蝎子链霉菌LSS-F01及其在农作物真菌病害防治中的应用的制作方法

蝎子链霉菌lss-f01及其在农作物真菌病害防治中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体涉及的是一种蝎子链霉菌菌株及其在病害生物防治中的应用。


背景技术：

2.随着种植业的发展，大量使用农化产品，土壤的病害增多，如真菌病害、细菌病害病毒感染等，导致土壤酸化，板结，造成一些植物烂根，烂茎和烂果等症状出现，这些主要是由于土传病害的严重泛滥所致，特别是蔓延较快的真菌性病害，包括西瓜枯萎病，水稻纹枯病，水稻恶苗病，油菜菌核，百合根腐和百合镰刀菌等。为了减少此类型的土传病害，深耕土地、植物轮作、合理施肥、作物品种等为相对有效的物理手段。
3.微生物农药由于其绿色环保、不易产生抗药性等特点，在防治作物病虫害方面得到越来越广泛的重视和应用。微生物农药的推广和应用技术正逐渐趋于成熟，国家在生物防治领域的政策支持力度逐年加大，微生物农药的使用能克服化学农药对生态环境的污染并减少在农副产品中农药的残留，提升农副产品的品质和价格，既具有环境效益又具有经济效益。
4.随着人们生态意识的提高，生态农业、绿色农业、有机农业发展受到极大的关注，特别是绿色生态农业，例如是生物防控，并且作为抗生素的主要生产菌株，放线菌也逐渐走入了科学家的视野，链霉菌属是一类能产生抗生素的微生物菌属，链霉菌属有望成为继芽孢杆菌属和假单胞菌属后另一类在生物防治领域广泛应用的微生物农药。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种蝎子链霉菌(streptomyces scopuliridis)。
6.本发明的另一目的在于提供所述蝎子链霉菌在农作物病害防治上的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一株蝎子链霉菌(streptomyces scopuliridis)lss-f01，分离自湖南湘西卷丹百合土壤放线菌，并对其进行了部分真菌病害的拮抗筛选；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2021年11月4日，保藏编号cctccno: m20211361。
9.进一步的，所述拮抗性蝎子链霉菌通过以下方法筛选得到：采用平板对峙法，先将西瓜枯萎病病菌、水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌、油菜菌核病菌等病原菌接种在pda培养基上进行活化。在无菌操作台上，用打孔器在pda平板中央打一个孔，然后在中间孔的四周均匀打出四个同样大小的孔，根据菌株的拮抗能力，可分别放入放线菌和病原真菌，计算抑菌圈半径。每组3个重复置于28℃恒温培养箱中培养，观察真菌菌丝的长势和生长方向，4℃保存具有拮抗效果的菌株，做分子鉴定。
10.进一步的，所述蝎子链霉菌具有以下生物学特性：所述的蝎子链霉菌(streptomyces scopuliridis)lss-f01菌株在高氏一号固体培养基上的形态学特征为：气
生菌丝灰白色至灰色，营养菌丝浅黄色至黄色，产生少量浅黄色可溶性色素。
11.进一步的，所述蝎子链霉菌lss-f01可用于农作物病原真菌的防治，所述病原真菌包括但不限于农作物枯萎病、纹枯病、恶苗病、菌核病。
12.进一步的，所述蝎子链霉菌lss-f01可以制备成适合农业上使用的农药制剂。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的蝎子链霉菌能够有效抑制西瓜枯萎病病菌、水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌、油菜菌核病等病菌的生长，与其它传统的化学防治相比更加环保、无农药残留，不易产生抗药性。
附图说明
14.图1示出了蝎子链霉菌lss-f01菌株在培养基上的菌落形态；
15.图2示出了蝎子链霉菌lss-f01菌株的孢子图；
16.图3示出了蝎子链霉菌lss-f01菌株对7种不同病原菌的拮抗图；
17.图4示出了蝎子链霉菌lss-f01菌株的系统发育树。
具体实施方式
18.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或田间所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
19.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
20.一、菌株的分离和筛选
21.采用平板稀释法分离获得了50株来源湖南湘西卷丹百合土壤放线菌株，并对其进行了部分真菌病害的拮抗性试验筛选。
22.放线菌的分类及纯化：取土壤样品10.0g，80℃烘干箱干燥2小时，取1.0g干燥后土壤溶入30ml无菌水中，摇床180rpm处理30min，取出静置，取上清液液作为10-1初始液，依次获得10-2，10-3，10-4，10-5，10-6梯度稀释液(1ml土壤悬浮液加入到9毫升无菌水中)，取10-2，10-4和10-6各300μl分别涂布在高氏一号和改良的高氏一号分离培养基上，28℃培养3-4d，平板上有单个菌落长出，挑取单菌落在培养基上纯化3次，至最终获得纯化后菌株，鉴定并保存。
23.所述高氏1号培养基的配方如下：可溶性淀粉20.0g，kno
3 1.0g， nacl 0.5g，k2hpo4·
3h2o 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.4-7.6。
