双互补位FR-α抗体和免疫缀合物的制作方法

双互补位fr-α
抗体和免疫缀合物
发明领域
1.本公开的领域总体上涉及结合于人叶酸盐受体1(frα)的双互补位抗体和免疫缀合物。
2.发明背景
3.癌症是发达国家的主要死亡原因之一，仅在美国，每年就有超过一百万人经诊断患有癌症和500,000例死亡。总之，据估计超过三分之一的人将在其生命期间发展某一形式的癌症。
4.由缀合于与肿瘤相关抗原结合的抗体的高度细胞毒性剂构成的抗体-药物缀合物(adc)代表一种增强肿瘤靶向抗体的效能的有希望的治疗策略。adc提供组合抗体的有利药物动力学、生物分布和肿瘤靶向特性与由连接的小分子或有效载荷提供的有效细胞杀死机制的潜力。
5.叶酸盐受体-α(frα或folr1)是糖基磷脂酰肌醇连接的细胞表面糖蛋白，其对叶酸盐具有高亲和力。它在正常和癌组织中的生理学作用尚未得到充分阐明。大多数正常组织不表达frα，并且大多数细胞中生理叶酸盐的转运被认为由数种其他蛋白质、尤其还原叶酸盐载体介导。已经在浆液性和子宫内膜样上皮卵巢癌、子宫内膜腺癌以及腺癌亚型的非小细胞肺癌中发现高水平的frα。重要的是，frα在卵巢癌患者的转移性病灶和复发性癌中维持表达，并且在上皮卵巢和子宫内膜癌中在化学疗法之后维持表达。这些特性连同正常组织上frα的高度受限表达使得frα成为诸如adc的靶向疗法的高度有希望的靶。
6.米维妥昔单抗索拉文辛(mirvetuximab soravtansine，imgn853)是包含缀合于有效微管蛋白作用性类美登素dm4的frα靶向抗体的叶酸盐靶向adc，它最近在临床中在展现中等和高frα水平的铂抗性卵巢癌患者中进行评估。forward i 3期试验2:1随机化366名患者以接受米维妥昔单抗索拉文辛或医生选择的单剂化学疗法(聚乙二醇化脂质体多柔比星(doxorubicin)、拓扑替康(topotecan)或每周一次紫杉醇(paclitaxel))。虽然所述试验未达到其改进无进展存活(pfs)的主要终点(在总群体中，风险比(hr)＝0.98，p＝0.897)，但预规定的高frα子群体(218/366)使用imgn853治疗显示24％的总体反应率，相比之下，标准照护化学疗法的总体反应率为10％。另外，在预规定的高frα子群体中，与化学疗法相比接受imgn853的患者的pfs较长(hr＝0.69，p值＝0.049)，并且与化学疗法相比接受imgn853的患者的总体存活较长(hr＝0.62，p值＝0.033)。虽然这些结果对于表达高水平的frα的患者是振奋人心的，但所述结果还证明了imgn853在改进更广泛患者群体的无进展存活方面的局限性。
7.因此，仍需要鉴定可达成甚至更有效治疗和更高adc递送的另外的叶酸盐靶向adc。


技术实现要素：

8.本文提供一种特异性地结合人叶酸盐受体1(frα)的双互补位抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(a)第一frα结合域，其包含第一可变重链(vh)
和第一可变轻链(vl)并且结合于frα的第一表位；和(b)第二frα结合域，其包含第二vh和第二vl并且结合于frα的第二表位。
9.在一些实施方案中，所述第一frα结合域特异性地结合于与包含选自由seq id no:24、25和26组成的组的vh氨基酸序列和选自由seq id no:19、20和21组成的组的vl氨基酸序列的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第一frα结合域特异性地结合于与包含选自由seq id no:24、57和26组成的组的vh氨基酸序列和选自由seq id no:19、20和21组成的组的vl氨基酸序列的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第一frα结合域竞争性地抑制结合于与包含选自由seq id no:24、25和26组成的组的vh氨基酸序列和选自由seq id no:19、20和21组成的组的vl氨基酸序列的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第一frα结合域竞争性地抑制结合于与包含选自由seq id no:24、57和26组成的组的vh氨基酸序列和选自由seq id no:19、20和21组成的组的vl氨基酸序列的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第二frα结合域特异性地结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22或23和vl氨基酸序列seq id no:17或18的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第二frα结合域竞争性地抑制结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22或23和vl氨基酸序列seq id no:17或18的抗体相同的frα表位。
10.在一些实施方案中，所述第一vh包含vh cdr1-3，其分别包含氨基酸序列(a)seq id no:10-12或(b)seq id no:15、16和12，并且所述第一vl包含vl cdr1-3，其分别包含氨基酸序列seq id no:4-6。在一些实施方案中，所述第一vh包含选自由seq id no:24、25和26组成的组的氨基酸序列，和/或所述第一vl包含选自由seq id no:19、20和21组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一frα结合域竞争性地抑制结合于与包含选自由seq id no:24、57和26组成的组的vh氨基酸序列和选自由seq id no:19、20和21组成的组的vl氨基酸序列的抗体相同的frα表位。在一些实施方案中，所述第二vh包含vh cdr1-3，其分别包含氨基酸序列(a)seq id no:7-9或(b)seq id no:13、14和9，并且所述第二vl包含vl cdr1-3，其分别包含氨基酸序列seq id no:1-3。在一些实施方案中，所述第二vh包含氨基酸序列seq id no:22或23，和/或所述第二vl包含氨基酸序列seq id no:17或18。
11.在一些实施方案中，所述第一vh和vl对和/或所述第二vh和vl对是鼠科动物、非人、人化、嵌合、表面重塑或人的。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合于人frα，而非folr2或folr3。在一些实施方案中，所述第一frα结合域为单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述第一frα结合域的scfv具有vh-接头-vl的肽取向。在一些实施方案中，所述第一frα结合域的scfv具有vl-接头-vh的肽取向。在一些实施方案中，所述第二frα结合域为单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述第二frα结合域的scfv具有vh-接头-vl的肽取向。在一些实施方案中，所述第二frα结合域的scfv具有vl-接头-vh的肽取向。在一些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头。
12.在一些实施方案中，所述第二frα结合域包含选自seq id no:27-29的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一frα结合域包含选自seq id no:30-32的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列(i)seq id no:33和34，(ii)seq id no:35和36，(iii)seq id no:37和38，或(iv)seq id no:39和40。
13.在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列seq id no:41-43。
14.在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列seq id no:44-46。
15.在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段为四价双互补位抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段为二价双互补位抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含选自由串联scfv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和杵臼结构组成的组的frα结合域。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段具有杵臼(kih)结构。
16.在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含frα结合域，其中包含seq id no:1-3和7-9的frα结合域是在所述kih结构的杵侧上。在一些实施方案中，包含seq id no:1-3和7-9的frα结合域是在所述kih结构的臼侧上。在一些实施方案中，包含seq id no:4-6和10-12的frα结合域是在所述kih结构的杵侧上。在一些实施方案中，包含seq id no:4-6和10-12的frα结合域是在所述kih结构的臼侧上。
17.在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含全长抗体。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含第一frα结合域，其中所述第一frα结合域为全长抗体。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含第二frα结合域，其中所述第二frα结合域为全长抗体。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含第一frα结合域，其中所述第一frα结合域为抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含第二frα结合域，其中所述第二frα结合域为抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列seq id no:41-43。
18.在一些实施方案中，本文提供编码本文所公开的双互补位抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子的组合。
19.在一些实施方案中，本文提供一种分离的载体，其包含本文所公开的核酸分子之一。
20.在一些实施方案中，本文提供一种宿主细胞，其包含如本文所公开的分离的核酸分子的组合或如本文所公开的分离的载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是选自由组织培养物中的大肠杆菌(e.coli)、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)、酵母、cho、yb/20、ns0、per-c6、hek-293t、nih-3t3、hela、bhk、hep g2、sp2/0、r1.1、b-w、l-m、cos 1、cos 7、bsc1、bsc40、bmt10细胞、植物细胞、昆虫细胞和人细胞组成的组。
21.在一些实施方案中，本文提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的双互补位抗体或抗原、如本文所公开的核酸分子的组合、如本文所公开的载体或如本文所公开的宿主细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，如本文所提供的药物组合物包含如本文所公开的双互补位抗体和医药学载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均1至10个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均2至5个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均3至4个药物。
22.在一些实施方案中，本文提供一种制备如本文所公开的双互补位抗体的方法，其
包括(a)培养表达所述抗体的细胞；和(b)从培养的细胞分离所述抗体。在一些实施方案中，所述培养的细胞为真核细胞。
23.在一些实施方案中，本文提供一种免疫缀合物，其由下式表示：
[0024][0025]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0026]
cb是本文所提供的任何双互补位抗体或其抗原结合片段；
[0027]
l2是由下式之一表示：
[0028][0029][0030]
其中：
[0031]rx
、ry、r
x’和r
y’在每次出现时独立地为h、-oh、卤素、-o-(c
1-4
烷基)、-so3h、-nr
40r41r42
或任选地经-oh、卤素、so3h或nr
40r41r42
取代的c
1-4
烷基，其中r
40
、r
41
和r
42
各自独立地为h或c
1-4
烷基；
[0032]
l和k各自独立地为整数1至10；
[0033]
l1为整数2至5；
[0034]
k1为整数1至5；并且
[0035]
s1指示连接至细胞结合剂cb的位点并且s3指示连接至a基团的位点；
[0036]
a是氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
[0037]
r1和r2各自独立地为h或c
1-3
烷基；
[0038]
l1是由下式表示：
[0039]-cr3r
4-(ch2)
1-8-c(＝o)-[0040]
其中r3和r4各自独立地为h或me，并且l1中的-c(＝o)-部分连接至d；
[0041]
d是由下式表示：
[0042][0043]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0044]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物的r
x
、ry、r
x’和r
y’均为h；并且l和k各自独立地为整数整数2至6。在一些实施方案中，所述免疫缀合物的a是含有2至5个氨基酸残基的肽。
[0045]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物的a是选自由gly-gly-gly、ala-val、val-ala、d-val-ala、val-cit、d-val-cit、val-lys、phe-lys、lys-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、phe-ala、phe-n
9-甲苯磺酰基-arg、phe-n
9-硝基-arg、phe-phe-lys、d-phe-phe-lys、gly-phe-lys、leu-ala-leu、ile-ala-leu、val-ala-val、ala-ala-ala、d-ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala-d-ala、ala-leu-ala-leu(seq id no:54)、β-ala-leu-ala-leu(seq id no:55)、gly-phe-leu-gly(seq id no:56)、val-arg、arg-arg、val-d-cit、val-d-lys、val-d-arg、d-val-cit、d-val-lys、d-val-arg、d-val-d-cit、d-val-d-lys、d-val-d-arg、d-arg-d-arg、ala-ala、ala-d-ala、d-ala-ala、d-ala-d-ala、ala-met、gln-val、asn-ala、gln-phe、gln-ala、d-ala-pro和d-ala-tbu-gly组成的组，其中各肽中的第一氨基酸连接至l2基团并且各肽中的最后一个氨基酸连接至-nh-cr1r
2-s-l
1-d。在一些实施方案中，所述免疫缀合物的r1和r2均为h。在一些实施方案中，所述免疫缀合物的l1为-(ch2)
4-6-c(＝o)-。
[0046]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物的d是由下式表示：
[0047]
[0048]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0049][0050][0051]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0052]
是经由lys胺基连接至l2基团的本文所提供的任何双互补位抗体或其抗原结合片段；
[0053]
是经由cys硫醇基连接至l2基团的本文所提供的任何双互补位抗体或其抗原结合片段；
[0054]
r3和r4各自独立地为h或me；
[0055]
m1、m3、n1、r1、s1和t1各自独立地为整数1至6；
[0056]
m2、n2、r2、s2和t2各自独立地为整数1至7；
[0057]
t3为整数1至12；
[0058]
d1是由下式表示：
[0059][0060]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0061][0062]
其中：
[0063]
m1和m3各自独立地为整数2至4；
[0064]
m2为整数2至5；
[0065]
r1为整数2至6；并且
[0066]
r2为整数2至5。
[0067]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物的a是ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala、d-ala-ala、val-ala、d-val-ala、d-ala-pro或d-ala-tbu-gly。
[0068]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075][0076]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0077]
a是ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala、d-ala-ala、val-ala、d-val-ala、d-ala-pro或d-ala-tbu-gly，并且
[0078]
d1是由下式表示：
[0079][0080]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0081]
[0082][0083]
其中d1是由下式表示：
[0084][0085]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0086][0087]
其中：
[0088]
cba是本文所提供的任何双互补位抗体或其抗原结合片段；q是整数1至10，例如1或10；
[0089]
d1是由下式表示：
[0090][0091]
在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0092]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0093][0094]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0095]
cba是包含氨基酸序列seq id no:41-43的双互补位抗体或抗原结合片段；
[0096]
d1是由下式表示：
[0097]
并且
[0098]
q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0099]
在一些实施方案中，本文公开具有式(a)-(l)-(c)的免疫缀合物，其中：
[0100]
(a)是本文所提供的任何双互补位抗体或抗原结合片段；
[0101]
(l)是接头；并且
[0102]
(c)是细胞毒性剂，其中接头(l)将(a)连接至(c)。
[0103]
在一些实施方案中，本文所公开的免疫缀合物的接头是选自由可裂解接头、不可裂解接头、亲水性接头和基于二羧酸的接头组成的组。在一些实施方案中，所述接头是选自由以下组成的组：n-(γ顺丁烯二酰亚胺基丁酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-gmbs或sgmbs)、γ顺丁烯二酰亚胺基丁酸n-丁二酰亚胺酯(gmbs)、n-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-spdb)；n-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(spp)或n-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基戊酸酯(磺基-spp)；n-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶
基二硫基)丁酸酯(spdb)、n-丁二酰亚胺基4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(smcc)；n-磺基丁二酰亚胺基4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基smcc)；n-丁二酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(siab)；和n-丁二酰亚胺基-[(n-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(nhs-peg4-顺丁烯二酰亚胺)。
[0104]
在一些实施方案中，所述接头是磺基-gmbs。
[0105]
在一些实施方案中，所述接头是gmbs。
[0106]
在一些实施方案中，所述接头是磺基-spdb。
[0107]
在一些实施方案中，本文所公开的免疫缀合物的细胞毒性剂是选自由类美登素、类美登素类似物、苯二氮平、类紫杉醇、cc-1065、cc-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、尾海兔素(dolastatin)、尾海兔素类似物、澳瑞他汀(auristatin)、茅层霉素(tomaymycin)衍生物和来普霉素(leptomycin)衍生物或所述剂的前药组成的组。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂为类美登素。
[0108]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物还包含第二(c)。在一些实施方案中，所述免疫缀合物还包含第三(c)。在一些实施方案中，所述免疫缀合物还包含第四(c)。
[0109]
在一些实施方案中，本文提供一种包含至少一种如本文所公开的免疫缀合物的组合物，其中所述免疫缀合物包含每个a平均3-4个c。
[0110]
在一些实施方案中，本文提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的免疫缀合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均1至10个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均2至5个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个抗体或其抗原结合片段平均3至4个药物。
[0111]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合片段、如本文所公开的免疫缀合物或如本文所公开的药物组合物。
[0112]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌、子宫癌、腹膜癌、输卵管癌、子宫内膜癌、肺癌或脑癌。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述卵巢癌是铂抗性上皮卵巢癌。在一些实施方案中，所述卵巢癌是复发性上皮卵巢癌。在一些实施方案中，所述卵巢癌是铂难治性上皮卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是子宫癌。在一些实施方案中，所述癌症是腹膜癌。在一些实施方案中，所述癌症是输卵管癌。在一些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是脑癌。在一些实施方案中，所述癌症是imgn853抗性的。
[0113]
在一些实施方案中，所述方法还包括施用类固醇。
附图说明
[0114]
图1通过facs示出humov19-生物素与叶酸盐受体抗体fr57；frα抗体a(“frα-a”)；frα抗体b(“frα-b”)；frα抗体c(“frα-c”)；和非生物素化humov19(“humov19”)的结合竞争。(参见实施例1。)
[0115]
图2示出常规单特异性抗体(诸如humov19和fr57)、二价双互补位杵臼(kih)抗体
和四价双互补位(morrison)抗体的示例性分子、特征和示意图。(参见实施例1。)
[0116]
图3示出用于产生基于不对称-fc的分子的数种重链和轻链质粒转染比率的凝胶。l1：仅用fr57scfv-杵转染；l2：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以4:4:1转染；l3：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以6:2:1转染；l4：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以6:6:1转染；l5：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以9:3:1转染；l6：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以2:3:1转染；l7：mov19lc:mov19hc-臼:fr57scfv-杵以1:1:1转染；l8：mov19 lc:mov19-臼以3:1转染；l9：同型人igg1转染。(参见实施例1。)
[0117]
图4a-4h通过竞争facs示出morrison的抗体或其片段的结合活性。(参见实施例2。)。具体说来，图4a示出mov19-g1-fr57scfv1(m9346a-fr57scfv)的结合活性；图4b示出fr57-g1-mov19scfv1(fr57-m9346ascfv)的结合活性；图4c示出mov19-g1-frα-抗体-a-scfv1(m9346a-fr-α-a:scfv)的结合活性；图4d示出frα-抗体-a-g1-mov19scfv1(fr-α-a:m9346ascfv)的结合活性；图4e示出frα-抗体-a-scfv2-g1-mov19(fr-α-a:scfv-m9346a)的结合活性；图4f示出frα-抗体-b-scfv2-g1-mov19(fr-α-b:scfv-m9346a)的结合活性；图4g示出frα-抗体-c-scfv2-g1-mov19(fr-α-c:scfv-m9346a)的结合活性；并且图4h示出fr57scfv2-g1-mov19(fr57scfv-m9346a)的结合活性。
[0118]
图5示出fr57scfv2-杵-mov19-臼抗体的三种纯化制剂(p1、p2和p3)在非还原和还原条件下的sds page凝胶。所述fr57scfv2-杵-mov19-臼抗体是呈杵臼(kih)形式的双互补位抗体，其中fr57scfv在所述抗体的杵侧并且humov19抗体序列在所述抗体的臼侧。
[0119]
(参见实施例2。)
[0120]
图6示出由fr57scfv2-杵-mov19-臼抗体的第0天和第14天样品获得的尺寸排阻色谱结果的覆盖图。mau：毫吸光度单位。(参见实施例2。)
[0121]
图7a-7f示出与humov19(“亲本”)抗体相比，杵臼(kih)双互补位抗体(图7a、7c和7e)或四价双互补位抗体(图7b、7d和7f)的结合(图7a和7b)、内化和处理(图7c和7d)和降解(图7e和7f)。(参见实施例2。)
[0122]
图8示出在施用媒剂、含四价双互补位抗体的免疫缀合物(“四价-s-spdb-dm4”)或含humov19抗体的免疫缀合物(“m-s-spdb-dm4”)之后，ov-90异种移植物模型中的中值肿瘤体积。(参见实施例4。)
[0123]
图9示出在施用媒剂、四价-s-spdb-dm4或m-s-spdb-dm4之后，igrov-1异种移植物模型中的中值肿瘤体积。(参见实施例4。)
[0124]
图10示出在施用媒剂、含杵臼双互补位抗体的免疫缀合物(“kih-s-spdb-dm4”)或m-s-spdb-dm4之后，ov-90异种移植物模型中的中值肿瘤体积。(参见实施例4。)
[0125]
图11示出含fr57抗体的免疫缀合物(fr57-l-dm21)或含humov19抗体的免疫缀合物(m-l-dm21)针对kb细胞的细胞毒性活性。(参见实施例5。)
[0126]
图12a-12e示出双互补位kih-dm21免疫缀合物、humov19免疫缀合物m-dm21和humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4针对包括kb细胞(图12a)、igrov-1细胞(图12b)、jeg-3细胞(图12c)、t47d细胞(图12d)和jhos-4细胞(图12e)在内的frα阳性细胞系的组的细胞毒性活性。(参见实施例5。)
[0127]
图13a-13d示出双互补位kih-l-dm21免疫缀合物、humov19免疫缀合物m-l-dm21和humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4在与kb细胞(图13a)、igrov-1细胞(图13b)、jeg-3细胞
(图13c)和t47d细胞(图13d)混合的靶阴性细胞namalwa/luc中的体外旁观者杀死活性。(参见实施例5。)
[0128]
图14a和图14b示出在向ov-90异种移植物模型施用双互补位免疫缀合物kih-l-dm21和humov19免疫缀合物m-l-dm21(图14a)或双互补位免疫缀合物kih-s-spdb-dm4和humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4(图14b)之后的中值肿瘤体积。(参见实施例6。)
[0129]
图15示出与媒剂、humov19免疫缀合物m-l-dm21或humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4(“imgn853”)相比，在向ishikawa异种移植物模型施用双互补位kih-l-dm21免疫缀合物之后的中值肿瘤体积。(参见实施例6。)
[0130]
图16示出与媒剂、humov19免疫缀合物m-l-dm21或humov19免疫缀合物imgn853相比，在向igrov-1异种移植物模型施用双互补位kih-l-dm21免疫缀合物之后的中值肿瘤体积。(参见实施例6。)
[0131]
图17示出与媒剂、humov19免疫缀合物m-l-dm21或humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4相比，在向kb异种移植物模型施用双互补位kih-l-dm21免疫缀合物之后的中值肿瘤体积。(参见实施例7。)
[0132]
图18a和图18b示出与总抗体(tab：总抗体；缀合和未缀合)相比，双互补位kih-sspdb-dm21免疫缀合物(图18a)和humov19免疫缀合物m-s-spdb-dm4(“imgn853”)(图18b)的毒性。(参见实施例7。)
[0133]
图19示出与媒剂、humov19免疫缀合物m9346a-dm21-l或humov19免疫缀合物imgn853相比，在向imgn853抗性kb人子宫颈癌异种移植物模型施用双互补位kih-l-dm21免疫缀合物之后的中值肿瘤体积。(参见实施例6。)
具体实施方式
[0134]
i.定义
[0135]
为了促进理解本公开，下文定义多个术语和措辞。
[0136]
除非另外指示，否则如本文所用，术语“人叶酸盐受体1”、“frα”、“叶酸盐受体α(fr-α)”或“folr1”是指任何原生人frα多肽。术语“frα”涵盖“全长”未处理frα多肽以及由细胞内的处理产生的任何形式的frα多肽。所述术语还涵盖frα的天然存在的变体，例如由剪切变体和等位基因变体编码的那些。本文所述的frα多肽可从多种来源，诸如从人组织类型或从另一来源分离，或通过重组或合成方法制备。在特定指示的情况下，“frα”可用于指编码frα多肽的核酸。人frα序列是已知的并且包括例如在uniprotkb登录号p15328处公开可得的序列(包括同功异型物)。如本文所用，术语“人frα”是指包含序列seq id no:53的frα。
[0137]
