜5、第二二向色镜6和高数值孔径物镜7形成三维稳定捕获光阱，在样品室8中捕获并聚集蛋白质溶液中的蛋白质分子，第二激光器13出射拉曼激发激光，经过第三准直透镜15和第四准直透镜16进行扩束准直，依次经过第一反射镜17、第一二向色镜5、第二二向色镜6和高数值孔径物镜7聚焦在光阱捕获的蛋白质分子上，激发蛋白质分子的拉曼光谱信号，蛋白质结晶过程的拉曼光谱信号依次经过第二二向色镜6、第三二向色镜11、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、第二聚焦透镜23入射到耦合有电子倍增探测器emccd25的光谱仪24上，通过解算光谱仪24的拉曼光谱信号，解析蛋白质的结晶机理。
21.进一步地，所述的样品室8用于放置蛋白质溶液。用于形成光阱的第一激光器1为1064nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器，用于拉曼激发的第二激光器13为532nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
22.如图2所示，本发明提供了一种利用拉曼光镊进行蛋白质可控结晶的方法，具体包括以下步骤：
23.(1)将一定体积、一定浓度的蛋白质溶液注入样品室8中，打开1064nm第一激光器1和532nm第二激光器13，待三维稳定捕获光阱捕获并聚集样品室8蛋白质溶液中的蛋白质分子后，借助电荷耦合器件ccd 12和耦合有电子倍增探测器emccd 25的光谱仪24观察蛋白质结晶情况并记录蛋白质结晶过程的微弱的拉曼光谱信号，通过解算拉曼光谱信号解析蛋白质的结晶机理。所述的蛋白质溶液中蛋白质分子的尺寸可以是nm量级到μm量级。
24.(2)通过旋转第一半波片2调整形成三维稳定光阱的捕获激光功率，或调整样品室8中的蛋白质溶液浓度，或在第一二向色镜5和第二二向色镜6光路中增加四分之一波片来调整光场，借助电荷耦合器件ccd 12和耦合有电子倍增探测器emccd25的光谱仪24观察不同调控条件下的蛋白质结晶情况。
25.(3)根据步骤(2)中不同调控条件下的蛋白质结晶情况和根据步骤(1)得到的蛋白质结晶机理，调控光场、调整激光功率、实时调控蛋白质溶液浓度实现蛋白质的可控结晶，具体为：通过在30mw-500mw范围内调整形成光阱的捕获激光功率改变蛋白质的结晶速度；通过在5ng/ul-1mg/ml范围内调整蛋白质溶液的浓度，改变蛋白质的结晶晶体尺寸；通过调整光场为线偏光或圆偏光，改变蛋白质的结晶晶体构型。进而实现蛋白质的可控结晶。
26.实施例1
27.本实施例以蛋白质nug2的可控结晶为例，利用光镊可捕获并聚集微小蛋白质nug2样品，并利用对样品非接触无损伤的特性，实现蛋白质nug2的可控结晶。
28.实施步骤：
29.(1)将体积为30μl、浓度为30μg/μl的蛋白质nug2溶液注入样品室中，打开第一激光器1和第二激光器13，所述第一激光器1采用1064nm光纤耦合固态激光器，所述第二激光器13采用532nm光纤耦合固态激光器，实施过程中激光器输出稳定，即形成三维稳定捕获光
阱和用于拉曼激发的光功率一直保持稳定。待三维稳定捕获光阱捕获并聚集蛋白质溶液中的nug2分子后，借助电荷耦合器件ccd 12和耦合有电子倍增探测器emccd 25的光谱仪观察蛋白质结晶情况(如图3所示)并记录蛋白质结晶过程的拉曼光谱信号，通过解算拉曼光谱信号解析蛋白质nug2的结晶机理。
30.(2)通过旋转第一半波片调整形成三维稳定光阱的捕获激光功率，或调整样品室中的蛋白质nug2溶液浓度，或在第一二向色镜5和第二二向色镜6光路中增加四分之一波片，借助电荷耦合器件ccd 12和耦合有电子倍增探测器emccd 25的光谱仪观察不同调控条件下的蛋白质结晶情况。
31.(3)根据步骤(2)中不同调控条件下的蛋白质nug2结晶情况，通过在30mw-500mw范围内调整形成光阱的捕获激光功率改变蛋白质nug2的结晶速度；通过在5ng/ul-1mg/ml范围内调整蛋白质溶液的浓度，改变蛋白质nug2的结晶晶体尺寸；通过调整光场为线偏光或圆偏光，改变蛋白质nug2的结晶晶体构型。
32.最后所应说明的是，以上实施例和阐述仅用以说明本发明的技术方案而非进行限制。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，不脱离本发明技术方案公开的精神和范围的，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之中。