24.所述改良高氏1号培养基的配方如下：可溶性淀粉10.0g，kno
3 0.5g， nacl 0.25g，k2hpo4·
3h2o 0.25g，mgso4·
7h2o 0.25g，feso4·
7h2o 0.01g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.4-7.6。
25.拮抗放线菌的筛选：采用平板对峙法，先将西瓜枯萎病病菌，水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌、油菜菌核病菌、百合根腐病和百合镰刀菌接种在pda培养基上进行活化。在无菌操作台上，用打孔器在 pda平板中央打一个孔，然后在中间孔的四周均匀打出四个同样大小的孔，根据菌株的拮抗能力，可分别放入放线菌和病原真菌，测量抑菌半径。每组3个重复置于28℃恒温培养箱中培养，观察真菌菌丝的长势和生长方向，4℃保存具有拮抗效果
的菌株，做分子鉴定。
26.二、放线菌的鉴定
27.1、形态学鉴定
28.所述的蝎子链霉菌(streptomyces scopuliridis)菌株在高氏一号固体培养基上的形态学特征为：气生菌丝灰白色至灰色，营养菌丝浅黄色至黄色，产生少量浅黄色可溶性色素。
29.将蝎子链霉菌菌株接种到高氏一号培养基上，采用插片法28℃下培养14-21d，观察菌株的个体形态，在光学显微镜下观察其菌丝形态：孢子链的形态、孢子的形状如图2所示。
30.2、生理生化鉴定
31.参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的 isp系列培养基和方法测定lss-f01菌株的生理生化特性，如表1、表 2所示。
32.表1菌株培养特征(isp2-7为放线菌鉴定专用培养基)
[0033][0034]
表2菌株生理生化特性
[0035][0036]
备注：“ ”为阳性；
“‑”
为阴性；
[0037]
3、分子生物学鉴定
[0038]
①
从固体培养上刮取培养基表面丰富的气生菌丝，放置在提前冷冻过的研钵中；
[0039]
②
加入适量2
×
ctab溶液和适量灭菌干燥的细沙，在研钵(需高压灭菌后冰冻48h)中迅速研磨，或在液氮上研磨；
[0040]
③
研磨后，迅速移入1.5ml的ep管中，65℃水浴40min，每隔 10min轻轻地颠倒一次；
[0041]
④
取出，静置，冷却后，加等体积的氯仿：异戊醇混合液(24:1)充分混匀，4℃、
11000rpm/min离心10min；
[0042]
⑤
吸取上清液至新ep管中；
[0043]
⑥
用toyobo公司生产的凝胶回收试剂盒纯化，其操作过程参照说明书；
[0044]
⑦
加入30μl无菌水溶解dna，1.2％琼脂糖凝胶电泳。
[0045]
菌株分子生物学鉴定利用上海生工生物工程有限公司合成的通用引物
[0046]
27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’[0047]
1492r：5
’‑
acggttaccttgttacgactt-3’[0048]
扩增得到pcr产物，测序、校正之后得到lss-f01的部分16s rrna 基因序列用于放线菌的分子分类学鉴定。采用的pcr扩增体系：25μl 反应体系(模板dna 1μl，正反向引物各1μl，2
×
taq pcr master mix22μl)，放线菌反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火 1min，72℃延伸2min，32次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。鉴定结果表明该菌株属于链霉菌属，其分类命名为蝎子链霉菌 (streptomyces scopuliridis)。
[0049]
放线菌菌株的16s rrna基因序列及系统发育分析：获得菌株16srrna基因序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比对分析，采用mega 5.0构建系统进化树lss-f01菌株为streptomyces scopuliridis属于同一分支，其序列相似度为99.79％。通过形态特征和分子生物学鉴定结果，最终命名为蝎子链霉菌(streptomycesscopuliridis)。
[0050]
三、蝎子链霉菌对病原菌的抑菌活性测定
[0051]
采用平板对峙法，先将西瓜枯萎病病菌、水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌、油菜菌核病菌、百合根腐病菌和百合镰刀病菌接种在pda 培养基上进行活化。在无菌操作台上，用打孔器在pda平板中央打一个孔，然后在中间孔的四周均匀打出四个同样大小的孔，根据菌株的拮抗能力，可分别放入放线菌和病原真菌，测量抑菌半径，拮抗效果如表3所示。
[0052]
表3蝎子链霉菌对病原真菌的抑菌半径(cm)
[0053][0054]
由表3可知，本发明的蝎子链霉菌菌株对西瓜枯萎病病菌、水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌、油菜菌核病菌、百合根腐病病菌、百合镰刀病病菌具有较强的拮抗作用，利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的化学防治更加环保，无农药残留，不易产生抗药性。
[0055]
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。