maqrmttqlllllvwvavvgeaqtriawartellnvcmnakhhkekpgpedklheqcrpwrknaccstntsqeahkdvsylyrfnwnhcgemapackrhfiqdtclyecspnlgpwiqqvdqswrkervlnvplckedceqwwedcrtsytcksnwhkgwnwtsgfnkcavgaacqpfhfyfptptvlcneiwthsykvsnysrgsgrciqmwfdpaqgnpneevarfyaaamsgagpwaawpfllslalmllwlls(seq id no:53)。
[0138]
术语“抗frα抗体”或“结合于frα的抗体”是指能够以充足亲和力结合frα的抗体，以致所述抗体可用作靶向frα的诊断和/或治疗剂。如本文所用，所述抗体包括例如双特异性(例如双互补位)抗体。除非另外规定，否则抗frα抗体与无关、非frα蛋白的结合程度小于
所述抗体与frα的结合的约10％，如例如通过放射性免疫分析(ria)所测量。frα抗体的实例是本领域中已知的并且公开于美国公布申请号2012/0009181和2012/0282175和美国专利号9,200,073b2以及pct公布wo 2011/106528 a1中，所述文献中的每一者均以引用的方式整体并入本文中。示例性抗frα抗体和其抗原结合片段的序列提供于表1-8中。
[0139]
术语“imgn853”(还称作“米维妥昔单抗索拉文辛”)是指本文所述的免疫缀合物，其含有humov19(或m9346a)抗体、磺基spdb接头和dm4类美登素。“humov19”(或“m9346a”)抗体是包含全长重链seq id no:47(包含可变重链序列seq id no:24，其在下文seq id no:47的背景中加下划线)和全长轻链seq id no:48(包含可变轻链序列seq id no:19，其在下文seq id no:48的背景中加下划线)的抗frα抗体。
[0140]
qvqlvqsgaevvkpgasvkisckasgytftgyfmnwvkqspgqslewigrihpydgdtfynqkfqgkatltvdkssntahmellsltsedfavyyctrydgsramdywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:47)
[0141]
divltqsplslavslgqpaiisckasqsvsfagtslmhwyhqkpgqqprlliyrasnleagvpdrfsgsgsktdftltispveaedaatyycqqsreypytfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:48)
[0142]
humov19(m9346a)抗体是由质粒编码，所述质粒在2010年4月7日根据布达佩斯条约的条款寄存于位于10801university boulevard,manassas,va 20110处的american type culture collection(atcc)并且具有atcc寄存号pta-10772和pta-10773或10774。dm4是指n2
’‑
脱乙酰基-n2
’‑
(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)类美登素。“磺基spdb”是指n-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯)接头。
[0143]
术语特定肿瘤、组织或细胞样品中“升高的”frα、frα的“增加的表达”或frα的“过表达”是指frα(frα多肽或编码此类多肽的核酸)以高于存在于相同类型或起源的健康或非患病(原生、野生型)组织或细胞中的水平的水平存在。所述增加的表达或过表达可例如由突变、基因扩增、增加的转录、增加的翻译或增加的蛋白质稳定性引起。
[0144]
可通过免疫组织化学测量frα表达并且通过与展现规定分数的经校准对照进行比较来给出“染色强度分数”或“染色均一性分数”(例如，如果强度与水平3经校准对照可相当，那么对测试样品给予强度分数3，或如果强度与水平2经校准对照可相当，那么对测试样品给予强度分数2)。例如，通过免疫组织化学测量的分数1、2或3或优选地分数2或3指示frα的增加的表达。呈异质或均质的染色均一性还指示frα表达。染色强度和染色均一性分数可单独或组合(例如2均质、2异质、3均质、3异质等)使用。染色均一性还可表述为以某一强度染色的细胞的百分比(％)(例如，25％细胞以强度1、2或3染色；50％细胞以强度1、2或3染色；70％细胞以强度1、2或3染色)。在另一实施例中，可通过检测相对于对照值(例如，来自未患癌症或患有未具有升高的frα值的癌症的受试者的组织或细胞中的表达水平)至少2倍、至少3倍或至少5倍的增加来测定frα表达的增加。可通过免疫组织化学测量frα表达并
且给出视觉分数，其中frα阳性可指大于或等于50％的肿瘤细胞具有在小于或等于10x显微镜物镜下可见的frα膜染色。
[0145]
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其经由所述免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并且特异性地结合于靶，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述各物的组合。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白和任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体展现所需生物活性即可。如本文所用，所述抗体包括例如双特异性(例如双互补位)抗体。抗体基于其重链恒定域的属性(分别称作α、δ、ε、γ和μ)可为免疫球蛋白的五种主要类别中的任一者：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同并且众所周知的次单元结构和三维构型。抗体可以是裸的或缀合于其他分子，诸如毒素、放射性同位素等。
[0146]
术语“抗体片段”或“其抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指完整抗体中结合于抗原的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体片段可以是裸的或缀合于其他分子，诸如毒素、放射性同位素等。
[0147]“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指牵涉于单一抗原决定子或表位的高度特异性识别和结合中的均质抗体或抗原结合片段群体。这与多克隆抗体形成对照，多克隆抗体典型地包括针对不同抗原决定子的不同抗体。术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体，以及抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以多种方式制得的所述抗体和其抗原结合片段，所述方式包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
[0148]
术语“人化”抗体或其抗原结合片段是指非人(例如鼠科动物)抗体或抗原结合片段的形式，所述形式为特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人(例如鼠科动物)序列的片段。典型地，人化抗体或其抗原结合片段是其中来自互补决定区(cdr)的残基由来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的cdr的残基置换的具有所需特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(“cdr移植”)(jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基是由来自非人物种的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体或片段中的相应残基置换。可通过fv框架区中和/或经置换的非人残基内的另外的残基的取代进一步修饰所述人化抗体或其抗原结合片段以细化和优化抗体或其抗原结合片段的特异性、亲和力和/或能力。一般说来，所述人化抗体或其抗原结合片段将包含大体上全部的至少一个并且典型地两个或三个可变域，所述可变域含有全部或大体上全部的对应于非人免疫球蛋白的cdr区，而全部或大体上全部fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人化抗体或其抗原结合片段还可包含免疫球蛋白恒定区或域(fc)(典型地，人免疫球蛋白的恒定区或域)的至少一部分。用于产生人化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；roguska等人,proc.natl.acad.sci.,usa,91(3):969-973(1994)，和roguska等人,protein eng.9(10):895-904(1996)中。在一些实施方案中，“人化抗体”是表面重塑抗体。
[0149]
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独或组合。重链和轻链的可变区各自由四个通过三个互补决定区(cdr)(还称作高变区)连接的框架区(fr)组成。各链中的cdr通过fr紧密地保持在一起并且与来自另一链的cdr一起促进形成抗体的抗原结合位点。存在至少两种用于测定cdr的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即，kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,(第5版,1991,national institutes of health,bethesda md.)，“kabat”)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(al-lazikani等人,j.molec.biol.273:927-948(1997))。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于测定cdr。
[0150]
抗体的“恒定”区未直接牵涉于抗体与抗原的结合中，但展现多种效应子功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
[0151]
当提及可变域中的残基(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，一般使用kabat编号系统(例如kabat等人,sequences of immunological interest.第5版,1991,national institutes of health,bethesda,md.)(“kabat”)。
[0152]
如kabat中的氨基酸位置编号是指在kabat等人(sequences of immunological interest.第5版,1991,national institutes of health,bethesda,md.)(“kabat”)中用于抗体的汇编的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用这种编号系统，实际线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，其对应于可变域的fr或cdr的缩短或插入其中。例如，重链可变域可包括在h2的残基52后面的单一氨基酸插入(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82后面插入的残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。残基的kabat编号可针对给定抗体通过在所述抗体的序列的同源区处与“标准”kabat编号序列比对来测定。而chothia指出结构环的位置(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。当使用kabat编号惯例编号时chothia cdr-h1环的末端在h32与h34之间变化，视所述环的长度而定(这是因为kabat编号方案将插入放置于h35a和h35b处；如果35a和35b均不存在，那么所述环在32处结束；如果仅35a存在，那么所述环在33处结束；如果35a和35b均存在，那么所述环在34处结束)。abm高变区表示在kabat cdr与chothia结构环之间的折衷，并且由oxford molecular的abm抗体建模软件使用。
[0153][0154]
术语“人”抗体或其抗原结合片段意指由人产生的抗体或其抗原结合片段，或使用本领域中已知的任何技术制得的具有对应于由人产生的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段的这种定义包括完整或全长抗体
和其片段。
[0155]
术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指其中氨基酸序列是源于两种或更多种物种的抗体或其抗原结合片段。典型地，轻链和重链的可变区对应于源于一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体或其抗原结合片段的可变区，而恒定区与源于另一物种(通常为人)的抗体或其抗原结合片段中的序列同源以避免在那一物种中引发免疫反应。
[0156]
术语“表位”或“抗原决定子”在本文中可互换使用并且是指抗原中能够由特定抗体识别并且特异性地结合的那一部分。当抗原为多肽时，表位可由连续氨基酸和通过蛋白质的三重折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在蛋白质变性时典型地经保持，而通过三重折叠形成的表位在蛋白质变性时典型地丧失。表位典型地包括呈独特空间构形的至少3个并且更通常地至少5个或8-10个氨基酸。
[0157]“结合亲和力”一般是指在分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的合计强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其搭配物y的亲和力一般可由解离常数(kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法，包括本文所述的那些来测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且倾向于快速地解离，而高亲和力抗体一般更快结合抗原并且倾向于保持更久结合。本领域中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一者均可用于本公开的目的。
[0158]
当在本文中用于指结合亲和力时，“或更佳”是指分子与其结合搭配物之间的较强结合。当在本文中使用时，“或更佳”是指由较小kd数值表示的较强结合。例如对抗原具有“0.6nm或更佳”的亲和力的抗体，所述抗体对所述抗原的亲和力是《0.6nm，即0.59nm、0.58nm、0.57nm等，或小于0.6nm的任何值。
[0159]“特异性地结合”一般意指抗体经由其抗原结合域结合于表位，并且所述结合使得所述抗原结合域与所述表位之间需要一些互补性。根据这种定义，与抗体将结合于随机、无关表位相比，当抗体更快速地经由其抗原结合域结合于一个表位时，据说所述抗体“特异性地结合”于那一表位。术语“特异性”在本文中用于限定特定抗体结合于特定表位时的相关亲和力。例如，抗体“a”可被认为与抗体“b”相比对给定表位具有较高特异性，或据说与抗体“a”对相关表位“d”的特异性相比，抗体“a”可以较高特异性结合于表位“c”。
[0160]“优先地结合”意指与所述抗体将结合于相关、相似、同源或类似表位相比，所述抗体更容易特异性地结合于一个表位。因此，“优先地结合”于给定表位的抗体与结合于相关表位相比将更有可能结合于那一表位，即使此类抗体可与所述相关表位交叉反应。
[0161]
如果抗体优先地结合于给定表位或重叠表位，达到使其在某种程度上阻断参考抗体与所述表位的结合的程度，那么据说所述抗体“竞争性地抑制”所述参考抗体与那一表位的结合。竞争性抑制可通过本领域中已知的任何方法，例如竞争elisa分析来测定。据说抗体可竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合达至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
[0162]
如本文所用，措辞“大体上相似”或“大体上相同”表示两个数值(一般说来，一个数值与本公开的抗体相关并且另一数值与参考/比较物抗体相关)之间足够高程度的相似性，以致本领域技术人员将认为所述两个值之间的差异在通过所述值(例如kd值)量度的生物
特征的背景内不重要或不具有生物和/或统计学显著性。所述两个值之间的差异可小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％，随针对参考/比较物抗体的值而变。
[0163]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可为线性或分支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。所述术语还涵盖已经天然地或通过干预经修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应理解，因为本公开的多肽是基于抗体，所以在某些实施方案中，所述多肽可作为单链或缔合链存在。
[0164]
如本文中可互换使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过dna或rna聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在核苷酸结构的修饰，那么可在聚合物的组装之前或之后赋予所述修饰。核苷酸的序列可由非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步经修饰，诸如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如一种或多种天然存在的核苷酸用类似物进行的“帽”取代；核苷酸间修饰，诸如具有不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有诸如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚l-赖氨酸等)的悬垂部分的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、具有经修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基均可例如由膦酸酯基、磷酸酯基置换，由标准保护基保护，或经活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或可缀合于固体支撑物。5'和3'端oh可磷酸化或由胺或1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。也可将其他羟基衍生化至标准保护基。多核苷酸还可含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-o-甲基-、2'-o-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和非碱性核苷酸类似物(诸如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可由替代的连接基团置换。这些替代的连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯由p(o)s(“硫代酯”)、p(s)s(“二硫代酯”)、“(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch2(“甲缩醛”)置换，其中各r或r'独立地为h或任选地含有醚(
‑‑o‑‑
)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代的烷基(1-20c)。并非多核苷酸中的所有键均需要同一。先前描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。
[0165]
术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并且任选地表达一种或多种所关注的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、柯斯质粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、封装于脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核细胞(诸如生产细胞)。
[0166]“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组
合物包括已经纯化至其不再呈其在自然界中发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是大体上纯的。
[0167]
如本文所用，“大体上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
[0168]
术语“同一”或“同一性百分比”在两种或更多种核酸或多肽的背景中是指两个或更多个序列或子序列，当针对最大对应进行比较和比对(必要时引入间隙)，而不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守氨基酸取代时，所述序列或子序列是相同的或具有规定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查来测量同一性百分比。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件。序列比对算法的一种所述非限制性实例是描述于karlin等人,proc.natl.acad.sci.,87:2264-2268(1990)中的算法，如karlin等人,proc.natl.acad.sci.,90:5873-5877(1993)中加以修改，并且并入至nblast和xblast程序中(altschul等人,nucleic acids res.,25:3389-3402(1991))。在某些实施方案中，可使用如altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997)所述的间隙blast。blast-2、wu-blast-2(altschul等人,methods in enzymology,266:460-480(1996))、align、align-2(genentech,south san francisco,california)或megalign(dnastar)是可用于比对序列的另外的公开可得软件程序。在某些实施方案中，使用gcg软件中的gap程序来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比(例如，使用nwsgapdna.cmp矩阵和间隙权重40、50、60、70或90和长度权重1、2、3、4、5或6)。在某些替代的实施方案中，gcg软件包中的gap程序并入needleman和wunsch算法(j.mol.biol.(48):444-453(1970))，其可用于测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，和间隙权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5)。或者，在某些实施方案中，使用myers和miller算法(cabios,4:11-17(1989))来测定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可使用align程序(2.0版)并且使用具有残基表的pam120、间隙长度罚分12和间隙罚分4来测定同一性百分比。可由本领域技术人员确定用于通过特定比对软件实现最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分比“x”是计算为100
×
(y/z)，其中y是在所述第一和第二序列的比对中经评分为同一匹配(如通过视觉检查或特定序列比对程序所比对)的氨基酸残基的数目并且z是所述第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，那么第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
[0169]
作为非限制性实例，与参考序列具有特定百分比的“序列同一性”(例如至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一并且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％或99％同一)的无论任何特定多核苷酸均可在某些实施方案中使用bestfit程序(wisconsin sequence analysis package,unix 8版,genetics computer group,university research park,575science drive,madison,wi 53711)来测定。bestfit使用smith和waterman的局部同源性算法(advances in applied mathematics 2:482 489(1981))来发现两个序列之间的最佳同源区段。当根据本公开使用bestfit或任何其他序列比对程序来测定特定序列是否与参考序列例如95％同一时，设置参数以致在参考核苷酸序列的全长内计算同一性百分比并且允许参考序列中的核苷酸总数的多达5％的同源间隙。
[0170]“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基由具有相似侧链的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在一些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代并未废除含有所述氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(即，所述多肽或抗体所结合的frα)的结合。鉴定未消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中众所周知的(参见例如brummell等人,biochem.32:1180-1 187(1993)；kobayashi等人protein eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natl.acad.sci.usa 94:.412-417(1997))。
[0171]“双特异性抗体”是指结合于两个不同表位的抗体。所述表位可在同一靶抗原上或可在不同靶抗原上。
[0172]“双互补位抗体”是结合于同一靶抗原(例如frα)上的两个不同的非重叠表位的双特异性抗体。
[0173]
在一些实施方案中，本文所公开的frα抗体或其抗原结合片段为多价分子。如本技术内所用的术语“价态”表示抗体分子中存在规定数目的结合位点。根据本发明的例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且为“二价”。术语“四价”表示抗原结合蛋白中存在四个结合位点。术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。如本文所用，术语“双特异性、四价”表示根据本发明的抗原结合蛋白具有四个抗原结合位点，其中至少一者结合于第一抗原并且至少一者结合于第二抗原或所述抗原的另一表位。
[0174]
如本文所用，术语“免疫缀合物”或“缀合物”是指连接至细胞结合剂的化合物或其衍生物并且由以下通式定义：c-l-a，其中c＝细胞毒素，l＝接头，并且a＝抗体或其抗原结合片段(例如抗frα抗体或抗体片段)。免疫缀合物还可依逆序由以下通式定义：a-l-c。
[0175]“接头”是能够以稳定、共价方式将化合物(通常为药物，诸如类美登素)连接至诸如抗frα抗体或其抗原结合片段的细胞结合剂的任何化学部分。接头在使所述化合物或所述抗体保持活性的条件下可易经受或大体上抵抗裂解(例如酸诱导性裂解、光诱导性裂解、肽酶诱导性裂解、酯酶诱导性裂解或二硫键裂解)。合适的接头是本领域中众所周知的并且包括例如二硫基和硫醚基。
[0176]
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或预防一种或多种细胞功能和/或引起细胞死亡的物质。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂为类美登素，例如dm21。包含dm21的免疫缀合物公开于wo 2018/160539 a1中，该案以引用的方式整体并入本文中。
[0177]
免疫缀合物可包含由以下结构式表示的“dm21c”的位点特异性dm21连接：
[0178]
其中d1为：
[0179][0180]
免疫缀合物还可包含赖氨酸连接的dm21“l-dm21”、“dm21-l”或“dm21l”，其由以下结构式表示：
[0181]
其中d1显示于上文，通过例如γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酸n-丁二酰亚胺酯(gmbs)或n-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-gmbs或sgmbs)接头的接头偶合至抗体。gmbs和磺基-gmbs(或sgmbs)接头是本领域中已知的并且可由以下结构式表示：
[0182][0183]“任选的”或“任选地”意指随后描述的情形可以发生或可以不发生，使得所述申请包括其中所述情形发生的情况和其中所述情形不发生的情况。例如，措辞“任选地取代”意指非氢取代基可以存在或可以不存在于给定原子上，并且因此所述申请包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。
[0184]
术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中的生理学疾患，其中细胞群体的特征在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定实例包括输卵管癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌和多种类型的头颈部癌。所述癌症可以是表达frα的癌症(“frα表达性癌”)。
[0185]
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法相等形式是指源于肿瘤或癌前病变的细胞的总
群体，包括非肿瘤发生细胞(其占肿瘤细胞群体的大部分)和肿瘤发生干细胞(癌症干细胞)。如本文所用，当术语“肿瘤细胞”仅指缺乏复原和分化能力的那些肿瘤细胞时，其将由术语“非肿瘤发生”修饰以区别那些肿瘤细胞与癌症干细胞。
[0186]“晚期”癌症是已经通过局部侵袭或转移扩散至起源位点或器官的外部的癌症。术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病两者。
[0187]“转移性”癌症是指已经从身体的一部分扩散至身体的另一部分的癌症。
[0188]“难治性”癌症是即使向癌症患者施用诸如化学疗法的抗肿瘤治疗仍进展的癌症。
[0189]“复发性”癌症是在对初始疗法作出反应之后在初始位点处或在远程位点处已经再生长的癌症。
[0190]“复发型”患者是在缓解之后具有癌症的病征或症状的患者。任选地，所述患者在辅助或新辅助疗法之后已经复发。
[0191]
术语“维持疗法”是指为了帮助阻止癌症在它已经在初始疗法后消失之后复发而给予的疗法。
[0192]
术语“受试者”是指打算作为特定治疗的接受者的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。典型地，术语“受试者”和“患者”在本文中关于人受试者可互换使用。
[0193]
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分的制剂。所述制剂可以是无菌的。
[0194]
如本文所公开的抗体、免疫缀合物或其他药物的“有效量”是足以进行特定陈述的目的的量。
[0195]
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的抗体、免疫缀合物或其他药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可减少癌细胞数目；减少肿瘤大小或负荷；抑制(即，在某种程度上减慢并且在特定实施方案中停止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即，在某种程度上减慢并且在特定实施方案中停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；在某种程度上减轻与所述癌症相关的一种或多种症状；和/或引起有利反应，诸如增加的无进展存活(pfs)、无疾病存活(dfs)或总体存活(os)、完全反应(cr)、部分反应(pr)，或在一些情况下引起稳定疾病(sd)、进行性疾病(pd)减弱、缩短的进展时间(ttp)或其任何组合。参见本文中“治疗”的定义。就所述药物可预防生长和/或杀死现有癌细胞来说，它可以是细胞抑制性和/或细胞毒性的。
[0196]
诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)或“缓解(alleviating)”或“以缓解(to alleviate)”的术语是指治愈、减慢诊断出的病理疾患或病症、减轻其症状和/或停止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已经诊断出患有所述病症或疑似患有所述病症的那些。在某些实施方案中，如果患者显示以下一者或多者，那么根据本公开的方法成功地“治疗”受试者的癌症：癌细胞的数目减少或完全不存在；肿瘤大小减小；癌细胞浸润至周围器官中(包括例如癌症扩散至软组织和骨中)的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状的减轻；降低的发病率和死亡率；生活质量改进；肿瘤的肿瘤发生、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力的减少；肿瘤中的癌症干细胞的数目或频率的减少；肿瘤发生细胞分化成非肿瘤发生状态；增加的无进展存活(pfs)、无疾病存活(dfs)或总体存活(os)、完全反应(cr)、部
分反应(pr)、稳定疾病(sd)、进行性疾病(pd)减弱、缩短的进展时间(ttp)或其任何组合。
[0197]
如本文所用，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指可用于使得能够将免疫缀合物递送至所需生物作用位点的方法。可使用本文所述的剂和方法的施用技术可见于例如goodman和gilman,the pharmacological basis of therapeutics,现行版；pergamon；和remington’s,pharmaceutical sciences(现行版),mack publishing co.,easton,pa中。一方面，静脉内施用免疫缀合物。
[0198]
术语“指导(instructing)”意指借助于任何方式(例如书面，诸如呈包装插页或其他书面宣传材料的形式)提供关于适用疗法、药剂、治疗、治疗方案等的说明书。
[0199]
术语“预治疗(pre-treat)”和“预治疗(pre-treatment)”是指在治疗抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物的施用之前存在的治疗措施。例如，如本文更详细描述，可在免疫缀合物的施用之前约一周、约五天、约三天、约两天或约一天或24小时内施用类固醇(例如皮质类固醇)作为预防药。也可与所述免疫缀合物同一天在所述免疫缀合物之前施用所述类固醇。
[0200]
除非本文特定地规定或显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域中的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非本文另有说明，否则本文所提供的所有数值均由术语约修饰。
[0201]
本文中变量的任何定义内的化学基团的列表的陈述包括作为任何单一基团或所列出的基团的组合的那一变量的定义。本文中关于变量或方面的实施方案的陈述包括作为任何单一实施方案或与任何其他实施方案或其部分组合的那一实施方案。
[0202]
除非本文另外清楚指示，否则如本公开和权利要求书中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式。
[0203]
应理解，在本文中用语言“包含(comprising)”描述实施方案的任何情况下，还提供根据“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似实施方案。在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可具有美国专利法中赋予它的含义并且可意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由......组成”或“基本上组成”同样具有美国专利法中所赋予的含义并且所述术语为开放式的，允许超出所陈述者的存在，只要所陈述者的基础或新颖特征未由于超出所陈述者的存在发生改变，但排除现有技术实施方案
[0204]
除非本文特定地规定或显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。如本文中诸如“a和/或b”的措辞中所用的术语“和/或”意图包括“a和b”、“a或b”、“a”和“b”。同样，如诸如“a、b和/或c”的措辞中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
[0205]
本文所提供的任何组合物或方法均可与本文所提供的任何其他组合物和方法中的一者或多者组合。
[0206]
ii.双互补位抗体
[0207]
本文提供双互补位抗frα抗体和其抗原结合片段。这些双互补位抗体和其抗原结合片段可包含结合于frα的第一表位的第一frα结合域和结合于frα的第二表位的第二frα
结合域。frα的第一和第二表位是非重叠表位。这些双互补位抗体和抗原结合片段可含有另外的frα结合域。例如，四价双互补位抗体或抗原结合片段可具有结合于第一表位的两个frα结合域和结合于第二表位的两个frα结合域。示例性双互补位抗体和其抗原结合片段显示于图1中。
[0208]
a.frα结合域
[0209]
本文公开可用于组装双互补位抗体或其抗原结合片段的frα结合域。frα结合域可包含六个互补决定区(cdr)，即可变重链(vh)cdr1、vh cdr2、vh cdr3、可变轻链(vl)cdr1、vl cdr2和vl cdr3。frα结合域可包含可变重链(vh)和可变轻链(vl)。vh和vl可以是独立多肽或可以是同一多肽的部分(例如，在scfv中)。
[0210]
frα抗体和其抗原结合片段是本领域中已知的并且已经公开于例如pct申请公布号wo 2011/106528 a1；wo 2012/135675 a3；wo 2012/138749 a1；wo 2014/036495 a3；和wo 2015/031815 a2中；其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。另外的frα抗体已经公开于美国专利号8,557,966 b2；8,709,432 b2；9,702,881 b2；和9,637,547 b2；以及美国专利申请公布号us-2012-0282282 a1中，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。另外，frα抗体humov19(m9346a)是由质粒编码，所述质粒在2010年4月7日根据布达佩斯条约的条款寄存于位于10801university boulevard,manassas,va 20110处的american type culture collection(atcc)并且具有atcc寄存号pta-10772和pta-10774。如本文所提供，frα结合域可以是这些抗体或其抗原结合片段中的任一者的frα结合域(例如六个cdr或vh和vl)。
[0211]
举例来说，frα结合域可包含humov19抗体和/或fr57抗体的cdr序列、vh序列和/或vl序列。humov19和fr57抗体的cdr序列提供于下表1和表2中。
[0212]
在一些实施方案中，本文所公开的frα结合域包含一种或多种包含一个或多个本文所述的cdr序列的多肽。例如，frα结合域可包含下表1和表2中所示的一个或多个轻链cdr序列(即，lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3)和/或一个或多个重链cdr序列(即，hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3)。
[0213]
表1：轻链cdr序列(根据kabat定义)
[0214][0215]
表2：重链cdr序列
[0216][0217]
在一些实施方案中，frα结合域包含(a)vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:1-3；和(b)vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:7-9。在一些实施方案中，frα结合域包含(a)vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:1-3；和(b)vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:13、14和9。在一些实施方案中，frα结合域包含(a)vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:4-6，和(b)vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:10-12。在一些实施方案中，frα结合域包含(a)vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:4-6，和(b)vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其分别包含氨基酸序列seq id no:15、16和12。
[0218]
举例来说，frα结合域可包含humov19抗体和/或fr57抗体的cdr序列、vh序列和/或vl序列。humov19和fr57的cdr序列提供于下表1和表2中。
[0219]
在一些实施方案中，本文所公开的frα结合域包含一种或多种包含一个或多个本文所述的cdr序列的多肽。例如，frα结合域可包含下表1和表2中所示的一个或多个轻链cdr序列(即，lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3)和/或一个或多个重链cdr序列(即，hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3)。
[0220]
在一些实施方案中，frα结合域包含humov19抗体和/或fr57抗体的轻链和/或重链可变序列。humov19和fr57的轻链可变序列和重链可变序列提供于下表3和表4中。
[0221]
表3.轻链可变序列
[0222][0223]
表4.重链可变序列
[0224][0225][0226]
在一些实施方案中，frα结合域包含与seq id no:17具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的vl，任选地其中所述vl包含分别为seq id no:1-3的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列。在一些实施方案中，frα结合域包含与seq id no:19具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约
96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的vl，任选地其中所述vl包含分别为seq id no:4-6的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列。
[0227]
在一些实施方案中，frα结合域包含与seq id no:22具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的vh，任选地其中所述vh包含分别为seq id no:7-9或分别为seq id no:13、14和9的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。在一些实施方案中，frα结合域包含与seq id no:24具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的vh，任选地其中所述vh包含分别为seq id no:10-12或分别为seq id no:15、16和12的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。
[0228]
在一些实施方案中，frα结合域包含vl和vh，其中(i)所述vl与seq id no:17具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性，任选地其中所述vl包含分别为seq id no:1-3的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列，和(ii)所述vh与seq id no:22具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性，任选地其中所述vh包含分别为seq id no:7-9或分别为seq id no:13、14和9的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。
[0229]
在一些实施方案中，frα结合域包含vl和vh，其中(i)所述vl与seq id no:19具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性，任选地其中所述vl包含分别为seq id no:4-6的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列，和(ii)所述vh与seq id no:24具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性，任选地其中所述vh包含分别为seq id no:10-12或分别为seq id no:15、16和12的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。
[0230]
在一些实施方案中，frα结合域包含vl和vh。vl和vh可以是独立多肽。vl和vh还可以是同一多肽的部分，例如包含vl、接头和vh的多肽。包含vl、接头和vh的多肽可呈取向vl-接头-vh或取向vh-接头-vl。
[0231]
因此，在一些实施方案中，frα结合域(例如scfv)从n端至c端包含：包含氨基酸序列seq id no:17的vl、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和包含氨基酸序列seq id no:22的vh。在一些实施方案中，frα结合域从n端至c端包含：包含氨基酸序列seq id no:22的vh、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和包含氨基酸序列seq id no:17的vl。
[0232]
在一些实施方案中，frα结合域(例如scfv)从n端至c端包含：包含氨基酸序列seq id no:19的vl、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和包含氨基酸序列seq id no:24的vh。在一些实施方案中，frα结合域从n端至c端包含：包含氨基酸序列seq id no:24的vh、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和包含氨基酸序列seq id no:19的vl。
[0233]
可用于连接vh和vl的接头是本领域中已知的。例如，接头可以是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方案中，所述接头可具有任何长度并且可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50或60个或更多氨基酸。在其他实施方案中，可用于本公开的接头具有至少一个氨基酸和少于100个氨
基酸、少于90个氨基酸、少于80个氨基酸、少于70个氨基酸、少于60个氨基酸、少于50个氨基酸、少于40个氨基酸、少于30个氨基酸、少于20个氨基酸、少于19个氨基酸、少于18个氨基酸、少于17个氨基酸、少于16个氨基酸、少于15个氨基酸、少于14个氨基酸、少于13个氨基酸或少于12个氨基酸。在一个实施方案中，接头序列包含甘氨酸氨基酸残基。在其他情况下，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的组合。
[0234]
在一些实施方案中，frα结合域包含在vh与vl之间同框融合的接头。在一些实施方案中，所述甘氨酸/丝氨酸接头包含氨基酸残基的任何组合，包括但不限于肽gggs(seq id no:49)或ggggs(seq id no:50)或其重复序列，包括这些给定肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多重复序列。本文所公开的甘氨酸/丝氨酸接头包含氨基酸序列(gs)n、(ggs)n、(gggs)n、(ggggs)n或(ggggs)n，其中n为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，所述接头序列为ggggsggggsggggs(seq id no:51)(还注明为(gly4ser)3)。在另一实施方案中，所述接头序列为ggggsggggsggggsggggs(seq id no:52)(还注明为(gly4ser)4)。
[0235]
在一些实施方案中，frα结合域为scfv。示例性scfv frα结合域提供于下表5中。
[0236]
表5.scfv融合蛋白
[0237]
[0238][0239]
在一些实施方案中，frα结合域包含包括与seq id no:27、28或29具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列的scfv，任选地其中所述scfv包含分别为seq id no:1-3的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列和分别为seq id no:7-9或分别为seq id no:13、14和9的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。
[0240]
在一些实施方案中，frα结合域包含包括与seq id no:30、31或32具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列的scfv，任选地其中所述scfv包含分别为seq id no:4-6的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3序列和分别为seq id no:10-12或分别为seq id no:15、16和12的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3序列。
[0241]
在某些实施方案中，frα结合域与包含氨基酸序列seq id no:17和seq id no:22的抗体结合于frα的同一表位。
[0242]
在某些实施方案中，frα结合域与包含氨基酸序列seq id no:19和seq id no:24的抗体结合于frα的同一表位。
[0243]
在某些实施方案中，frα结合域为鼠科动物、嵌合或人化frα结合域。如本文所用，人化frα结合域可以是表面重塑的frα结合域。
[0244]
在某些实施方案中，frα结合域结合于人frα，而非folr2或folr3。
[0245]
b.双互补位抗体形式
[0246]
所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段可包含上文所论述的frα结合域的组合，其中所述frα结合域结合于frα的非重叠表位。
[0247]
多种不同类型的双特异性构建体是本领域中已知的并且可用于本文所提供的双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段。
[0248]
对于双特异性抗体构建的早期尝试使用化学交联或杂交的杂交瘤或四源杂交瘤将两种不同抗体的两半接合在一起。尽管这些技术致力于制备双特异性抗体，其还会导致产生问题，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、难以蛋白质表达、需要纯化所关注的双特异性抗体、低产率、产生费用等。
[0249]
最近方法已经使用遗传工程改造的构建体，所述构建体能够产生单一双特异性抗
体的均质产物，而无需广泛纯化来去除不需要的副产物。所述构建体已经包括串联scfv、双功能抗体、串联双功能抗体、双重可变域抗体和使用诸如ch1/ck域或的基序的杂二聚化(chames和baty,2009,curr opin drug discov devel 12:276-83；chames和baty,mabs 1:539-47)。是指通过短肽接头接合的串联scfv(chames和baty,mabs 1:539-47)。双特异性抗体产生的其他方法已经包括四价igg-scfv融合物(dong等人,2011,mabs 3:273-88)；双重作用fab(daf)抗体(bostrom等人,2009,science 323:1610-14)；igg样双重可变域抗体(dvd-ig)(wu等人,2007,nat biotechnol 25:1290-97)；和在igg4分子之间使用动态交换(van der neut kolfschoten等人,2007,science 317:1554-57)。
[0250]
dock-and
‑‑
复合物(参见例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,901,680；7,906,118；7,981,398；8,003,111)表示另一双特异性抗体形式。尽管标准复合物包含具有连接至一个ad连接分子的两个ddd连接分子的三聚体，但复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。
[0251]
在一些实施方案中，本文公开具有不对称-fc分子的双互补位构建体，包括呈“杵臼”结构。参见kontermann,mabs.,4(2):182-97(2012)。杵臼(kih)技术涉及工程改造ch3域以在各重链中产生“杵”或“臼”，从而促进杂二聚化。kih技术描述于例如ridgway等人,protein engineering 9(7):617-721(1996)；us 5,731,168；us 5,807,706；us 5,821,333中，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。“crossmab”技术进一步涉及在双特异性抗体的一半的fab内交换重链和轻链域，使得两个臂如此不同以致于无法发生轻-重链错配(schaefer等人,2011,proc natl.acad sci usa 108:11187-92)。所述杵臼方法将具有庞大侧链的氨基酸引入至一条重链的ch3域中，所述氨基酸符合另一重链的ch3域中的适当设计的空腔。方法的组合防止重链与重链和重链与轻链相互作用的错配，从而主要产生单一产物。
[0252]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段为二价(参见例如图1中所示的“杵臼”实施例)。二价双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段可包含例如两个包含scfv的frα结合域，两个包含独立多肽链上的vh和vl的frα结合域，或一个包含scfv的frα结合域和一个包含独立多肽链上的vh和vl的frα结合域。
[0253]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段为三价。
[0254]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段为四价(参见例如图1中所示的“morrison”实施例)。四价抗体描述于例如m.j.coloma,s.l.morrison,nat.biotechnol.,15(2):159-63(1997)中，其以引用的方式整体并入本文中。
[0255]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含作为scfv的frα结合域。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含包括独立多肽上的vh和vl的frα结合域。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含作为scfv的frα结合域和包含独立多肽上的vh和vl的frα结合域。
[0256]
在一些实施方案中，二价双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含作为scfv的单一frα结合域和包含独立多肽上的vh和vl的单一frα结合域。在所述实施方案中，所述scfv可融合至重链恒定区并且所述vh可融合至重链恒定区。在一些实施方案中，所述恒定
区具有“杵和臼”序列。“杵”序列可在融合至scfv的重链恒定区中，并且“臼”序列可与融合至vh的恒定区融合。或者，“臼”突变可在融合至scfv的重链恒定区中，并且“杵”序列可与融合至vh的恒定区融合。所述形式的示例性双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段的序列可见于表7中。
[0257]
在一些实施方案中，四价双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含两个作为scfv的frα结合域和两个包含独立多肽上的vh和vl的frα结合域。在所述实施方案中，所述scfv可融合至包含所述vh的多肽的n端或c端。所述scfv还可融合至包含所述vl的多肽的n端或c端。
[0258]
四价双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段可包含两种多肽，其中第一多肽包含重链恒定区、vh和scfv并且第二多肽包含轻链恒定区和vl。四价双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段还可包含两种多肽，其中第一多肽包含重链恒定区和vh并且第二多肽包含轻链恒定区、vl和scfv。所述形式的示例性双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段的序列可见于表6中。
[0259]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段为双特异性杂二聚双功能抗体，例如四聚双特异性杂二聚双功能抗体。如本文所用，术语“双特异性杂二聚双功能抗体”是指两种或更多种多肽链或蛋白质的复合物，并且各自可包含至少一个抗体vl和一个抗体vh域，并且其中各多肽链中的vl和vh域是来自不同抗体。
[0260]
在一些实施方案中，本文所公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含一个或多个表面重塑的frα结合域。在一些实施方案中，双互补位抗体或其抗原结合片段中的所有frα结合域均是表面重塑的。
[0261]
在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段是其中来自互补决定区(cdr)的残基由来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的cdr的残基置换的具有所需特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(“cdr移植”)(jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science 239:1534-1536(1988))。
[0262]
在另一实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段是包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的cdr移植或表面重塑抗体，其中所述重链可变区包含三个分别具有由seq id no:7-9表示的氨基酸序列的互补决定区，并且其中所述轻链可变区包含三个分别具有由seq id no:1-3表示的氨基酸序列的互补决定区。
[0263]
在另一实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段是包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的cdr移植或表面重塑抗体，其中所述重链可变区包含三个分别具有由seq id no:13、14和9表示的氨基酸序列的互补决定区，并且其中所述轻链可变区包含三个分别具有由seq id no:1-3表示的氨基酸序列的互补决定区。
[0264]
在另一实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段是包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的cdr移植或表面重塑抗体，其中所述重链可变区包含三个分别具有由seq id no:10-12表示的氨基酸序列的互补决定区，并且其中所述轻链可变区包含三个分别具有由seq id no:4-6表示的氨基酸序列的互补决定区。
[0265]
在另一实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段是包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的cdr移植或表面重塑抗体，其中所述重链可变区包含三个分
别具有由seq id no:15、16和12表示的氨基酸序列的互补决定区，并且其中所述轻链可变区包含三个分别具有由seq id no:4-6表示的氨基酸序列的互补决定区。
[0266]
在另一实施方案中，提供具有人化(例如，表面重塑、cdr移植)重链可变区的抗体或抗原结合片段，所述重链可变区与对应于seq id no:22-26的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选地与seq id no:22-26共享95％序列同一性，最优选地与seq id no:22-26共享100％序列同一性。在特定实施方案中，所述抗体包括在cdr外部的框架区中的保守突变。
[0267]
同样，提供具有人化(例如，表面重塑、cdr移植)轻链可变区的抗体，所述轻链可变区与对应于seq id no:17-21的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选地与seq id no:17-21共享95％序列同一性，最优选地与seq id no:17-21共享100％序列同一性。在特定实施方案中，所述抗体包括在cdr外部的框架区中的保守突变。
[0268]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，诸如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区为igg1重链恒定区或igg4重链恒定区。此外，在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段可包含轻链恒定区(κ轻链恒定区或λ轻链恒定区)。在一些实施方案中，所述轻链恒定区为κ轻链恒定区。
[0269]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含第一frα结合域，其包含分别选自由seq id no:19和24；20和25；和21和26组成的组的vl和vh序列；和第二frα结合域，其不与humov19竞争结合于frα。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含第一frα结合域，其包含分别为seq id no:20和57的vl和vh序列；和第二frα结合域，其不与humov19竞争结合于frα。
[0270]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含第一frα结合域，其包含分别选自由seq id no:17和22；和18和23组成的组的vl和vh序列；和第二frα结合域，其不与fr57竞争结合于frα。
[0271]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含frα结合域，所述frα结合域竞争性地抑制结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22和vl氨基酸序列seq id no:17的抗体相同的frα表位
[0272]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含frα结合域，所述frα结合域竞争性地抑制结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:24和vl氨基酸序列seq id no:19的抗体相同的frα表位。
[0273]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)第一frα结合域，其竞争性地抑制结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22和vl氨基酸序列seq id no:17的抗体相同的frα表位和(ii)第二frα结合域，其竞争性地抑制结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:24和vl氨基酸序列seq id no:19的抗体相同的frα表位。
[0274]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含frα结合域，所述frα结合域结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22和vl氨基酸序列seq id no:17的抗体相同的frα表位。
[0275]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含frα结合域，所述frα结合域结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:24和vl氨基酸序列seq id no:19的抗体
相同的frα表位。
[0276]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)第一frα结合域，其结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:22和vl氨基酸序列seq id no:17的抗体相同的frα表位和(ii)第二frα结合域，其结合于与包含vh氨基酸序列seq id no:24和vl氨基酸序列seq id no:19的抗体相同的frα表位。
[0277]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或24)。
[0278]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或57)。
[0279]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或26)。
[0280]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或24)。
[0281]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或57)。
[0282]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或26)。
[0283]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或24)。
[0284]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0285]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或26)。
[0286]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻
链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或24)。
[0287]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或57)。
[0288]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或26)。
[0289]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或24)。
[0290]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或57)。
[0291]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或26)。
[0292]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或24)。
[0293]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0294]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或26)。
[0295]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或24)。
[0296]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:17和/或23)和
humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0297]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或26)。
[0298]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或24)。
[0299]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或57)。
[0300]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或26)。
[0301]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或24)。
[0302]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0303]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或26)。
[0304]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或24)。
[0305]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或22)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0306]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:19和/或26)。
[0307]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重
链(例如，分别为seq id no:20和/或24)。
[0308]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或57)。
[0309]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:20和/或26)。
[0310]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或24)。
[0311]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或25)。在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或57)。
[0312]
在一些实施方案中，本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段包含fr57的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:18和/或23)和humov19的可变轻链和/或可变重链(例如，分别为seq id no:21和/或26)。
[0313]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)与fr57结合于同一表位的scfv和(ii)与humov19结合于同一表位的scfv。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27和seq id no:30。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27和seq id no:31。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27和seq id no:32。
[0314]
在一些实施方案中，抗frα双互补位抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28和seq id no:30。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28和seq id no:31。在一些实施方案中，抗frα双互补位抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28和seq id no:32。
[0315]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29和seq id no:30。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29和seq id no:31。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29和seq id no:32。
[0316]
应理解，seq id no:27-32的vh和vl序列可能以不同顺序排列。例如，如seq id no:27中所陈述的n端至c端取向为vh-(g4s)
4-vl。然而，本文公开呈如下取向的scfv多肽序列，其中vh和vl序列围绕甘氨酸-丝氨酸接头进行交换(例如vl-(g4s)
4-vh)。
[0317]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:19和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:19和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗
体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:19和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:19和seq id no:26。
[0318]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:20和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:20和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:20和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:20和seq id no:26。
[0319]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)与fr57结合于同一表位的scfv和(ii)与humov19结合于同一表位的frα结合域，其包含在独立多肽上的vh和vl。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:21和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:21和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:21和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27、seq id no:21和seq id no:26。
[0320]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:19和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:19和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:19和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:19和seq id no:26。
[0321]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:20和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:20和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:20和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:20和seq id no:26。
[0322]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:21和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:21和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:21和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:28、seq id no:21和seq id no:26。
[0323]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:19和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:19和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:19和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:19和seq id no:
26。
[0324]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:20和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:20和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:20和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:20和seq id no:26。
[0325]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:21和seq id no:24。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:21和seq id no:25。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:21和seq id no:57。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:29、seq id no:21和seq id no:26。
[0326]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)与humov19结合于同一表位的scfv和(ii)与fr57结合于同一表位的frα结合域，其包含在独立多肽上的vh和vl。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:30、seq id no:17和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:30、seq id no:17和seq id no:23。
[0327]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:30、seq id no:18和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:30、seq id no:18和seq id no:23。
[0328]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)与humov19结合于同一表位的scfv和(ii)与fr57结合于同一表位的frα结合域，其包含在独立多肽上的vh和vl。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:31、seq id no:18和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:31、seq id no:18和seq id no:23。
[0329]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:31、seq id no:17和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:31、seq id no:17和seq id no:23。
[0330]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32、seq id no:17和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32、seq id no:17和seq id no:23。
[0331]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32、seq id no:18和seq id no:22。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32、seq id no:18和seq id no:23。
[0332]
在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含公开于下表6中的多肽序列。
[0333]
表6 morrison形式(c端scfv)融合蛋白
[0334]
[0335]
[0336]
[0337][0338]
在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含多肽序列seq id no:33和seq id no:34。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:35和seq id no:36的多肽序列。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:37和seq id no:38的多肽序列。在一些实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:39和seq id no:40的多肽序列。
[0339]
在一些实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含公开于下表7中的多肽序列。
[0340]
表7.不对称-fc分子(杵臼)
[0341]
[0342]
[0343][0344]
在一个实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含多肽seq id no:41-43。在一个实施方案中，双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含多肽seq id no:44-46。
[0345]
本公开的双互补位抗体或其抗原结合片段还可包含接头。在一些实施方案中，所述接头可从n端至c端将第一抗体或其抗原结合片段连接至第二抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述接头可从n端至c端将第二多肽连接至第一多肽。
[0346]
在一个实施方案中，所述双互补位抗体或其抗原结合片段包含位于第一肽、抗体或其抗原结合片段与第二肽、抗体或其抗原结合片段之间的接头序列。所述接头可具有任何长度并且可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50或60个或更多氨基酸。在其他实施方案中，可用于本公开的接头具有至少一个氨基酸和少于100个氨基酸、少于90个氨基酸、少于80个氨基酸、少于70个氨基酸、少于60个氨基酸、少于50个氨基酸、少于40个氨基酸、少于30个氨基酸、少于20个氨基酸、少于19个氨基酸、少于18个氨基酸、少于17个氨基酸、少于16个氨基酸、少于15个氨基酸、少于14个氨基酸、少于13个氨基酸或少于12个氨基酸。在一个实施方案中，接头序列包含甘氨酸氨基酸残基。在其他情况下，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的组合。
[0347]
在一些实施方案中，所述甘氨酸/丝氨酸接头可包含氨基酸残基的任何组合，包括但不限于肽gggs(seq id no:49)或ggggs(seq id no:50)或其重复序列，包括这些给定肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多重复序列。本文所公开的甘氨酸/丝氨酸接头包含氨基酸序列(gs)n、(ggs)n、(gggs)n、(ggggs)n或(ggggs)n，其中n为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，所述接头序列为ggggsggggsggggs(seq id no:51)(还注明为(gly4ser)3)。在另一实施方案中，所述接头序列为ggggsggggsggggsggggs(seq id no:52)(还注明为(gly4ser)4)。
[0348]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体包含改变的(例如突变或工程改造的)fc区。例如，在一些方面，所述fc区已经发生改变以减少或增强所述抗体的效应子功能、改变所述抗体的血清半衰期或其他功能特性。效应子功能的减少或消除在某些情况下是所需的，例如在如下抗体的情况下，其作用机制涉及阻断或拮抗，而非携带靶抗原的细胞的杀死。当有关其中fcγr以低水平表达的非所需细胞(诸如肿瘤和外源细胞)时，增加的效应子功能一般是所需的，例如具有低水平的fcγriib的肿瘤特异性b细胞(例如非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma)、cll和伯奇氏淋巴瘤(burkitt’s lymphoma))。本发明的具有所述赋予或改变的效应子功能活性的免疫缀合物可用于治疗和/或预防其中需要效应子功能活性的增强功效的疾病、病症或感染。在一些方面，fc区是选自igm、iga、igg、ige或其他同型的同型。
[0349]
尽管双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的fc区可具有结合于一种或多种fc受体(例如一种或多种fcγr)的能力，但在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含与fcγria(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)或fcγriiib(cd16b)的结合改变(相对于由野生型fc区展现的结合)的变异型fc区，例如与活化受体的结合将增
强和/或与抑制受体的结合将大体上减少或不能与抑制受体结合。因此，双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的fc区可包括完全fc区的一些或全部ch2域和/或一些或全部ch3域，或可包含变异型ch2和/或变异型ch3序列(相对于完全fc区的ch2或ch3域，其可包括例如一种或多种插入和/或一种或多种缺失)。所述fc区可包含非fc多肽部分，或可包含非天然完全fc区的部分，或可包含非天然存在取向的ch2和/或ch3域(诸如两个ch2域或两个ch3域或依n端至c端方向，ch3域连接至ch2域等)。
[0350]
本领域中已知经鉴定为改变效应子功能的fc区修饰，包括增加与活化受体(例如fcγriia(cd16a))的结合和减少与抑制受体(例如fcγriib(cd32b))的结合的修饰(参见例如stavenhagen等人,cancer res.57(18):8882-8890(2007))。表8列出增加与活化受体的结合和/或减少与抑制受体的结合的示例性修饰的示例性单一、双重、三重、四重和五重取代(编号是如kabat中的eu指数编号，并且取代是相对于氨基酸序列seq id no:59)。
[0351]
表8.优选的活化fc区的变异
[0352][0353]
[0354]
具有减少的与cd32b的结合和/或增加的与cd16a的结合的人igg1 fc区的示例性变体含有f243l、r292p、y300l、v305i或p396l取代，其中编号是如kabat中的eu指数编号。这些氨基酸取代可以任何组合存在于人igg1 fc区中。在一个实施方案中，变异型人igg1fc区含有f243l、r292p和y300l取代。在另一实施方案中，变异型人igg1 fc区含有f243l、r292p、y300l、v305i和p396l取代。
[0355]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含含有降低效应子功能的修饰的免疫球蛋白重链恒定区(参见例如idusogie等人,j.immunol.166:2571-2575(2001)；sazinsky等人,pnas usa 105:20167-20172(2008)；davis等人,j.rheumatol.34:2204-2210(2007)；bolt等人,eur.j.immunol.23:403-411(1993)；alegre等人,transplantation 57:1537-1543(1994)；xu等人,cell immunol.200:16-26(2000)；cole等人,transplantation 68:563-571(1999)；hutchins等人,pnas usa 92:11980-11984(1995)；reddy等人,j.immunol.164:1925-1933(2000)；wo97/11971和wo07/106585；美国申请公布2007/0148167a1；mcearchern等人,blood 109:1185-1192(2007)；strohl,curr.op.biotechnol.20:685-691(2009)；和kumagai等人,j.clin.pharmacol.47:1489-1497(2007)，其中每一者的内容均以引用的方式整体并入本文中)。
[0356]
在一些实施方案中，相对于由野生型igg fc区(seq id no:59)展现的结合，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的fc区优选展现降低的(或大体上不展现)与选自由以下组成的组的效应子受体的结合：fcγria(cd64)、fcγriia(cd32a)(同种异型r131和h131)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)(同种异型v158和f158)和fcγriiib(cd16b)(同种异型fcγiiib-na1和fcγiiib-na2)。在一些实施方案中，与包含相应免疫球蛋白的野生型fc区的相应抗体或抗原结合片段的结合亲和力相比，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的fc区变异型效应子受体结合亲和力已经减少至1/10或更低、1/50或更低或1/100或更低。
[0357]
在一个特定实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含展现减少的效应子功能(例如减少的adcc)的igg fc区并且包含在选自由233、234、235、236、237、238、239、265、266、267、269、270、271、295、296、297、298、300、324、325、327、328、329、331和332组成的组的一个或多个氨基酸位置处的修饰，其中氨基酸位置编号是根据如kabat中所陈述的eu指数。在一个实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的ch2-ch3域包括以下取代中的任何1、2、3或4者：l234a、l235a、d265a、n297q、n297a和n297g，其中编号是如kabat中的eu指数编号。在另一实施方案中，ch2-ch3域含有n297q取代、n297a取代或l234a和l235a取代，因为这些突变消除fcr结合。或者，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含天然存在的fc区的ch2-ch3域，所述天然存在的fc区固有地展现降低的(或大体上不展现)与fcγriiia(cd16a)的结合和/或降低的效应子功能(相对于由野生型igg1 fc区(seq id no:59)展现的结合和效应子功能)。在一个特定实施方案中，所述双互补位抗frα抗体的fc恒定区包含igg2 fc区(seq id no:60)或igg4 fc区(seq id no:61)。由于n297a、n297g、n297q、l234a、l235a和d265a取代消除效应子功能，所以在其中需要效应子功能的情况下，将优选地不使用这些取代。
[0358]
含具有减少或消除的效应子功能的fc区的双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的ch2和ch3域的优选igg1序列包含取代l234a/l235a(加下划线显示)(seq id no:62)：
[0359][0360]
含具有减少或消除的效应子功能的fc区的双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的ch2和ch3域的优选igg1序列包含取代n297a(加下划线显示)(seq id no:63)：
[0361][0362]
含具有减少或消除的效应子功能的fc区的双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的ch2和ch3域的优选igg1序列包含取代n297q(加下划线显示)(seq id no:64)：
[0363][0364]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含选自seq id no:62、seq id no:63或seq id no:64的fc(免疫球蛋白)序列。在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含具有减少或消除的效应子功能的fc(免疫球蛋白)序列(例如，包含上文在seq id no:62、seq id no:63和/或seq id no:64中示出的取代)并且包含如本文所公开的一种或多种杵臼突变。在一些实施方案中，所述fc序列包含如本文所公开的杵突变。在一些实施方案中，所述fc序列包含如本文所公开的臼突变。
[0365]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含对应于以下的一种或多种修饰：igg1-c220s、c226s、c229s、p238s；igg1-c226s、c229s；igg1-c226s、c229s、e233p、l234v、l235a；igg1-l234a、l235a；igg1-l234f、l235e、p331s；igg1-l234f、l235e、p331s；igg1-h268q、a330s、p331s；igg1-g236r、l328r；igg1-l235g、g236r、igg1-n297a；igg1-n325a、l328r；igg1-n325l、l328r；igg1-k326w、e333s；igg2-v234a、g237a；igg2-e333s；igg2 h268q、v309l、a330s、a331s；igg4-s228p、l236e；igg4-f234a、l235a；igg4-f234a、g237a、e318a；igg4-l235a、g237a、e318a；igg4-l236e；igg2-eu序列118-260；和igg4-eu序列261-447；其中位置编号是根据如kabat中的eu指数。
[0366]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含具有减少的cdc活性的重链免疫球蛋白恒定域。在特定方面，双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含含有降低cdc活性的突变的igg1重链恒定区(参见例如wo 1997/11971和wo 2007/106585；美国申请公布2007/0148167a1；mcearchern等人,blood 109:1185-1192(2007)；hayden-ledbetter等人,clin.cancer 15:2739-2746(2009)；lazar等人,pnas usa 103:4005-4010(2006)；bruckheimer等人,neoplasia 11:509-517(2009)；strohl,curr.op.biotechnol.20:685-691(2009)；和sazinsky等人,pnas usa 105:20167-20172
(2008)；其中每一者均以引用的方式整体并入本文中)。降低cdc的重链恒定域序列修饰的实例包括对应于以下的一种或多种修饰：igg1-c226s、c229s、e233p、l234v、l235a；igg1-c226s、p230s；igg1-l234f、l235e、p331s；igg1-s239d、a330l、i332e；igg2 eu序列118-260；igg4-eu序列261-447；和igg2-h268q、v309l、a330s、a331s(根据eu指数)
[0367]
在一些实施方案中，所提供的双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含含有一种或多种延长半衰期的氨基酸修饰(例如取代)的重链免疫球蛋白恒定域。能够延长含fc区分子的半衰期的多种突变是本领域中已知的并且作为本文所提供的双互补位抗frα抗体或抗原结合片段的组分涵盖在内。参见例如美国专利号6,277,375；7,083,784；7,217,797和8,088,376；美国公布号2002/0147311；和2007/0148164；和pct公布号wo 1998/23289；wo 2009/058492；和wo 2010/033279，其中每一者的内容均以引用的方式整体并入本文中。
[0368]
可通过增加fc区对fcrn的结合亲和力来延长包含fc区的蛋白质的血清半衰期。如本文所用，术语“半衰期”意指分子的药物动力学特性，它是所述分子在其施用之后的平均存在时间的量度。半衰期可表述为从受试者(例如人患者或其他哺乳动物)的身体或其特定隔室消除百分之五十(50％)的已知量的分子所需的时间，例如，如在血清中(即，循环半衰期)或在其他组织中所测量。一般说来，半衰期增加导致所施用的分子在循环中的平均停留时间(mrt)增加。
[0369]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含在选自由以下组成的组的一个或多个位置处的延长半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436，其中氨基酸位置编号是根据eu指数。在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一种或多种氨基酸取代，其中氨基酸位置编号是根据eu指数。在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段含有以下一者或多者：用tyr、phe、trp或thr取代在kabat位置252处的氨基酸；用thr取代在kabat位置254处的氨基酸；用ser、arg、gln、glu、asp或thr取代在kabat位置256处的氨基酸；用leu取代在kabat位置257处的氨基酸；用pro取代在kabat位置309处的氨基酸；用ser取代在kabat位置311处的氨基酸；用thr、leu、phe或ser取代在kabat位置428处的氨基酸；用arg、ser、iso、pro或gln取代在kabat位置433处的氨基酸；或用trp、met、ser、his、phe或tyr取代在kabat位置434处的氨基酸。更具体说来，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段域可相对于野生型人igg恒定域含有氨基酸取代，包括用tyr取代在kabat位置252处的氨基酸、用thr取代在kabat位置254处的氨基酸和用glu取代在kabat位置256处的氨基酸。
[0370]
在一些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含选自以下的至少一种取代：t250q、m252y、s254t、t256e、k288d、t307q、v308p、a378v、m428l、n434a、n434s、n434h、n434y、h435k和y436i，其中编号是如kabat中的eu指数编号。在另一实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段包含选自以下的取代：(a)m252y、s254t和t256e；(b)m252y和s254t；(c)m252y和t256e；(d)t250q和m428l；(e)t307q和n434a；(f)a378v和n434a；(g)n434a和y436i；(h)v308p和n434a；和(i)k288d和h435k。
[0371]
在一个优选实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或抗原结合片段含有包含以下取代中的任何1、2或3者的变异型igg fc区：m252y、s254t和t256e。本公开还提供具有变异
j等人,(2001)molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny；ausubel fm等人,current protocols in molecular biology,john wiley&sons(1987年和每年更新)；current protocols in immunology,john wiley&sons(1987年和每年更新)gait(编)(1984)oligonucleotide synthesis:a practical approach,irl press；eckstein(编)(1991)oligonucleotides and analogues:a practical approach,irl press；birren b等人(编)(1999)genome analysis:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press。
[0377]
可通过化学连接两种不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系以产生杂交-杂交瘤来制备如本文所提供的双互补位抗体或其抗原结合片段。
[0378]
在一个特定实施方案中，通过涉及产生的任何方式，例如经由dna序列的合成、遗传工程改造来制备、表达、产生或分离所描述的双互补位抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，此类双互补位抗体或其抗原结合片段包含未天然存在于动物或哺乳动物(例如人)体内的抗体生殖系谱系内的序列(例如dna序列或氨基酸序列)。
[0379]
制备双特异性、二价抗体或其抗原结合片段的方法描述于例如美国专利号5,731,168、5,807,706、5,821,333和美国申请公布号2003/020734和2002/0155537中；其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。双特异性四价抗体和其制备方法描述于例如国际申请公布号wo02/096948和wo00/44788中，所述两者的公开内容均以引用的方式整体并入本文中。一般参见国际申请公布号wo93/17715、wo92/08802、wo91/00360和wo92/05793；tutt等人,j.immunol.147:60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；和5,601,819；以及kostelny等人,j.immunol.148:1547-1553(1992)；其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0380]
一种用于产生双特异性抗体的方法已经称作“杵臼”策略(参见例如国际公布wo2006/028936)。这项技术中通过使形成igg中的ch3域的界面的所选氨基酸突变来减少ig重链的错配。在ch3域内两条重链直接地相互作用所处的位置处，将具有小侧链的氨基酸(臼)引入至一条重链的序列中并且将具有大侧链的氨基酸(杵)引入至另一重链上的配对物相互作用残基位置中。在一些实施方案中，本发明组合物具有免疫球蛋白链，其中已经通过使在两种多肽之间的界面处相互作用的所选氨基酸突变来修饰ch3域，以便优先地形成双特异性抗体。所述双特异性抗体可由同一亚类(例如igg1或igg3)或不同亚类(例如igg1和igg3，或igg3和igg4)的免疫球蛋白链构成。
[0381]
在一个实施方案中，双互补位抗体或其抗原结合片段包含在“杵链”中的t366w突变和在“臼链”中的t366s、l368a、y407v突变，和任选地在ch3域之间的另外的链内二硫桥，其通过例如将y349c突变引入至“杵链”中并且将e356c突变或s354c突变引入至“臼链”中而产生；在“杵链”中的r409d、k370e突变和在“臼链”中的d399k、e357k突变；在“杵链”中的t366w突变和在“臼链”中的t366s、l368a、y407v突变；在“杵链”中的r409d、k370e突变和在“臼链”中的d399k、e357k突变；在一条链中的y349c、t366w突变和在配对链中的e356c、t366s、l368a、y407v突变；和在一条链中的y349c、t366w突变和在配对链中的s354c、t366s、l368a、y407v突变(根据eu编号系统编号)。
[0382]
如本文所述的双特异性抗体也可根据duobody技术平台(genmab a/s)而产生，如例如国际公布号wo 2011/131746、wo 2011/147986、wo 2008/119353和wo 2013/060867中
以及labrijn af等人,(2013)pnas 110(13):5145-5150中所述。所述duobody技术可用于组合含有两条重链和两条轻链的第一frα结合域的一半与含有两条重链和两条轻链的第二frα结合域的一半。所得的异源二聚体含有来自第一frα结合域的一条重链和一条轻链，和与其配对的来自第二frα结合域的一条重链和一条轻链。
[0383]
在一些情况下，双互补位抗体或其抗原结合片段含有igg4和igg1、igg4和igg2、igg4和igg2、igg4和igg3或igg1和igg3链异源二聚体。可常规地通过例如修饰形成人igg4和igg1或igg3中的ch3域的界面的所选氨基酸来工程改造所述杂二聚重链抗体以便有利于异源二聚体重链形成。
[0384]
在特定实施方案中，双互补位抗体或其抗原结合片段可包含嵌合frα结合域或人化frα结合域。在某些实施方案中，双互补位抗体或其抗原结合片段可以是f(ab’)2片段。f(ab’)2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的四聚体抗体分子的两个抗原结合臂。
[0385]
可通过本领域技术人员已知的任何技术来产生本文所述的双互补位抗体或其抗原结合片段。例如，可使用诸如胃蛋白酶的酶通过免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解来产生本文所述的f(ab’)2片段。
[0386]
在某一方面，本文提供一种制备双互补位抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养本文所述的一种或多种细胞。在某一方面，本文提供一种制备双互补位抗体或其抗原结合片段的方法，其包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)来表达(例如重组表达)所述抗体或抗原结合片段。在一个特定实施方案中，所述细胞是分离的细胞。在一个特定实施方案中，已经将外源多核苷酸引入至所述细胞中。在一个特定实施方案中，所述方法还包括纯化获自所述细胞或宿主细胞的抗体或抗原结合片段的步骤。
[0387]
可使用本领域中已知的多种技术，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合，例如由单克隆抗体制备frα结合域。例如，可使用杂交瘤技术，包括本领域中已知并且教导于例如harlow e和lane d,antibodies:a laboratory manual,(cold spring harbor laboratory press,第2版1988)；hammerling gj等人,monoclonal antibodies and t-cell hybridomas 563 681(elsevier,n.y.,1981)中的那些来产生单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。例如，可由外源表达本文所述的抗体的宿主细胞重组产生单克隆抗体。本文所述的单克隆抗体可例如通过如kohler g和milstein c(1975)nature 256:495中所述的杂交瘤方法制得，或可例如使用例如如本文所述的技术从噬菌体库分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域中众所周知的(参见例如下文第11章：short protocols in molecular biology,(2002)第5版,ausubel fm等人,上述)。
[0388]
此外，也可使用本领域中已知的多种噬菌体展示方法来产生本文所述的frα结合域。在噬菌体展示方法中，蛋白质在携带编码所述蛋白质的多核苷酸序列的噬菌体粒子的表面上展示。具体说来，从动物cdna库(例如受影响组织的人或鼠科动物cdna库)扩增编码vh和vl域的dna序列。通过pcr使编码vh和vl域的dna与scfv接头重组在一起并且将其克隆至噬菌粒载体中。在大肠杆菌中对所述载体进行电穿孔并且使大肠杆菌感染辅助噬菌体。用于这些方法中的噬菌体典型地为丝状噬菌体，包括fd和m13，并且所述vh和vl域通常重组融合至噬菌体基因iii或基因viii。表达结合于特定抗原的抗体或片段的噬菌体可用抗原，
例如使用标记的抗原或结合于或捕捉至固体表面或珠粒的抗原进行选择或鉴定。可用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括公开于brinkman u等人,(1995)j immunol methods 182:41-50；ames rs等人,(1995)j immunol methods 184:177-186；kettleborough ca等人,(1994)eur j immunol24:952-958；persic l等人,(1997)gene 187:9-18；burton dr和barbas cf(1994)advan immunol 57:191-280；pct申请号pct/gb91/001134；国际公布号wo 90/02809、wo 91/10737、wo 92/01047、wo 92/18619、wo 93/1 1236、wo 95/15982、wo 95/20401和wo 97/13844；和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108中的那些。
[0389]
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并且用于产生frα结合域，包括人frα结合域，并且表达于包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌在内的任何所需宿主中，例如如下文所述。重组产生诸如fab、fab’和f(ab’)2片段的frα结合域的技术也可使用本领域中已知的方法，诸如公开于pct公布号wo 92/22324；mullinax rl等人,(1992)biotechniques 12(6):864-9；sawai h等人,(1995)am j reprod immunol 34:26-34；和better m等人,(1988)science 240:1041-1043中的那些来使用。
[0390]
一方面，为了产生frα结合域或抗体，可使用包括vh或vl核苷酸序列、限制位点和保护所述限制位点的侧接序列的pcr引物以由模板(例如scfv克隆)扩增vh或vl序列。使用本领域技术人员已知的克隆技术，可将pcr扩增的vh域克隆至表达vh恒定区的载体中，并且可将pcr扩增的vl域克隆至表达vl恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。也可将所述vh和vl域克隆至表达必需的恒定区的一种载体中。接着使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染至细胞系中以产生表达抗体(例如igg)的稳定或短暂细胞系。
[0391]
iv.编码双互补位抗体的多核苷酸
[0392]
在某些实施方案中，本公开涵盖包含编码双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段或此类抗体或片段的域(例如vh、vl、具有vl的vh(例如在scfv中)、重链、轻链、具有scfv的重链、具有scfv的轻链、恒定区或具有scfv的恒定区)的核酸的多核苷酸。
[0393]
因此，本文提供编码seq id no:17-40的多核苷酸。本文还提供包含编码任何双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的组合的组合物(例如包含编码seq id no:17的多核苷酸和编码seq id no:22的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:18的多核苷酸和编码seq id no:23的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:19的多核苷酸和编码seq id no:24的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:20的多核苷酸和编码seq id no:25的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:21的多核苷酸和编码seq id no:26的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:33的多核苷酸和编码seq id no:34的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:35的多核苷酸和编码seq id no:36的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:37的多核苷酸和编码seq id no:38的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:39的多核苷酸和编码seq id no:40的多核苷酸的组合物、包含编码seq id no:41的多核苷酸、编码seq id no:42的多核苷酸和编码seq id no:43的多核苷酸的组合物或包含编码seq id no:44的多核苷酸、编码seq id no:45的多核苷酸和编码seq id no:46的多核苷
酸的组合物。)本文还提供包含编码任何双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的组合的组合物(例如包含编码seq id no:20的多核苷酸和编码seq id no:57的多核苷酸的组合物。)
[0394]
在某些实施方案中，所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段是由质粒编码，所述质粒根据布达佩斯条约的条款寄存于位于10801university boulevard,manassas,va 20110处的american type culture collection(atcc)并且具有atcc寄存号pta-10774(2010年4月7日寄存)、pta-125915(“mov19-fc-臼”；2019年4月29日寄存至atcc并且2019年4月30日由atcc接受)和pta-125916(“fr57scfv2-fc-杵”；2019年4月29日寄存至atcc并且2019年4月30日由atcc接受)。
[0395]
本发明的多核苷酸可以呈rna形式或呈dna形式。dna包括cdna、基因组dna和合成dna；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，那么可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施方案中，多核苷酸是cdna或缺乏一个或多个内源内含子的dna。
[0396]
在一些实施方案中，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是重组产生的。
[0397]
在某些实施方案中，所述多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，所述多核苷酸是大体上纯的。在一些实施方案中，多核苷酸是从天然组分纯化的。
[0398]
在一些实施方案中，本文所提供的多核苷酸针对特定宿主中的表达进行密码子优化(将人mrna中的密码子改变为诸如大肠杆菌的细菌宿主所青睐的那些)。
[0399]
v.细胞和载体
[0400]
还提供包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
[0401]
在某些方面，本文提供表达(例如重组)特异性地结合于frα的本文所述的抗体、其抗原结合片段并且包含相关多核苷酸和表达载体的细胞(例如宿主细胞)。本文提供用于在宿主细胞中、优选地在哺乳动物细胞中重组表达的载体(例如表达载体)，其包括包含编码抗frα抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本文还提供包含用于重组表达本文所述的抗frα抗体或其抗原结合片段的所述载体的宿主细胞。在一个特定方面，本文提供用于产生本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段。
[0402]
本文所述的抗体或其抗原结合片段的重组表达涉及表达载体的构建，所述表达载体含有编码所述抗体或其片段(例如重链或轻链、包含重链或轻链的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的重链或轻链)、可变域、包含vh和vl的多肽(例如scfv)、恒定域和/或包含恒定域的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的恒定域))的多核苷酸。一旦已经获得编码本文所述的抗体或其片段的多核苷酸，即可通过重组dna技术使用本领域中众所周知的技术来产生用于产生所述抗体或其片段的载体。因此，本文描述通过表达编码抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可使用本领域技术人员众所周知的方法来构建含有用于抗体或其片段的编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组dna技术、合成技术和体内基因重组。还提供包含编码抗体或其片段的核苷酸序列的可复制载体，所述核苷酸序列可操作性连接至启动子。所述载体可例如包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公布号wo 86/05807和wo 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可将所述抗体的可变域克隆
至此类载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者。也可将编码另外的可变域或frα结合域(例如scfv)的核苷酸序列克隆至此类载体中以表达包含融合至frα结合域或其片段(例如vh或vl)的重链或轻链的融合蛋白。
[0403]
可通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如宿主细胞)，并且可接着通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体或片段(例如重链或轻链、包含重链或轻链的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的重链或轻链)、可变域、包含vh和vl的多肽(例如scfv)、恒定域和/或包含恒定域的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的恒定域))。因此，本文提供含有编码本文所述的抗体或其片段的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作性连接至启动子以在宿主细胞中表达所述序列。
[0404]
在某些实施方案中，关于多链抗体的表达，编码所有链的载体可个别地在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子。
[0405]
在某些实施方案中，宿主细胞含有包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的所有链的多核苷酸的载体。在特定实施方案中，宿主细胞含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的所有链的多种不同载体。
[0406]
载体或载体的组合可包含编码两种相互作用以形成本文所述的抗体或其抗原结合片段的多肽的多核苷酸：例如，编码包含重链和scfv的融合蛋白的第一多核苷酸和编码轻链的第二多核苷酸；编码包含轻链和scfv的融合蛋白的第一多核苷酸和编码重链的第二多核苷酸；编码包含重链和vh的融合蛋白的第一多核苷酸和编码包含轻链和vl的融合蛋白的第二多核苷酸等。在两种多肽是由两种单独载体中的多核苷酸编码时，可以3个编码包含重链的融合蛋白的多核苷酸:1个编码包含轻链的融合蛋白的多核苷酸的比率将所述载体转染至宿主细胞中。
[0407]
载体或载体的组合可包含编码三种相互作用以形成本文所述的抗体或其抗原结合片段的多肽的多核苷酸：例如，编码重链的第一多核苷酸、编码轻链的第二多核苷酸和编码包含重链恒定域、vh和vl(任选地其中vh和vl是scfv)的融合蛋白的第三多核苷酸。在三种多肽是由三种单独载体中的多核苷酸编码时，可以6个编码重链的多核苷酸:3个编码轻链的多核苷酸:1个编码融合蛋白的多核苷酸的比率将所述载体转染至宿主细胞中。
[0408]
载体或载体的组合可包含编码四种相互作用以形成本文所述的抗体或其抗原结合片段的多肽的多核苷酸：例如，编码第一重链的第一多核苷酸、编码第二重链的第二多核苷酸、编码第一轻链的第三多核苷酸和编码第二轻链的第四多核苷酸。
[0409]
在一些实施方案中，宿主细胞包含上文所述的载体或载体的组合。在其他实施方案中，两种宿主细胞、三种宿主细胞或四种宿主细胞包含上文所述的载体或载体的组合。
[0410]
可使用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体分子或其片段(例如重链或轻链、包含重链或轻链的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的重链或轻链)、可变域、包含vh和vl的多肽(例如scfv)、恒定域和/或包含恒定域的融合蛋白(例如融合至一个或多个可变域(例如scfv)的恒定域))。所述宿主表达系统表示可用于产生所关注的编码序列并且随后进行纯化的媒剂，而且表示当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文所述的抗体或其片段的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如用含有抗体编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或柯斯质粒dna表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(b.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕
赤酵母(saccharomyces pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜嵌纹病毒，camv；烟草嵌纹病毒，tmv)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，诸如莱菌衣藻(chlamydomonas reinhardtii))；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如cos(例如cos1或cos)、cho、bhk、mdck、hek 293、ns0、per.c6、vero、crl7o3o、hss78bst、hela和nih 3t3、hek-293t、hepg2、sp210、r1.1、b-w、l-m、bsc1、bsc40、yb/20和bmt10细胞)，所述构建体含有源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)。在一个特定实施方案中，用于表达本文所述的抗体或其抗原结合片段的细胞是cho细胞，例如来自cho gs system
tm
(lonza)的cho细胞。在一个特定实施方案中，由组成性启动子、诱导性启动子或组织特异性启动子调节编码免疫特异性地结合frα(例如人frα)的本文所述的抗体的核苷酸序列的表达。
[0411]
一旦已经通过重组表达产生本文所述的抗体分子或其片段(例如重链或轻链、可变域和/或包含vh和vl的多肽(例如scfv))，即可通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱(例如离子交换、亲和力(尤其通过蛋白a后对特定抗原的亲和力)和分级柱色谱)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化所述抗体分子或其片段。此外，本文所述的抗体可融合至本文所述或以其他方式在本领域中已知的异源多肽序列以促进纯化。
[0412]
vi.含有双互补位抗体的免疫缀合物
[0413]
一方面，本公开涉及包含本文所述的双互补位frα结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)和细胞毒性剂的免疫缀合物。所述细胞毒性剂可使用本领域中已知的技术直接地或间接地经由接头偶合或缀合至所述frα结合剂以产生“免疫缀合物”、“缀合物”或“adc”。
[0414]
a.示例性免疫缀合物
[0415]
在第一实施方案中，本文所提供的免疫缀合物包含本文所述的双互补位frα抗体或其抗原结合片段，其经由位于所述双互补位frα抗体或其抗原结合片段上的一个或多个赖氨酸残基的ε-氨基共价连接至本文所述的类美登素化合物。在一个实施方案中，所述免疫缀合物是由式(i)表示：
[0416][0417]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0418]
cb是双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段；
[0419]
l2是由下式之一表示：
[0420][0421]
其中：
[0422]rx
、ry、r
x’和r
y’在每次出现时独立地为h、-oh、卤素、-o-(c
1-4
烷基)、-so3h、-nr
40r41r42
或任选地经-oh、卤素、so3h或nr
40r41r42
取代的c
1-4
烷基，其中r
40
、r
41
和r
42
各自独立地为h或c
1-4
烷基；
[0423]
l和k各自独立地为整数1至10；
[0424]
l1为整数2至5；
[0425]
k1为整数1至5；并且
[0426]
s1指示连接至细胞结合剂cb的位点并且s3指示连接至a基团的位点；
[0427]
a是氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
[0428]
r1和r2各自独立地为h或c
1-3
烷基；
[0429]
l1是由下式表示：
[0430]-cr3r
4-(ch2)
1-8-c(＝o)-[0431]
其中r3和r4各自独立地为h或me，并且l1中的-c(＝o)-部分连接至d；
[0432]
d是由下式表示：
[0433]
并且
[0434]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0435]
在第一实施方案的第一特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中r
x
、ry、r
x’和r
y’均为h；并且l和k各自独立地为整数2至6；并且剩余变量是如上文关于式(i)所述。
[0436]
在第一实施方案的第二特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中a是含有2至5个氨基酸残基的肽；并且剩余变量是如上文在第一实施方案或第一特定实施方案中关于式(i)所述。在一些实施方案中，a是可通过蛋白酶裂解的肽。在一些实施方案中，可通过在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。在一些实施方案中，a是具有与-nh-cr1r
2-s-l
1-d共价连接的氨基酸的肽，所述氨基酸选自由ala、arg、asn、asp、cit、cys、硒代-cys、gln、glu、gly、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr和val组成的组，各自独立地呈l或d异构体。在一些实施方案中，连接至-nh-cr1r
2-s-l
1-d的氨基酸是l氨基酸。
[0437]
在第一实施方案的第三特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中a是选自由gly-gly-gly、ala-val、val-ala、d-val-ala、val-cit、d-val-cit、val-lys、phe-lys、lys-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、phe-ala、phe-n9-甲苯磺酰基-arg、phe-n9-硝基-arg、phe-phe-lys、d-phe-phe-lys、gly-phe-lys、leu-ala-leu、ile-ala-leu、val-ala-val、ala-ala-ala、d-ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala-d-ala、ala-leu-ala-leu(seq id no:54)、β-ala-leu-ala-leu(seq id no:55)、gly-phe-leu-gly(seq id no:56)、val-arg、arg-arg、val-d-cit、val-d-lys、val-d-arg、d-val-cit、d-val-lys、d-val-arg、d-val-d-cit、d-val-d-lys、d-val-d-arg、d-arg-d-arg、ala-ala、ala-d-ala、d-ala-ala、d-ala-d-ala、ala-met、gln-val、asn-ala、gln-phe、gln-ala、d-ala-pro和d-ala-tbu-gly组成的组，其中各肽中的第一氨基酸连接至l2基团并且各肽中的最后一个氨基酸连接至-nh-cr1r
2-s-l
1-d；并且剩余变量是如在第一实施方案或第一特定实施方案中关于式(i)所述。
[0438]
在第一实施方案的第四特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中r1和r2均为h；并且剩余变量是如在第一实施方案或第一、第二或第三特定实施方案中关于式(i)所述。
[0439]
在第一实施方案的第五特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中l1为-(ch2)
4-6-c(＝o)-；并且剩余变量是如在第一实施方案或第一、第二、第三或第四特定实施方案中关于式(i)所述。
[0440]
在第一实施方案的第六特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由上述式(i)表示，其中d是由下式表示：
[0441][0442]
并且剩余变量是如在第一实施方案或第一、第二、第三、第四或第五特定实施方案中关于式(i)所述。
[0443]
在第七特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0444]
[0445][0446]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0447]
是经由lys胺基连接至l2基团的双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段；
[0448]
是经由cys硫醇基连接至l2基团的双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段；
[0449]
r3和r4各自独立地为h或me；
[0450]
m1、m3、n1、r1、s1和t1各自独立地为整数1至6；
[0451]
m2、n2、r2、s2和t2各自独立地为整数1至7；
[0452]
t3为整数1至12；
[0453]
d1是由下式表示：
[0454]
并且
[0455]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。在一个更特定实施方案中，d1是由下式表示：
[0456][0457]
在第八特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0458][0459][0460]
其中：
[0461]
m1和m3各自独立地为整数2至4；
[0462]
m2为整数2至5；
[0463]
r1为整数2至6；
[0464]
r2为整数2至5；并且
[0465]
剩余变量是如第七特定实施方案中所述。
[0466]
在第九特定实施方案中，关于第七或第八特定实施方案中所述的免疫缀合物，a是ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala、d-ala-ala、val-ala、d-val-ala、d-ala-pro或d-ala-tbu-gly。在一个更特定实施方案中，关于第七或第八特定实施方案中所述的免疫缀合物，a是l-ala-d-ala-l-ala。
[0467]
在第十特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0468]
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475][0476]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0477]
a是ala-ala-ala、ala-d-ala-ala、ala-ala、d-ala-ala、val-ala、d-val-ala、d-ala-pro或d-ala-tbu-gly，并且
[0478]
d1是由下式表示：
[0479][0480]
并且剩余变量是如第七、第八或第九特定实施方案中所述。在一个更特定实施方案中，a是l-ala-d-ala-l-ala。在一个更特定实施方案中，d1是由下式表示：
[0481][0482]
在第十一特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0483][0484]
其中d1是由下式表示：
[0485][0486]
在一个更特定实施方案中，d1是由下式表示：
[0487][0488]
在第十二特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0489][0490]
其中：
[0491]
cba是双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(i)分别具有序列seq id no:1-3的轻链互补决定区l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3和分别具有序列seq id no:7-9的重链互补决定区h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，和(ii)分别具有序列seq id no:4-6的轻链互补决定区l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3和分别具有序列seq id no:10-12的重链互补决定区h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
[0492]
q为1或2；
[0493]
d1是由下式表示：
[0494][0495]
在某些实施方案中，关于式(i-4)或(i-6)的免疫缀合物，所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包括包含氨基酸序列seq id no:18的vl、包含氨基酸序列seq id no:23的vh、包含氨基酸序列seq id no:19的vl和包含氨基酸序列seq id no:24的vh。
[0496]
在第十三特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物是由下式表示：
[0497][0498]
其中：
[0499]
cba是双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(i)分别具有序列seq id no:1-3的轻链互补决定区l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3和分别具有序列seq id no:7-9的重链互补决定区h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，和(ii)分别具有序列seq id no:4-6的轻链互补决定区l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3和分别具有序列seq id no:10-12的重链互补决定区h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
[0500]
q是整数1至10，例如1或10；并且
[0501]
d1是由下式表示：
[0502][0503]
在某些实施方案中，关于式(i-2)的免疫缀合物，所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包括包含氨基酸序列seq id no:18的vl、包含氨基酸序列seq id no:23的vh、包含氨基酸序列seq id no:19的vl和包含氨基酸序列seq id no:24的vh。在某些实施方案中，关于式(i-2)的免疫缀合物，所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列seq id no:41、42和43的多肽。
[0504]
在第十四实施方案中，本文所提供的免疫缀合物包含偶合至类美登素化合物dm21c(还称作mal-ldl-dm或malc5-ldl-dm或化合物17a)的双互补位抗frα抗体，所述类美登素化合物由以下结构式表示：
[0505][0506]
其中所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)分别具有序列seq id no:18和seq id no:23的轻链可变区和重链可变区，和(ii)分别具有序列seq id no:19和seq id no:24的轻链可变区和重链可变区；并且d1是由下式表示：
[0507][0508]
在一个实施方案中，所述免疫缀合物是由以下结构式表示：
[0509]
其中：
[0510]
cba是双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别具有序列seq id no:18和seq id no:23的轻链可变区和重链可变区，和(ii)分别具有序列seq id no:19和seq id no:24的轻链可变区和重链可变区；并且
[0511]
q为1或2。
[0512]
在某些实施方案中，关于包含第十四特定实施方案的免疫缀合物的组合物(例如药物组合物)，dar是在1.5-2.2、1.7-2.2或1.9-2.1范围内。在一些实施方案中，dar为1.7、1.8、1.9、2.0或2.1。
[0513]
在第十五特定实施方案中，本文所提供的免疫缀合物包含偶合至类美登素化合物dm21(还称作dm21l、ldl-dm或化合物14c)的双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段，所述类美登素化合物由以下结构式表示：
[0514][0515]
所述偶合是经由γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酸n-丁二酰亚胺酯(gmbs)或n-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-gmbs或sgmbs)接头。所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含(i)分别具有序列seq id no:18和seq id no:23的轻链可变区和重链可变区，和(ii)分别具有序列seq id no:19和seq id no:24的轻链可变区和重链可变区。
[0516]
gmbs和磺基-gmbs(或sgmbs)接头是本领域中已知的并且可由以下结构式表示：
[0517][0518]
在一个实施方案中，所述免疫缀合物是由以下结构式表示：
[0519][0520]
其中：
[0521]
cba是双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别具有序列seq id no:18和seq id no:23的轻链可变区和重链可变区，和(ii)分别具有序列seq id no:19和seq id no:24的轻链可变区和重链可变区；并且
[0522]
q是整数1至10，例如1或10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0523]
在某些实施方案中，关于第十五特定实施方案的免疫缀合物，所述双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列seq id no:41、42和43的多肽。
[0524]
在某些实施方案中，关于包含第十五特定实施方案的免疫缀合物的组合物(例如药物组合物)，dar是在3.0-4.0、3.2-3.8、3.1-3.7或3.4-3.7范围内。在一些实施方案中，dar为3.2、3.3、3.4、3.5、3.5、3.7或3.8。在一些实施方案中，dar为3.5。
[0525]
在某些实施方案中，关于包含赖氨酸缀合物的组合物，dar是在1.5-3.1范围内。在一些实施方案中，dar为约2.0。
[0526]
在某些实施方案中，关于包含第一实施方案或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五特定实施方案的免疫缀合物的组合物(例如药物组合物)，每个抗体分子的细胞毒性剂的平均数目(即，q平均值)(还称作所述组合物中的药物-抗体比率(dar))是在1.0-8.0范围内。在一些实施方案中，dar是在1.0-5.0、1.0-4.0、1.5-4.0、2.0-4.0、2.5-4.0、1.0-3.4、1.0-3.0、3.0-4.0、3.1-3.5、3.1-3.7、3.4-3.6、1.5-2.5、2.0-2.5、1.7-2.3或1.8-2.2范围内。在一些实施方案中，dar是小于4.0、小于3.8、小于3.6、小于3.5、小于3.0或小于2.5。在一些实施方案中，dar是在3.1-3.7范围内。在一些实施方案中，dar是在3.1-3.4范围内。在一些实施方案中，dar是在3.3-3.7范围内。在一些实施方案中，dar是在3.5-3.9范围内。在一些实施方案中，dar为3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7或3.8。在一些实施方案中，dar为3.5。在一些实施方案中，dar是在1.8-2.0范围内。在一些实施方案中，dar是在1.7-1.9范围内。在一些实施方案中，dar是在1.9-2.1范围内。在一些实施方案中，dar为1.9、2.0或2.1。在一些实施方案中，关于包含经由一个或多个半胱氨酸硫醇基连接至类美登素化合物的双互补位抗frα抗体或其抗原结合片段的本发明免疫缀合物，dar是在1.5-2.5、1.8-2.2、1.1-1.9或1.9-2.1范围内。在一些实施方案中，dar为1.8、1.9、2.0或2.1。
[0527]
b.接头
[0528]
本领域中已知的任何合适接头均可用于制备本公开的免疫缀合物。在某些实施方案中，所述接头是双官能接头。如本文所用，术语“双官能接头”是指具有两个反应性基团的修饰剂；所述反应性基团之一能够与细胞结合剂反应，而另一者与类美登素化合物反应以使所述两个部分连接在一起。所述双官能交联剂是本领域中众所周知的(参见例如isalm和dent，bioconjugation第5章,第218-363页,groves dictionaries inc.new york,1999)。例如，使得能够经由硫醚键连接的双官能交联剂包括n-丁二酰亚胺基-4-(n-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(smcc)以引入顺丁烯二酰亚胺基，或n-丁二酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(siab)以引入碘乙酰基。在细胞结合剂上引入顺丁烯二酰亚胺基或卤基乙酰基的其他双官能交联剂是本领域中众所周知的(参见美国专利公布号2008/0050310、20050169933，可获自pierce biotechnology inc.p.o.box 117,rockland,il 61105,usa)，并且包括但不限于双-顺丁烯二酰亚胺基聚乙二醇(bmpeo)、bm(peo)2、bm(peo)3、n-(β-顺丁烯二酰亚胺基丙氧基)丁二酰亚胺酯(bmps)、γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酸n-丁二酰亚胺酯(gmbs)、ε-顺丁烯二酰亚胺基己酸n-羟基丁二酰亚胺酯(emcs)、5-顺丁烯二酰亚胺基戊酸nhs、hbvs、n-丁二酰亚胺基-4-(n-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(它是smcc的“长链”类似物(lc-smcc))、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基丁二酰亚胺酯(mbs)、4-(4-n-顺丁烯二酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼或hcl盐(mpbh)、n-丁二酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(sbap)、n-丁二酰亚胺基碘乙酸酯(sia)、κ-顺丁烯二酰亚胺基十一酸n-丁二酰亚胺酯(kmua)、n-丁二酰亚胺基4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)-丁酸酯(smpb)、丁二酰亚胺基-6-(β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(smph)、丁二酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(svsb)、二硫双-顺丁烯二酰亚胺基乙烷(dtme)、1,4-双-顺丁烯二酰亚胺基丁烷(bmb)、1,4-双顺丁烯二酰亚胺基-2,3-二羟基丁
烷(bmdb)、双-顺丁烯二酰亚胺基己烷(bmh)、双-顺丁烯二酰亚胺基乙烷(bmoe)、磺基丁二酰亚胺基4-(n-顺丁烯二酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-smcc)、磺基丁二酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-siab)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基磺基丁二酰亚胺酯(磺基-mbs)、n-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-gmbs或sgmbs)、n-(ε-顺丁烯二酰亚胺基己酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-emcs)、n-(κ-顺丁烯二酰亚胺基十一酰基氧基)磺基丁二酰亚胺酯(磺基-kmus)和磺基丁二酰亚胺基4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-smpb)。
[0529]
杂双官能交联剂是具有两个不同的反应性基团的双官能交联剂。也可使用含有胺反应性n-羟基丁二酰亚胺基(nhs基团)和羰基反应性肼基两者的杂双官能交联剂使本文所述的细胞毒性化合物与细胞结合剂(例如，抗体)连接。所述市售的杂双官能交联剂的实例包括丁二酰亚胺基6-肼基烟酰胺丙酮腙(sanh)、丁二酰亚胺基4-肼基对苯二甲酸酯盐酸盐(shth)和丁二酰亚胺基烟酸酯盐酸盐(shnh)。也可使用本公开的具有肼的苯二氮平衍生物来制备具有酸不稳定键的缀合物。可使用的双官能交联剂的实例包括丁二酰亚胺基-对甲酰基苯甲酸酯(sfb)和丁二酰亚胺基-对甲酰基苯氧基乙酸酯(sfpa)。
[0530]
使得能够经由二硫键使细胞结合剂与细胞毒性化合物连接的双官能交联剂是本领域中已知的，并且包括n-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、n-丁二酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(spp)、n-丁二酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(spdb)、n-丁二酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-spdb或sspdb)以引入二硫基吡啶基。可用于引入二硫基的其他双官能交联剂是本领域中已知的，并且公开于美国专利6,913,748、6,716,821和美国专利公布2009/0274713和2010/0129314中，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。或者，也可使用引入硫醇基的交联剂，诸如2-亚氨基硫杂戊环、高半胱氨酸硫内酯或s-乙酰基丁二酸酐。
[0531]
c.细胞毒性剂
[0532]
在一些实施方案中，本文提供可用于制备本公开的免疫缀合物的细胞毒性剂。用于本文所提供的免疫缀合物的细胞毒性剂可以是引起细胞死亡或诱导细胞死亡或以某一方式降低细胞活力的任何化合物，并且包括例如类美登素和类美登素类似物、苯二氮平、类紫杉醇、cc-1065和cc-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、烯二炔(诸如卡奇霉素)、尾海兔素和尾海兔素类似物(包括澳瑞他汀)、茅层霉素衍生物、来普霉素衍生物、甲氨喋呤、顺铂、卡铂、道诺霉素、多柔比星、长春新碱、长春花碱、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥和吗啉基多柔比星。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂为类美登素和类美登素类似物。
[0533]
合适类美登素的实例包括美登醇和美登醇类似物的酯。包括抑制微管形成并且对哺乳动物细胞具有高度毒性的任何药物，美登醇和美登醇类似物也是如此
[0534]
示例性细胞毒性剂先前描述于wo 2018/160539 a1和wo 2011/106528中，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0535]
本文所提供的免疫缀合物可包含类美登素化合物，其由下式表示：
[0536]
l2′‑
a-nh-cr1r
2-s-l
1-d
ꢀꢀ
(ii)
[0537]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0538]
l2’
是由以下结构式表示：
[0539][0540]
其中：
[0541]rx
、ry、r
x’和r
y’在每次出现时独立地为h、-oh、卤素、-o-(c
1-4
烷基)、-so3h、-nr
40r41r42
或任选地经-oh、卤素、-so3h或nr
40r41r42
取代的c
1-4
烷基，其中r
40
、r
41
和r
42
各自独立地为h或c
1-4
烷基；
[0542]
l和k各自独立地为整数1至10；
[0543]jcb’为-c(＝o)oh或-coe，其中-coe为反应性酯；
[0544]
a是氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
[0545]
r1和r2各自独立地为h或c
1-3
烷基；
[0546]
l1是由下式表示：
[0547]-cr3r
4-(ch2)
1-8-c(＝o)-；
[0548]
其中r3和r4各自独立地为h或me，并且l1中的-c(＝o)-部分连接至d；
[0549]
d是由下式表示：
[0550]
并且
[0551]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0552]
在一些实施方案中，本发明的类美登素是由下式表示：
[0553]a′‑
nh-cr1r
2-s-l
1-d
ꢀꢀ
(iii)
[0554]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0555]
a’是氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽(即，a-nh2)；
[0556]
r1和r2各自独立地为h或c
1-3
烷基；
[0557]
l1为-cr3r
4-(ch2)
1-8-c(＝o)-；r3和r4各自独立地为h或me；
[0558]
d是由下式表示：
[0559]
并且
[0560]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0561]
在一些实施方案中，本发明的类美登素是由下式表示：
[0562][0563]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0564]rx’和r
y’在每次出现时独立地为h、-oh、卤素、-o-(c
1-4
烷基)、-so3h、-nr
40r41r42
或任选地经-oh、卤素、so3h或nr
40r41r42
取代的c
1-4
烷基，其中r
40
、r
41
和r
42
各自独立地为h或c
1-4
烷基；
[0565]
k为整数1至10；
[0566]
a是氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
[0567]
r1和r2各自独立地为h或c
1-3
烷基；
[0568]
l1为-cr3r
4-(ch2)
1-8-c(＝o)-；r3和r4各自独立地为h或me；
[0569]
d是由下式表示：
[0570]
并且
[0571]
q是整数1至20。在一些实施方案中，q是整数1至10。在一些实施方案中，q是整数2至5。在一些实施方案中，q是整数3至4。
[0572]
在一些实施方案中，关于式(ii)、(iii)或(iv)的类美登素化合物，变量是如第一实施方案或第一实施方案中的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一特定实施方案中所述。
[0573]
在一个特定实施方案中，所述类美登素化合物是由下式表示：
[0574][0575][0576]
合适美登醇酯的另外的实例包括具有经修饰的芳环的那些和在其他位置处具有
修饰的那些。所述合适类美登素公开于美国专利号4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；5,208,020；5,416,064；5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,333,410；7,276,497和7,473,796中。另外，关于产生所述抗体-类美登素缀合物的若干描述提供于美国专利号6,333,410、6,441,163、6,716,821和7,368,565中，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0577]
在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含n2’-脱乙酰基-n2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(dm1)、n2’-脱乙酰基-n2’-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(称作dm3)、n2’-脱乙酰基-n2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(dm4)，其中两者先前描述于pct申请公布号wo 2011/106528 a1和美国专利号8,557,966 b2中，所述文献中的每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0578]
d.药物缀合
[0579]
可根据本领域中已知的任何合适方法制备本文所述的包含共价连接至细胞毒性剂(例如类美登素)的双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物。
[0580]
在某些实施方案中，可通过第一方法制备第一实施方案的免疫缀合物，所述第一方法包括使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与描述于第二实施方案中的式(ii)的类美登素化合物反应的步骤。
[0581]
在某些实施方案中，可通过第二方法制备第一实施方案的免疫缀合物，所述第二方法包括以下步骤：
[0582]
(a)使式(iii)或(iv)的类美登素化合物与本文所述的接头化合物反应以形成其上结合有胺反应性基团或硫醇反应性基团的细胞毒性剂-类美登素化合物(例如式(ii)化合物)，其可共价连接至所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段；和
[0583]
(b)使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与所述类美登素-接头化合物反应以形成所述免疫缀合物。
[0584]
在某些实施方案中，可通过第三方法制备第一实施方案的免疫缀合物，所述第三方法包括以下步骤：
[0585]
(a)使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与本文所述的接头化合物反应以形成其上结合有胺反应性基团或硫醇反应性基团的经修饰的双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段，其可共价连接至式(iii)或(iv)的类美登素化合物；和
[0586]
(b)使所述经修饰的双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与式(iii)或(iv)的类美登素化合物反应以形成所述免疫缀合物。
[0587]
在某些实施方案中，关于上述第二、第三或第四方法，所述接头化合物是由式(a1l)-(a10l)中任一者表示：
[0588][0589]
其中x为卤素；jd为-sh或-ssrd；rd为苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；rg为烷基；并且u为-h或so3h或其药学上可接受的盐。
[0590]
在一个实施方案中，所述接头化合物是由式(a9l)表示的gmbs或磺基-gmbs(或sgmbs)，其中u为-h或so3h或其药学上可接受的盐。
[0591]
在一个特定实施方案中，本发明的免疫缀合物是由下式表示：
[0592][0593]
(i-1)；并且可通过上述第二、第三或第四方法制备所述免疫缀合物，其中所述接头化合物是由式(a9l)表示的gmbs或磺基-gmbs，其中u为-h或so3h或其药学上可接受的盐；并且所述类美登素化合物是由上述式(d-1)表示。在一个更特定实施方案中，通过使式(d-1)的类美登素化合物与接头化合物gmbs或磺基-gmbs反应以形成类美登素-接头化合物，随后使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与所述类美登素-接头化合物反应来制备式(i-1)的免疫缀合物。在一个甚至更特定实施方案中，所述类美登素接头化合物在与所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段反应之前未纯化。
[0594]
在另一特定实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0595][0596]
(i-2)；并且可通过上述第二、第三或第四方法制备所述免疫缀合物，其中所述接头化合物是由式(a9l)表示的gmbs或磺基-gmbs，其中u为-h或so3h或其药学上可接受的盐；并且所述类美登素化合物是由上述式(d-2)表示。在一个更特定实施方案中，通过使式(d-2)的类美登素化合物与接头化合物gmbs或磺基-gmbs反应以形成类美登素-接头化合物，随后使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与所述类美登素-接头化合物反应来制备式(i-2)的免疫缀合物。在一个甚至更特定实施方案中，所述类美登素接头化合物在与所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段反应之前未纯化。
[0597]
在另一特定实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
[0598][0599]
(i-3)；并且根据上述第一方法通过使所述双互补位frα结合抗体或其抗原结合片段与上述式(d-3)的类美登素化合物反应来制备所述免疫缀合物。
[0600]
在另一特定实施方案中，所述免疫缀合物是由下式表示：
corp.,east hills,n.y.)
[0613]
任何合适的吸附色谱树脂均可用于纯化。优选的吸附色谱树脂包括羟磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱(hcic)、疏水性相互作用色谱(hic)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定金属亲和力色谱(imac)、染料配体色谱、亲和力色谱、逆相色谱和其组合。合适羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石(cht i型和ii型，bio-rad laboratories,hercules,calif.)、ha ultrogel羟磷灰石(pall corp.,east hills,n.y.)和陶瓷氟磷灰石(cft i型和ii型，bio-rad laboratories,hercules,calif.)。合适hcic树脂的实例为mep hypercel树脂(pall corp.,east hills,n.y.)。合适hic树脂的实例包括butyl-sepharose、hexyl-sepharose、phenyl-sepharose和octyl sepharose树脂(均来自ge healthcare,piscataway,n.j.)，以及macro-prep methyl和macro-prep t-butyl树脂(biorad laboratories,hercules,calif.)。合适离子交换树脂的实例包括sp-sepharose、cm-sepharose和q-sepharose树脂(均来自ge healthcare,piscataway,n.j.)和unosphere s树脂(bio-rad laboratories,hercules,calif.)。合适混合模式离子交换剂的实例包括bakerbond abx树脂(jt baker,phillipsburg n.j.)合适imac树脂的实例包括chelating sepharose树脂(ge healthcare,piscataway,n.j.)和profinity imac树脂(bio-rad laboratories,hercules,calif.)。合适染料配体树脂的实例包括blue sepharose树脂(ge healthcare,piscataway,n.j.)和affi-gel blue树脂(bio-rad laboratories,hercules,calif.)。合适亲和力树脂的实例包括蛋白a琼脂糖树脂(例如mabselect，ge healthcare,piscataway,n.j.)，其中细胞结合剂为抗体；和凝集素亲和力树脂，例如小扁豆凝集素琼脂糖树脂(ge healthcare,piscataway,n.j.)，其中细胞结合剂携带适当凝集素结合位点。或者，可使用对细胞结合剂具特异性的抗体。此类抗体可固定至例如sepharose 4fast flow树脂(ge healthcare,piscataway,n.j.)。合适逆相树脂的实例包括c4、c8和c18树脂(grace vydac,hesperia,calif.)。
[0614]
任何合适非吸附色谱树脂均可用于纯化。合适非吸附色谱树脂的实例包括但不限于sephadextmg-25、g-50、g-100、sephacryltm树脂(例如s-200和s-300)、superdextm树脂(例如superdextm 75和superdextm 200)、树脂(例如p-6、p-10、p-30、p-60和p-100)，和本领域普通技术人员已知的其他树脂。
[0615]
vii.组合物和试剂盒
[0616]
本文提供包含在生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有所需程度的纯度的本文所述的免疫缀合物、抗体或其抗原结合片段的组合物(remington’s pharmaceutical sciences(1990)mack publishing co.,easton,pa)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒。
[0617]
可配制药物组合物用于针对受试者的特定施用途径。例如，可配制药物组合物用于肠胃外(例如静脉内)施用。将用于体内施用的组合物可以是无菌的。这容易通过经由例如无菌滤膜过滤来实现。
[0618]
本文所述的药物组合物在一个实施方案中是用作药剂。本文所述的药物组合物可用于治疗诸如癌症的疾患。可如本文所述加以治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定实例包括输卵管癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细
胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌和多种类型的头颈部癌。所述癌症可以是frα表达性癌。
[0619]
本文所提供的药物组合物可包含免疫缀合物，并且所述药物组合物(所述药物组合物中的免疫缀合物)可具有每个双互补位抗体或其抗原结合片段平均1至20个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个双互补位抗体或其抗原结合片段平均1至10个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个双互补位抗体或其抗原结合片段平均2至5个药物。在一些实施方案中，药物组合物包含每个双互补位抗体或其抗原结合片段平均3至4个药物。
[0620]
viii.方法和用途
[0621]
本公开的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如癌症治疗。在某些实施方案中，所述剂可用于抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤体积。所述使用方法可以是体外或体内方法。
[0622]
本公开提供治疗癌症的方法，其包括向受试者(例如需要治疗的受试者)施用治疗有效量的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物。在某些实施方案中，所述癌症是包括但不限于输卵管癌、癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病的癌症。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(tnbc))、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌和多种类型的头颈部癌。
[0623]
所述癌症的更特定实例包括卵巢癌、上皮卵巢癌、卵巢原发性腹膜癌或输卵管癌。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述卵巢癌是上皮卵巢癌(eoc)。在某些实施方案中，所述卵巢癌(例如eoc)是铂抗性、复发性或难治性的。在某些实施方案中，所述癌症是腹膜癌。在某些实施方案中，所述腹膜癌是原发性腹膜癌。在某些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。在某些实施方案中，所述子宫内膜癌是浆液性子宫内膜癌。在某些实施方案中，癌症是肺癌。在某些实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌(nsclc)。在某些实施方案中，所述肺癌是腺癌或细支气管肺泡癌。在某些实施方案中，所述癌症是子宫癌。
[0624]
在某些实施方案中，所述癌症是铂难治性的。在某些实施方案中，所述癌症是原发性铂难治性的。在某些实施方案中，所述癌症是铂敏感性的。
[0625]
在某些实施方案中，所述癌症是imgn853抗性的。
[0626]
在某些实施方案中，所述癌症是转移性或晚期癌症。
[0627]
在某些实施方案中，所述癌症表达与frα结合剂或抗体结合的叶酸盐受体。在某些实施方案中，所述癌症过表达人frα。
[0628]
在一些实施方案中，将所述双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段、免疫缀合物或包含其的药物组合物施用于具有增加的frα表达水平的患者，例如，如美国公布申请号2012/0282175或国际公布申请号wo 2012/135675所述，其中两者均以引用的方式整体并入本文中。用于检测frα的示例性抗体、分析和试剂盒提供于wo 2014/036495和wo 2015/031815中，其中两者均以引用的方式整体并入本文中。因此，在一些实施方案中，通过免疫
组织化学(ihc)测量frα蛋白表达并且通过与展现规定分数的对照(例如经校准对照)比较来给出染色强度分数和/或染色均一性分数(例如，如果强度与水平3经校准对照可相当，那么对测试样品给予强度分数3，或如果强度与水平2经校准对照可相当，那么对测试样品给予强度分数2(中等))。呈“异质”(即，至少25％并且少于75％细胞染色)或“均质”(即，至少75％细胞染色)而非“局部”(即，大于0％并且少于25％细胞染色)的染色均一性还指示增加的frα表达。染色强度和染色均一性分数可单独或组合(例如2均质、2异质、3均质、3异质等)使用。在另一实施例中，可通过检测相对于对照值(例如，来自未患癌症或患有未具有升高的frα值的癌症的受试者的组织或细胞中的表达水平)至少2倍、至少3倍或至少5倍)的增加来测定frα表达的增加。在一些实施方案中，染色均一性分数是基于染色细胞的百分比。
[0629]
在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以1异质或更高水平表达frα的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以2异质或更高水平表达frα的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以3异质或更高水平表达frα的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以2异质或更高水平表达frα的肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以3异质或更高水平表达frα的肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以2异质或更高水平表达frα的卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以3异质或更高水平表达frα的卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以2异质或更高水平表达frα的子宫内膜癌。在一些实施方案中，所述癌症是通过ihc发现以1异质或更高水平表达frα的子宫内膜样癌。
[0630]
在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少一种细胞具有至少为1的frα分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少一种细胞具有至少为2(中等)的frα分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少一种细胞具有至少为3的frα分数。
[0631]
在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少25％细胞具有至少为1的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少33％细胞具有至少为1的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少50％细胞具有至少为1的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少66％细胞具有至少为1的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少75％细胞具有至少为1的frαihc分数。
[0632]
在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少25％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少33％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的25-75％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少50％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少66％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少75％细胞具有至少为2(中等)的frαihc分数。
[0633]
在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少25％细胞具有至少为3的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少33％细胞具有至少为3的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少50％细胞具有至少为3的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少66％细胞具有至少为3的frαihc分数。在一些实施方案中，从患者获得的样品中的至少75％细胞具有至少为3的frαihc分数。
[0634]
在一些实施方案中，可通过免疫组织化学测量frα表达并且给出视觉分数，其中fr
α阳性可指大于或等于50％的肿瘤细胞具有在小于或等于10x显微镜物镜下可见的frα膜染色。在一些实施方案中，可通过免疫组织化学测量frα表达并且给出视觉分数，其中frα阳性可指大于或等于66％的肿瘤细胞具有在小于或等于10x显微镜物镜下可见的frα膜染色。在一些实施方案中，可通过免疫组织化学测量frα表达并且给出视觉分数，其中frα阳性可指大于或等于75％的肿瘤细胞具有在小于或等于10x显微镜物镜下可见的frα膜染色。
[0635]
在某些实施方案中，所述受试者是人。
[0636]
本公开还提供使用本文所述的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物来抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，所述抑制肿瘤生长的方法包括体外使肿瘤与本文所提供的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物接触。例如，在其中添加有双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物的培养基中培养表达frα的永生化细胞系或癌细胞系以抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，从诸如组织活检、胸膜积液或血样的患者样品中分离肿瘤细胞并且在其中添加有双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物的培养基中培养以抑制肿瘤生长。
[0637]
在一些实施方案中，所述抑制肿瘤生长的方法包括体内使肿瘤或肿瘤细胞与双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物接触。在某些实施方案中，使肿瘤或肿瘤细胞与双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物接触是在动物模型中进行的。例如，可将双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物施用于已经在免疫受损小鼠(例如nod/scid小鼠)中生长的表达一种或多种肿瘤的异种移植物以抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，从诸如组织活检、胸膜积液或血样的患者样品中分离癌症干细胞并且注射至免疫受损小鼠中，接着对所述小鼠施用双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物以抑制肿瘤细胞生长。
[0638]
在某些实施方案中，所述抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者具有肿瘤或已经去除肿瘤。
[0639]
施用可以是肠胃外(包括静脉内)施用。
[0640]
将有效治疗疾患的双互补位免疫缀合物、抗体或其抗原结合片段、或组合物的量将取决于所述疾病的性质。将用于组合物中的精确剂量还将取决于施用途径和所述疾病的严重性。
[0641]
在一些实施方案中，本文提供用作药剂的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段、免疫缀合物或包含其的药物组合物。在一些方面，本文提供用于治疗癌症的方法的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物。在一些方面，本文提供用于治疗受试者的癌症的方法的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所提供的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物。
[0642]
一方面，本公开的双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段和免疫缀合物可用于检测frα例如在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在某些实施方案中，所述组织包括正常组织和/或相对于其他组织以较高水平表达frα的癌组织。在某些实施方案中，frα过表达检测卵巢癌、肺癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、肾癌或胰腺癌的存在。
[0643]
在某些实施方案中，检测frα在生物样品中的存在的方法包括使所述生物样品与双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物在可允许双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物的结合的条件下接触，和检测是否在所述双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物与frα之间形成复合物。
[0644]
在某些实施方案中，双互补位抗frα抗体、其抗原结合片段或免疫缀合物是经标记的。标记包括但不限于直接地检测的标记或部分(诸如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如经由酶反应或分子相互作用间接地检测的部分，诸如酶或配体。
[0645]
本公开的实施方案可进一步参考以下非限制性实施例来定义，所述非限制性实施例详细地描述本公开的某些抗体的制备和使用本公开的抗体的方法。本领域技术人员应显而易知，可对材料和方法实施多种修改而不偏离本公开的范围。
[0646]
实施例
[0647]
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅是出于说明性目的并且根据其的多种修改或改变将被建议给本领域技术人员并且意图包括于本技术的精神和范围内。
[0648]
实施例1.产生双互补位抗体
[0649]
双特异性抗体的表达
[0650]
如先前所述，通过标准杂交瘤技术产生一组鼠科动物抗frα抗体并且使用表面重塑方法使其人化(参见例如wo 2011/106528 a1)。抗体被分类成两个仓，这取决于使用facs竞争分析发现其与mov19竞争结合(仓1)或未竞争结合(仓2：frα抗体a、frα抗体b、frα抗体c和fr57)。简单说来，使1.5
×
10-9
m m9346a生物素化抗体与在一般从5
×
10-8
m至5
×
10-11
m的浓度范围下的frα抗体a、frα抗体b、frα抗体c和fr57混合。使用非生物素化m9346a抗体作为完全结合竞争的对照。将所述混合物添加至每孔含有20,000个frα阳性kb细胞的96孔板中，并且在冰上孵育所述板持续一小时。接着用冷磷酸盐缓冲生理盐水/1％牛血清白蛋白洗涤所述细胞，并且用抗生蛋白链菌素-pe试剂检测结合的hum9346a-生物素。使用facscalibur流式细胞仪分析样品。如图1所示，仅对照抗体m9346a与hum9346a-生物素竞争结合；四种分析的fr-抗体均未干扰hum9346a-生物素的结合。
[0651]
使用仓1和仓2抗体的可变区(vh和vl)，使用两种不同形式来构建数种双互补位分子：morrison氏形式和不对称-fc。简单说来，关于基于morrison氏形式的分子，通过(g4s)4接头连接对应于仓1或仓2抗体的vh和vl区的序列以产生单链片段(scfv)，接着使用(g4s)3接头将所述单链片段(scfv)融合至仓2或仓1igg1的重链的c或n端。使用杵臼技术用fr57scfv和mov19 fab产生基于不对称-fc的双互补位分子(protein eng.1996年7月；9(7):617-21.'knobs-into-holes'engineering of antibody ch3 domains for heavy chain heterodimerization.ridgway jb,presta lc,carter,p)。简单说来，将fr1-57scfv融合至含有c220s(使未配对半胱氨酸突变为丝氨酸)和杵突变(t366w)的工程改造的fc区；并且将mov19 fab区融合至含有臼突变(t366s、l368a和y407v)的工程改造的fc。除非另外注明，否则所有编号均是基于eu系统。图2示出在后续实验中评估的多种抗体形式。
[0652]
某些所构建分子的序列提供于表6-7中。使用标准分子生物学技术将对应于这些双特异性抗体的基因密码子优化、合成并且克隆至质粒中。用于转染的轻链和重链质粒的比率针对基于morrison氏的分子保持1:3；并且针对基于不对称-fc的分子保持9:3:1(mov19lc:mov19 hc-臼:fr57scfv-杵)。如图3所示，研究数种重链和轻链质粒转染比率来
产生基于不对称-fc的分子，其中比率9:3:1显示最少量的同源二聚体。
[0653]
所有双特异性抗体分子均在293t中短暂地产生。简单说来，关于293t转染，在摇瓶中使用pei作为转染试剂在悬浮适应性hek-293t细胞中短暂地产生表达构建体。如先前所述(durocher等人,nucleic acids res.30(2):e9(2002))来执行pei短暂转染，除了hek-293t细胞在freestyle 293中生长并且在添加pei-dna复合物之后，培养物体积保持未稀释。孵育所述转染持续一周并且进行收集。
[0654]
抗体纯化
[0655]
使用基本上由两个色谱步骤组成的流程来纯化已过滤上清液：蛋白a亲和力和陶瓷羟磷灰石(cht)。简单说来，将已过滤上清液装载于已经用1x pbs(ph 7.3
±
0.1)预平衡的蛋白a柱上。用1x pbs(ph7.3
±
0.1)洗涤所述柱以减少非特异性宿主细胞蛋白质。使用含有50mm氯化钠的25mm乙酸(ph 3.2)来洗脱结合的抗体并且立即用1m tris-碱中和至ph 7.0
±
0.2。将已中和的池1:10稀释于cht结合缓冲液(15mm磷酸钠，ph 7.0
±
0.1)中并且装载于用cht结合缓冲液预平衡的ii型cht柱(40μm粒径)上。使用线性梯度(10个柱体积中的15mm-160mm磷酸钠)来洗脱结合的蛋白质，并且汇集所关注的部分(高百分比单体，通过尺寸排阻色谱sec)，针对1x pbs(ph 7.3
±
0.1)透析，并且过滤灭菌。通过测量在280nm下的吸光度和1.44ml mg-1
cm-1
的消光系数来测定最终抗体浓度。
[0656]
在配备有在线uv、电导率和ph探针的akta纯化系统上进行所有纯化实验。使用agilent hplc 1100系统通过在tskgel g3000swxl柱(7.8
×
300mm)上注射40μg样品来执行sec分析，所述柱还具有在线保护柱(6.0
×
40mm)以延长柱寿命。流动相含有50mm磷酸钠缓冲液和400mm高氯酸钠，流量为1.0ml/min，并且洗脱是等度的。
[0657]
实施例2.双互补位抗体形式对抗体产生、稳定性和功能活性的影响
[0658]
亲本(仓1和仓2)抗体的结合特征
[0659]
表10概述仓1和仓2抗体与重组frα抗原的结合的动力学参数。基本上根据制造商的推荐程序经由在octet96系统(fortebio)上执行的生物层干涉术获得kd值。简单说来，将抗人-或抗鼠科动物-fc传感器预浸泡于1x动力学缓冲液(fortebio)中持续10min并且用5μg/ml仓1或仓2igg孵育持续5min。所述传感器接着依序移动至1x动力学缓冲液持续5min(以测定基线)、用于缔合的抗原连续稀释液(10min)和用于解离的1x动力学缓冲液(10min)。收集原始数据，加以处理并且使用fortebio分析软件拟合至简单1:1结合模型以测定动力学参数k缔合和k解离。
[0660]
表10.
[0661]
名称kd(m)k缔合(1/ms)k解离(1/s)mov19(仓1)6
×
10-105×
10
53×
10-4
fr57(仓2)1
×
10-93×
10
54×
10-4
frα抗体a(仓2)4
×
10-91×
10
54×
10-4
frα抗体b(仓2)1
×
10-83×
10
54×
10-3
frα抗体c(仓2)3
×
10-93×
1057
×
10-4
[0662]
双互补位抗体的稳定性
[0663]
通过组合mov19抗体与识别另一非重叠表位的抗体来产生双互补位抗体。具体说来，通过将来自仓igg之一的scfv融合至来自另一仓的igg的c或n端来产生基于morrison氏
形式的igg。表11列出所研究的所有组合。融合至c端的scfv是呈vh-vl取向；并且融合至n端的那些是呈vl-vh取向。mov19作为仅在c端呈vh-vl和vl-vh取向两者的scfv加以研究，具有或不具有brinkmann的vh44-vl100二硫化物稳定性突变(pnas 1993年8月；90(16):7538-754.a recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized fv fragment.u brinkmann,y reiter,s h jung,b lee和i pastan)。
[0664]
表11.
[0665][0666]
如表9所示，大量的基于morrison氏形式的双互补位分子在蛋白a亲和力纯化后具有低百分比单体。由于可扩展性或可制造性可能成为具有低百分比单体的构建体的挑战，选择展现较高效价和大于70的单体％的八种构建体(在表9中由星号指示)用于进一步评估。使用陶瓷羟磷灰石色谱将这八种构建体进一步研磨至大于95％纯度并且使其经受进一步表征。为了说明scfv臂的总体分子构形或潜在结构改变对双互补位臂的结合的影响，通过竞争facs分析来分析八种morrison氏构建体的各臂的结合效率。简单说来，用与在一般
从50nm至0.2nm的浓度范围下的相应鼠科动物亲本抗体混合的0.8nm morrison氏抗体孵育frα阳性t47d细胞。在冰上孵育持续2小时之后，从未结合的抗体洗出细胞，并且用第二抗人fitc标记抗体检测结合的morrison氏抗体。在增加浓度的亲本抗体存在下减少的morrison氏抗体结合指示对臂的第二集合的结合的影响。如图4a-4h和表12所示，八种morrison氏抗体中的五种具有完全无活性或部分地受影响的臂。在具有功能性臂的两个集合的三种morrison氏抗体中，两种抗体(frα-抗体-a-scfv2-mov19-igg1和frα-抗体-c-scfv2-mov19-igg1)展现稳定性问题。基于这些数据，选择fr57scfv2-mov19-igg1(“四价”)用于进一步评估。
[0667]
表12.
[0668][0669]
在一个独立实验中，还表达两种基于不对称-fc形式的双互补位分子(fr57scfv2-杵-mov19-臼和fr57scfv3wt-杵-mov19-臼)。fr57scfv2-杵-mov19-臼(“kih”)展现较高单体％和效价并且经选择用于进一步评估。如图5所示，这种分子在凝胶电泳中在非还原条件下呈单一色带(对应于约125kda)跑胶并且在还原条件下分解成3个色带(一个对应于轻链(约25kda)并且两个对应于相似尺寸(各自约50kda)的重链(fr57scfv-fc-杵和mov19-hc-臼))。这些结果表明fr57scfv2-杵-mov19-臼在细胞培养物中正确地组装并且在纯化期间未崩溃。
[0670]
接着，通过在40℃下加热fr57scfv2-杵-mov19-臼分子(浓度：10mg/ml于1x pbs中)持续2周并且基本上使用实施例1所述的程序执行sec分析来评估所述分子的稳定性。图6示出第0天和第14天样品的sec覆盖图。具体说来，未观察到聚集或裂解，表明所述分子的良好稳定性。
[0671]
抗体结合和处理
[0672]
在体外使用3[h]-抗体来评估抗体形式对抗体结合和处理的影响。简单说来，在37℃下使frα阳性kb细胞暴露于饱和浓度的亲本、kih双互补位或morrison氏抗体持续30min，在pbs中洗涤以去除任何未结合的抗体，再悬浮于新鲜培养基中，并且在37℃下在潮湿6％co2气氛中孵育持续22h。在丙酮萃取和液体闪烁计数之后评估无蛋白质放射性(已处理抗体)和蛋白质相关放射性(未处理抗体)的量，并且使用所述数据来计算每个细胞的抗体结合位点(abc)、已处理抗体％和已处理抗体的量。初步实验显示亲本抗体m9346a和hufr57的处理是相似的。因此，仅一种亲本抗体(m9346a)用于进一步实验。
[0673]
两种双互补位形式(kih和四价)均显示与亲本抗体相比增加的量的已处理抗体
(图7c和图7d)。有趣的是，两种双互补位形式的改进的递送/处理机制是不同的。kih双互补位抗体具有较高abc和与单特异性亲本抗体相似的内化效率(图7a-7d)，而morrison氏四价抗体显示改进的内化效率和可与亲本抗体相当的abc值(图7c和图7d)。就两种双互补位形式来说，降解的抗体的量是相似的(图7e和图7f)。
[0674]
实施例3.制备双互补位frα靶向免疫缀合物
[0675]
制备fr57scfv-humov19-磺基-spdb-dm4缀合物
[0676]
根据比尔定律分别使用在280、343和412nm下的uv/vis吸光度值和消光系数计算fr57scfv-humov19、磺基-spdb和dm4的摩尔浓度。通过使接头在50mm磷酸钾缓冲液、50mm氯化钠和2mm edta(ph 7.5)中与25mm dtt反应并且测量在343nm下的硫吡啶释放来测定接头浓度。通过使dm4在50mm磷酸钾缓冲液、50mm氯化钠和2mm edta(ph 7.5)中与10mm dtnb[5,5-二硫双-(2-硝基苯甲酸)]反应并且测量在412nm下的吸光度来测定药物浓度。
[0677]
在抗体缀合之前，通过在25℃下在30％水溶液[15mm磷酸钾(ph 7.6)和70％有机物[(n-n-二甲基乙酰胺、dma、safc)]中使1.5mm磺基-spdb与1.95mm dm4反应持续90min来制备磺基-spdb-dm4原位混合物。在缀合反应期间，使2.5mg/ml抗体溶液在25℃下在具有10％dma(v/v)的15mm磷酸钾ph 7.6中与相对抗体8至8.5倍摩尔过量的磺基-spdb-dm4反应持续15-20小时。使用akta上的sephadex 25脱盐柱将所述反应纯化至10mm乙酸盐、9％蔗糖、0.01％tween 20(ph 5.0)配制缓冲液中并且经由具有0.22μm pvdf膜的注射器式过滤器过滤。
[0678]
如下文所述来测定缀合至抗体的dm4的摩尔比率(dar)和未缀合的类美登素物质的百分比。通过uv-vis发现纯化的缀合物具有3.4mol dm4/mol抗体，通过sec发现具有99.8％单体，并且通过hplc hisep柱分析发现具有低于2％的游离药物。
[0679]
通过测量在252和280nm下的uv/vis吸光度并且使用说明各组分的作用的二项方程计算ab浓度和dm4浓度来测定dar。从经由hisep柱(25cm
×
4.6mm，5μm)分析的样品中观察到的所得峰面积计算存在于最终fr57scfv-humov19-磺基-spdb-dm4缀合物样品中的未结合的类美登素的量。使用以下方程来计算存在于所述缀合物样品中的游离类美登素百分比(fm％)：游离类美登素％＝(归因于dm4的逆相pa 252)/(归因于dm4的逆相pa 252 归因于dm4的流通pa 252)
×
100％。
[0680]
制备杵臼(kih)-fr57scfv-humov19-磺基-spdb-dm4缀合物
[0681]
在抗体缀合之前，通过在25℃下在30％水溶液[15mm磷酸钾(ph 7.6)和70％有机物[(n-n-二甲基乙酰胺、dma、safc)]中使1.5mm磺基-spdb与1.95mm dm4反应持续90min来制备磺基-spdb-dm4原位混合物。在缀合反应期间，使3.0mg/ml抗体溶液在25℃下在具有11％dma(v/v)的15mm磷酸钾ph 7.6中与相对抗体10倍摩尔过量的磺基-spdb-dm4反应持续15-20小时。使用nap脱盐柱将所述反应两次纯化至10mm丁二酸盐、250mm甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％tween 20(ph 5.5)配制缓冲液中并且经由具有0.22μm pvdf膜的注射器式过滤器过滤。通过uv-vis发现纯化的缀合物具有2.9mol dm4/mol抗体，通过sec发现具有90.6％单体，并且通过hplc hisep柱分析发现具有低于1％的游离药物。
[0682]
制备fr57scfv-humov19-dm21缀合物
[0683]
根据比尔定律分别使用在280、343和412nm下的uv/vis吸光度值和消光系数计算fr57scfv-humov19、磺基-gmbs和dm21的摩尔浓度。通过使接头在50mm磷酸钾缓冲液、50mm
氯化钠和2mm edta(ph 7.5)中与25mm dtt中的50mm dtt反应并且测量在343nm下的硫吡啶释放来测定接头浓度。通过使dm21在50mm磷酸钾缓冲液、50mm氯化钠和2mm edta(ph 7.5)中与10mm dtnb[5,5-二硫双-(2-硝基苯甲酸)]反应并且测量在412nm下的吸光度来测定药物浓度
[0684]
在缀合之前，通过使1.5mm磺基-gmbs分别在60/40(v/v)dma和丁二酸盐缓冲液ph 5.0中与1.95mm dm21反应来制备磺基-gmbs-dm21原位混合物。在具有10％dma(v/v)的60mm 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(epps)ph 8.0中用相对2.5mg/ml的抗体6.5接头过量的磺基-gmbs-dm21进行所述缀合。在25℃下孵育20-22小时之后，使用nap脱盐柱将所述反应纯化至10mm丁二酸盐、250mm甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％tween 20(ph 5.5)中并且经由0.22μm pvdf膜过滤器过滤。
[0685]
如下文所述来测定缀合至抗体的dm21的摩尔比率(dar)和未缀合的类美登素物质的百分比。通过uv-vis发现纯化的缀合物具有3.7mol dm21/mol抗体，通过sec发现具有98％单体，并且通过hplc hisep柱分析发现具有低于2％的游离药物。
[0686]
通过测量在252和280nm下的uv/vis吸光度并且使用说明各组分的作用的二项方程计算ab浓度和dm21浓度来测定缀合至抗体的dm21的摩尔比率(dar)。从经由hisep柱(25cm
×
4.6mm，5μm)分析的样品中观察到的所得峰面积计算存在于最终fr57scfv-humov19-gmbs-dm21l缀合物样品中的未结合的类美登素的量。使用以下方程来计算存在于缀合物样品中的游离类美登素百分比(fm％)：游离类美登素％＝(归因于dm21的逆相pa 252)/(归因于dm21的逆相pa 252 归因于dm21的流通pa 252)
×
100％。
[0687]
制备-杵臼(kih)-fr57scfv-humov19-gmbs-dm21l缀合物
[0688]
在缀合过程期间使用较低浓度的所述原位混合物中的药物和接头以及较低抗体浓度来制备初始批次的kih-fr57scfv-humov19-gmbs-dm21l。简单说来，在缀合之前，通过使1.5mm磺基-gmbs分别在60/40(v/v)dma和丁二酸盐缓冲液ph 5.0中与1.95mm dm21反应来制备磺基-gmbs-dm21原位混合物。在具有10％dma(v/v)的60mm 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(epps)ph 8.0中用相对2.5mg/ml的抗体7.5接头过量的磺基-gmbs-dm21进行所述缀合。在25℃下孵育20-22小时之后，使用nap脱盐柱将所述反应两次纯化至10mm丁二酸盐、250mm甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％tween 20(ph 5.5)中并且经由0.22μm pvdf膜过滤器过滤。通过uv-vis发现纯化的缀合物具有3.1mol dm21/mol抗体，通过sec发现具有99.1％单体，并且通过hplc hisep柱分析发现具有低于2％的游离药物。
[0689]
在缀合过程期间使用较高浓度的所述原位混合物中的药物和接头以及较高抗体浓度来制备稍后批次的用于药物动力学和功效研究的kih-fr57scfv-humov19-gmbs-dm21l。简单说来，在缀合之前，通过使3mm磺基-gmbs分别在60/40(v/v)dma和丁二酸盐缓冲液ph 5.0中与3.9mm dm21反应来制备磺基-gmbs-dm21原位混合物。在具有10％dma(v/v)的60mm 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(epps)ph 8.0中用相对5.7-6mg/ml的抗体6.5-7接头过量的磺基-gmbs-dm21进行所述缀合。在25℃下孵育20-22小时之后，使用akta上的sephadex-25脱盐柱将所述反应纯化至10mm丁二酸盐、250mm甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％tween 20(ph 5.5)中并且经由0.22μm pvdf膜过滤器过滤。通过uv-vis发现纯化的缀合物具有3.1mol dm21/mol抗体，通过sec发现具有98.7％单体，并且通过hplc hisep柱分析发现具有低于2％的游离药物。
dm4缀合物在2.5mg/kg剂量下具活性，具有26％t/c，并且在5mg/kg剂量下具高度活性，具有3％t/c。2.5mg/kg剂量具有25天t-c、lck 0.98(无活性)并且无衰退。就5mg/kg组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。然而，所述组中存在4/6pr、3/6cr和3/6tfs。在接种后第13天的最低点处，所有研究组中均存在2-5％的最少体重损失。这项研究的结果指示，四价adc形式不提供相对亲本缀合物的活性改进。
[0701]
表14.
[0702]
组(s-spdb-dm4)ab剂量(mg/kg)t/c％(d27)prcr结果四价2.513％2/60/6活性四价511％2/62/6活性m2.526％0/60/6活性m53％4/63/6高度活性
[0703]
四价双互补位adc在携带igrov-1人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0704]
在体内使用igrov-1异种移植物模型来评估四价双互补位抗体形式对免疫缀合物治疗功效的影响。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝8)并且随后在接种后第11天给药。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、100μg/kg的四价-s-spdb-dm4和100μg/kg的m-s-spdb-dm4。为了说明四价缀合物归因于四价抗体与亲本抗体之间的分子量差异(即，50kda差异)而可能用药不足，在这项研究和所有进一步研究中通过有效载荷标准化剂量。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第81天终止所述研究。如上文子章节(“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”)中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0705]
所述研究的结果显示于图9和表15中。四价-s-spdb-dm4和亲本m-s-spdb-dm4缀合物在100μg/kg下均具活性，分别具有21％和15％t/c。就任一组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。四价缀合物具有2/8pr、1/8cr和0/8tfs，而m-s-spdb-dm4具有3/8pr、1/8cr和0/8tfs。所述研究中的大多数组中存在最少重量损失，其中例外为100μg/kg四价adc，其在接种后第14天的最低点处具有8％体重损失。另外，这项研究的结果指示，四价adc形式不提供相对亲本缀合物的活性改进。
[0706]
表15.
[0707]
组(s-spdb-dm4)dm剂量(μg/kg)t/c％(d31)prcr结果四价10021％2/81/8活性m10015％3/81/8活性
[0708]
kih双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0709]
在体内使用ov-90异种移植物模型来评估kih双互补位抗体形式对免疫缀合物治疗功效的影响。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝6)并且随后在接种后第7天给药。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、40、20和10μg/kg的kih-s-spdb-dm4和20μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第80天终止所述研究。如子章节“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0710]
所述研究的结果显示于图10和表16中。kih-s-spdb-dm4缀合物在40μg/kg下具高度活性，在20μg/kg下具活性并且在10μg/kg下无活性，分别具有6％、12％和83％t/c。40μg/kg剂量组具有29天t-c、lck 1.84(活性)、3/6pr、2/6cr和0/6tfs。20μg/kg剂量组具有38天t-c、lck 1.32(活性)并且无衰退。10μg/kg剂量组具有2天t-c、lck 0.09(无活性)并且无衰退。亲本m-s-spdb-dm4缀合物在20μg/kg下无活性，具有81％t/c并且无衰退。就这组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。这项研究中未观察到体重损失。与用四价缀合物执行的研究形成对照，kih-s-spdb-dm4显示与m-s-spdb-dm4相比明显更具活性。基于这些研究的结果，相对四价形式选择kih形式用于进一步评估。
[0711]
表16.
[0712][0713]
实施例5.缀合于dm21的杵臼双互补位抗体的体外活性
[0714]
缀合于dm21的杵臼双互补位抗体的体外细胞毒性
[0715]
根据实施例4所述的方案(“双互补位免疫缀合物的体外细胞毒性”)，在多种细胞系中评估缀合于dm21的kih双互补位抗体的体外细胞毒性。在早期研究中，两种亲本dm21缀合物(m-dm21和hufr57-dm21)的活性显示极相似(图11)。在所有进一步研究中，使kih-dm21活性与亲本m抗体的缀合物(m-s-spdb-dm4和m-dm21)进行比较以评估双互补位形式和dm21有效载荷对kih-dm21的总体细胞毒性的作用。
[0716]
与两种亲本缀合物相比，kih-dm21针对所测试的五种细胞系中的三者(igrov-1、t47d和jhos-4)明显更具活性。(图12a-12e。)另外，具有dm21接头/有效载荷的两种缀合物(kih-dm21和m-dm21)针对jeg-3细胞具相似活性，而m-s-spdb-dm4缀合物证明针对这一细胞系具较少活性。展现最高frα表达水平的唯一细胞系(kb)对所有三种缀合物同样敏感。因此，这些结果显示相对于亲本抗体的缀合物(m-s-spdb-dm4和m-dm21)，kih-dm21针对大多数所测试的细胞系展现增加的活性。
[0717]
另外，使用3h-抗体来比较kih-dm21和亲本单特异性抗体的结合、内化和处理。在具有中等(jhos-4)和高(kb)frα表达的肿瘤细胞中，kih-dm21分别加强抗体结合事件和处理达100％和170％。
[0718]
缀合于dm21的杵臼双互补位抗体的旁观者杀死活性
[0719]
在体外使用多种细胞系来评估kih-dm21杀死混合细胞培养物中的frα-细胞的能力。与其他体外细胞毒性实验一致，亲本抗体缀合物m-dm21和m-s-spdb-dm4用作对照。使靶阳性细胞(kb、igrov-1、jeg-3或t47d)和靶阴性细胞namalwa/luc(即，表达荧光素酶的namalwa细胞)的混合培养物暴露于0.5nm所述缀合物。当单独孵育细胞时，这一缀合物浓度对靶阴性细胞无毒。接着测试混合培养物中多种百分比的靶阳性细胞(9％至50％)。在5天暴露之后，根据制造商的方案通过one glo(promega)测定所述混合物中的靶阴性细胞的细胞增生的抑制作用。
[0720]
表17
[0721][0722]
在所测试的所有混合培养物中，kih-dm21具有最高旁观者活性，随后为m-dm21。m-s-spdb-dm4是最少活性缀合物，如图13a-13d和表17所示。
[0723]
总之，这些数据指示与缀合于dm21的亲本抗体或s-spdb-dm4相对，与dm21接头/有效载荷组合的kih双互补位形式引起增加的体外功效。
[0724]
实施例6.kih双互补位免疫缀合物的体内功效
[0725]
kih双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0726]
在具有低frα表达(h-分数为30)的ov-90异种移植物模型中评估kih-dm21的体内功效并且与kih-s-spdb-dm4进行比较。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝6)并且随后在接种后第7天给药。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、40、20和10μg/kg的kih-s-spdb-dm4、40、20和10μg/kg的kih-dm21、20μg/kg的m-dm21和20μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第80天终止所述研究。如实施例4子章节“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0727]
所述研究的结果显示于图14a-14b和表18中。kih-s-spdb-dm440μg/kg剂量组具有29天t-c、lck 1.84(活性)、3/6pr、2/6cr和0/6tfs。20μg/kg剂量组具有38天t-c、lck 1.32(活性)并且无衰退。10μg/kg剂量组具有2天t-c、lck 0.09(无活性)并且无衰退。亲本m-s-spdb-dm4缀合物在20μg/kg下无活性，具有81％t/c并且无衰退。就这组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。kih-dm21缀合物在所有剂量下均具高度活性，就40μg/kg剂量来说具有1％t/c，就20μg/kg剂量来说具有7％t/c并且就10μg/kg剂量来说具有9％t/c。40μg/kg剂量具有53天t-c、lck2.49(活性)、5/6pr、5/6cr和3/6tfs。20μg/kg剂量具有42天t-c、lck 1.98(活性)、3/6pr、2/6cr和1/6tfs。10μg/kg剂量具有2/6pr和0/6cr。就这组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。m-dm21缀合物在20μg/kg下具活性，具有22％t/c、30天t-c、lck 1.41(活性)并且无衰退。这项研究中未观察到体重损失。总之，在这项研究中，dm21缀合物比呈亲本和kih双互补位形式的s-spdb-dm4缀合物更具活性。另外，在相同接头/有效载荷形式内的匹配的20μg/kg剂量下，双互补位kih缀合物比其亲本配对物更具活性。基于这些结果，选择kih-dm21用于另外的异种移植物模型中的评估。
[0728]
表18.
[0729][0730]
kih双互补位adc在携带ishikawa人子宫内膜腺癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0731]
在具有中等frα表达(h-分数为100)的ishikawa异种移植物模型中评估缀合于dm21的kih双互补位抗体的体内功效。
[0732]
根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝6)并且随后在接种后第11天给药。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、100、50和25μg/kg的kih-dm21、100和50μg/kg的m-dm21和100μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第90天终止所述研究。如实施例4子章节“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0733]
所述研究的结果显示于图15和表19中。kih-dm21缀合物在100和50μg/kg下具高度活性，但在25μg/kg下无活性，分别具有0％、9％和78％t/c。100μg/kg剂量具有》63天的t-c、》3.33的lck(高度活性)、6/6pr、5/6cr和4/6tfs。50μg/kg剂量具有3/6pr和0/6cr。就这组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。25μg/kg剂量具有2天t-c、lck 0.11(无活性)并且无衰退。m-dm21缀合物在130μg/kg下具高度活性并且在70μg/kg下具活性，分别具有0％和11％t/c。130μg/kg剂量具有》63天的t-c、》3.33的lck(高度活性)、6/6pr、6/6cr和0/6tfs。50μg/kg剂量具有27天t-c、lck 1.43(活性)、4/6pr、2/6cr和0/6tfs。m-s-spdb-dm4缀合物在100μg/kg剂量下具高度活性，具有1％t/c、6/6pr和3/6cr。就这组来说，归因于低肿瘤体积下的坏死可能无法测定t-c和lck。在所述研究中的所有组中均存在1-5％之间的最少体重损失。总之，当以100μg/kg给药时，与亲本缀合物m-dm21和m-s-spdb-dm4相比，kih-dm21明显更具活性。尽管所有三种缀合物均在100μg/kg下具高度活性，kih双互补位adc的反应持续时间比亲本抗体缀合物长得多。
[0734]
表19.
[0735][0736]
kih双互补位adc在携带igrov-1人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0737]
在具有中等frα表达(h-分数为140)的igrov-1异种移植物模型中评估缀合于dm21的kih双互补位抗体的体内功效。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝8)并且随后在接种后第10天给药。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、100和50μg/kg的kih-dm21、130和70μg/kg的m-dm21和100和50μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第120天终止所述研究。如实施例4子章节“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”中所述来测定肿瘤测量和计算
[0738]
所述研究的结果显示于图16和表20中。kih-dm21缀合物在100和50μg/kg下均具活性，分别具有19％和12％t/c。100μg/kg剂量具有》99天的t-c、》2.87的lck(高度活性)、7/8pr、6/8cr和0/8tfs。50μg/kg剂量具有53天t-c、lck 1.53(活性)、5/8pr、3/8cr和0/8tfs。m-dm21缀合物在130和70μg/kg下均具活性，分别具有13％和16％t/c。130μg/kg剂量具有》99天的t-c、》2.87的lck(高度活性)、8/8pr、7/8cr和2/8tfs。70μg/kg剂量具有36天t-c、lck 1.04(活性)、3/8pr、2/8cr和0/8tfs。m-s-spdb-dm4缀合物在100和50μg/kg剂量下均具活性，分别具有17％和34％t/c。100μg/kg剂量具有23天t-c、lck 0.67(无活性)、3/8pr、2/8cr和0/8tfs。50μg/kg剂量具有17天t-c、lck 0.49(无活性)并且无衰退。在接种后第16天的最低点处，大多数组中存在1-5％的最少体重损失，其中例外是在50μg/kg下的m-dm21(6％)和在50μg/kg下的m-s-spdb-dm4(7％)。总之，与dm21缀合物相比，亲本m-s-spdb-dm4缀合物展现较少体内功效。另外，在所测试的两种剂量下，kih-dm21和亲本m-dm21具相似活性。
[0739]
表20.
[0740][0741]
kih双互补位adc在携带kb人子宫颈癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活
性
[0742]
在具有高frα表达(h-分数为300)的kb异种移植物模型中评估缀合于dm21的kih双互补位抗体的体内功效。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝6)并且随后在接种后第6天给药，此时肿瘤达到约100mm3。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、50和25μg/kg的kih-dm21、50和25μg/kg的m-dm21和50和25μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的以上化合物。在接种后第120天终止所述研究。如实施例4子章节“四价双互补位adc在携带ov-90人卵巢癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性”中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0743]
所述研究的结果显示于图17和表21中。kih-dm21缀合物在50和25μg/kg下具高度活性，就两种剂量来说，具有0％t/c、》100天的t-c和》6.41的lck(高度活性)。100μg/kg剂量具有6/6pr、6/6cr和6/6tfs，而25μg/kg剂量具有6/6pr、5/6cr和5/6tfs。m-dm21缀合物在50μg/kg和25μg/kg下均具高度活性，分别具有0％和2％t/c。两种剂量具有》100天的t-c和》6.41的lck(高度活性)。50μg/kg剂量具有6/6pr、6/6cr和6/6tfs，而25μg/kg剂量具有5/6pr、4/6cr和4/6tfs。m-s-spdb-dm4缀合物在50和25μg/kg下均具高度活性，分别具有0％和8％t/c。50μg/kg剂量具有》100天的t-c、》6.41的lck(高度活性)、6/6pr、6/6cr和5/6tfs。25μg/kg剂量具有24天t-c、lck 1.54(活性)、3/6pr、1/6cr和1/6tfs。在接种后第8天的最低点处，m-dm21和m-s-spdb-dm4组中可见2-4％的最少体重损失。总之，25μg/kg的m-s-spdb-dm4的反应是短暂的，而50μg/kg的m-s-spdb-dm4的施用在大多数小鼠中引起长期持续的完全衰退。在25μg/kg和50μg/kg剂量下的m-dm21和kih-dm21的施用在大多数小鼠中引起长期持续的完全衰退。
[0744]
总之，此处所述的体内功效研究指示kih-dm21在所测试的大多数异种移植物模型中是最具活性的缀合物，随后为m-dm21和m-s-spdb-dm4。
[0745]
表21.
[0746][0747]
kih双互补位adc在携带imgn853抗性kb人子宫颈癌异种移植物的scid小鼠中的体内抗肿瘤活性
[0748]
在imgn853抗性kb异种移植物模型中评估缀合于dm21的kih双互补位抗体的体内功效。使亲本kb细胞在1nm dm1-me存在下生长。在建立稳定生长的培养物之后，对细胞进行次克隆并且使克隆生长，表征并且冷冻。选择次克隆6a用于这项研究并且对小鼠进行皮下接种。根据肿瘤体积将小鼠随机化至各组中(每组n＝6)并且随后在接种后第5天给药，此时肿瘤达到约100mm3。所述组包括服用配制缓冲液的对照组、40和20μg/kg的kih-l-dm21、40和20μg/kg的m-l-dm21和40和20μg/kg的m-s-spdb-dm4。对所有小鼠施用单一静脉内剂量的
以上化合物。在接种后第78天终止所述研究。如以上ov-90人卵巢癌异种移植物实验中所述来测定肿瘤测量和计算。
[0749]
所述研究的结果显示于图19和表22中。kih-l-dm21缀合物在40和20μg/kg下均具高度活性，具有0％t/c。40μg/kg剂量组具有》60天的t-c、》3.41的lck(高度活性)、6/6pr、6/6cr和6/6tfs。20μg/kg剂量组具有46天t-c、lck 2.61(活性)、6/6pr、4/6cr和1/6tfs。m-l-dm21缀合物在40μg/kg和20μg/kg下均具高度活性，分别具有0％和2％t/c。40μg/kg剂量组具有》60天的t-c、》3.41的lck(高度活性)、6/6pr、6/6cr和6/6tfs。20μg/kg剂量组具有28天t-c、lck 1.59(活性)、5/6pr、2/6cr和2/6tfs。m-s-spdb-dm4缀合物在40μg/kg下具高度活性，但在20μg/kg下无活性，分别具有0％和63％t/c。40μg/kg剂量具有41天t-c、lck 2.33(活性)、6/6pr、6/6cr和0/6tfs。20μg/kg剂量具有6天t-c、lck 0.34(无活性)、0/6pr、0/6cr和0/6tfs。kih-l-dm21 20μg/kg组中可见最少体重损失，在接种后第8天的最低点处损失3％。总之，在这一模型中，kih-l-dm21与m-l-dm21可相当地有效并且kih-l-dm21和m-l-dm21均比m-s-spdb-dm4更有效。
[0750]
表22.
[0751][0752]
实施例7.双互补位免疫缀合物药物动力学和耐受性
[0753]
在食蟹猴中在单剂量之后评估双互补位frα靶向性免疫缀合物的毒性和毒物动力学概况。简单说来，以10或13mg/kg的剂量水平呈10分钟缓慢推注形式将kih-dm21施用于两只雄性猴/剂量水平。观察所述动物至给药后28天以评估任何效应的恢复、持续或进展。评估体重、临床观察结果和食物消耗，并且针对临床病理学参数(血液学、血清化学和凝血)和毒物动力学参数收集血样。
[0754]
所有动物均存活直至研究结束。不存在对体重、血液学或血清化学参数的kih-dm21相关影响。在单一10ab mg/kg组动物中注意到的kih-dm21相关临床观察结果是在第8和12天后肢变红，关于非给药时期的剩余部分未注意到临床发现。在两个剂量组中，在第4和8天注意到kih l dm21相关较高纤维蛋白原值。截至非给药时期结束(第29天)，值与预治疗值相似。
[0755]
kih-dm21 adc在单一静脉内施用于猴之后显示两相药物动力学。adc的平均末期t1/2在10mg/kg剂量下为156小时。总抗体(tab)的平均t1/2比关于adc所观察到的平均t1/2长(在10mg/kg剂量下184小时)。adc和tab浓度时间概况的比较指示，kih-dm21免疫缀合物在10mg/kg剂量下比imgn853更稳定。在10mg/kg剂量下，与imgn853相比，kih-dm21具有更长末期半衰期和更大暴露度量(auc∞值)。
[0756]
表23.
[0757][0758]
如图18a和图18b所示，frα双互补位免疫缀合物和imgn853在10和mg/kg下均被充分耐受，并且所述双互补位免疫缀合物在13mg/kg下同样被充分耐受。另外，如表23所示，frα双互补位免疫缀合物在10mg/kg剂量下比imgn853更稳定。具体说来，所述双互补位免疫缀合物展现比imgn853长约60小时的末期半衰期和比imgn853高约40％的总暴露。