用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子的制作方法

1.本发明涉及纳米材料技术领域，特别涉及一种用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子。


背景技术：

2.光疗是一种新兴的局部治疗策略，包括光动力治疗(photodynamic therapy,pdt)和光热治疗(photothermal therapy,ptt)，与传统化疗手段相比是侵入性最小的治疗方法之一。pdt可以产生活性氧(ros)，有效诱导癌细胞凋亡和坏死，显然，pdt过程是依赖氧的。相比之下，ptt不依赖氧，可以通过激光诱导产生的高热杀死肿瘤细胞。近年来，诸多研究表明pdt和ptt联合治疗可产生强大的协同效果，并将治疗过程中的副作用降到最低。然而，整合pdt和ptt的协同效应通常需要两种不同吸收波长的光敏剂，这极大增加了操作复杂性，降低了治疗效果。因此，开发新型光动力联合光热治疗的方法很有必要。
3.卟啉和卟啉衍生物具有高效的光动力和光热转换特性，通常作为光敏剂用于癌症光疗。然而，由于卟啉类化合物水溶性低、近红外吸收差、无靶向性等缺点，极大限制了其临床应用。因此，需要开发新的以卟啉为基础的体系从而达到高效的光疗效果。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子，该锌卟啉纳米粒子呈六方核-壳型，其核为锌卟啉、壳为二氧化硅，该壳上充满精密的介孔结构，同时壳上的介孔又赋予粒子出色的载药能力。该锌卟啉纳米粒子在特定波长的光照下能有效产生单线态氧并将光子转化为热能。
6.优选的是，该用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子通过以下方法制备得到：
7.1)制备锌卟啉纳米粒子mpsns的前体物质pre-mpsns：
8.将四苯基卟啉锌溶解在盐酸水溶液中，室温下搅拌得到混合物；将该混合物加入到含ctab和naoh的水溶液中，并在室温下持续搅拌，收集产物，记为mpsns的前体物质pre-mpsns；
9.2)制备锌卟啉纳米粒子mpsns：
10.将ctab溶解于超纯水中得到ctab溶液，将步骤1)得到的产物pre-mpsns加入到ctab溶液中，然后超声分散均匀，搅拌，向溶液中注入四乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，再注入氨水，持续搅拌，最后离心得到锌卟啉硅纳米粒子mpsns。
11.优选的是，该用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子通过以下方法制备得到：
12.1)制备锌卟啉纳米粒子mpsns的前体物质pre-mpsns：
13.将5mg四苯基卟啉锌溶解在1ml的浓度为0.5mm/l的盐酸水溶液中，室温下搅拌1h得到混合物；将该混合物加入到10ml含10mm ctab和2.5mm naoh的水溶液中，并在室温下持续搅拌24h，收集产物，记为mpsns的前体物质pre-mpsns；
14.2)制备锌卟啉纳米粒子mpsns：
15.将50mg ctab溶解于10ml超纯水中得到ctab溶液，将步骤1)得到的产物pre-mpsns加入到ctab溶液中，然后超声处理30min使分散均匀，置于40℃下搅拌，然后向溶液中注入0.05ml四乙氧基硅烷和0.01ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，再注入0.01ml氨水，持续搅拌1h，最后离心得到锌卟啉硅纳米粒子mpsns。
16.优选的是，所述锌卟啉硅纳米粒子上还修饰有叶酸。
17.优选的是，所述锌卟啉硅纳米粒子上修饰叶酸的方法为：将步骤2)制得的锌卟啉硅纳米粒子加入到edc或nhs水溶液中并进行超声处理，然后再加入叶酸peg羧基，反应，最后离心收集反应产物，得到修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子。
18.优选的是，所述锌卟啉硅纳米粒子上修饰叶酸的方法为：将步骤2)制得的锌卟啉硅纳米粒子加入到edc或nhs水溶液中并进行超声处理，然后再加入叶酸peg羧基，反应12小时，最后离心收集反应产物，得到修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子。
19.优选的是，所述锌卟啉硅纳米粒子上还负载有药物。
20.优选的是，在所述锌卟啉硅纳米粒子上负载药物的方法为：
21.先制备药物溶液，将锌卟啉硅纳米粒子或修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子悬浮在去离子水中制备成纳米粒子溶液，然后将制备好的药物溶液加入到纳米粒子溶液中，室温下搅拌，离心得到负载有药物的锌卟啉硅纳米粒子。
22.优选的是，所述药物为r837。
23.优选的是，在所述锌卟啉硅纳米粒子上负载r837的方法为：
24.将r837溶于醋酸中得到1mg/ml的r837水溶液，将10mg的修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子悬浮在10ml去离子水中制备成纳米粒子溶液，然后将r837水溶液加入到纳米粒子溶液中，室温下搅拌48h，离心得到负载有药物的锌卟啉硅纳米粒子。
25.本发明的有益效果是：本发明提供的用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子具有以锌卟啉为核、以二氧化硅的六方核-壳型结构，在特定波长的光照下能有效产生单线态氧并将光子转化为热能，同时壳上的介孔又赋予粒子出色的载药能力，通过本发明的粒子负载药物，能够实现pdt和ptt的联合治疗；本发明的一些实施例中，通过该粒子负载免疫佐剂r837，能实现癌症的pdt和ptt联合治疗，同时r837能促进树突细胞成熟，为光治疗联合免疫治疗带来新的思路。
附图说明
26.图1为本发明的实施例1制得的锌卟啉硅纳米粒子的透射电镜照片；
27.图2为本发明的实施例1制得的锌卟啉硅纳米粒子的元素分析图；
28.图3为本发明的纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图；
29.图4为本发明的纳米粒子荧光发射光谱；
30.图5为本发明的锌卟啉硅纳米粒子mpsns@r837上的r837在不同ph下的释放测量实验结果；
31.图6为本发明的mpsns水溶液和纯水在光照下的温度变化曲线；
32.图7为本发明的光照下mpsns单线态氧的生成的测量结果；
33.图8为本发明的细胞毒性实验结果；
34.图9为r837、r837加光照(r837( ))、mpsns@r837、mpsns@r837加光照(mpsns@r837( ))对细胞的杀伤效果；
35.图10为4t1细胞经不同处理后，树突细胞的成熟情况。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
37.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
38.实施例1
39.本实施例的一种用于肿瘤光热光动力联合治疗的锌卟啉纳米粒子，其通过以下方法制备得到：
40.1)制备锌卟啉纳米粒子mpsns的前体物质pre-mpsns：
41.将5mg四苯基卟啉锌(znp)溶解在1ml的浓度为0.5mm/l的盐酸水溶液中，室温下搅拌1h得到混合物；将该混合物缓慢加入到10ml含10mm ctab(十六烷基三甲基溴化铵)和2.5mm naoh的水溶液中，并在室温下持续搅拌24h，收集产物，记为mpsns的前体物质pre-mpsns；
42.2)制备锌卟啉纳米粒子mpsns：
43.将50mg ctab溶解于10ml超纯水中得到ctab溶液，将步骤1)得到的产物pre-mpsns加入到ctab溶液中，然后超声处理30min使分散均匀，将得到混合溶液置于40℃下搅拌，然后向混合溶液中注入0.05ml四乙氧基硅烷(teos)和0.01ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aps)，再注入0.01ml氨水，持续搅拌1h，最后离心得到带有氨基的核壳状的锌卟啉硅纳米粒子mpsns。
44.参照图1，为本实施例制得的锌卟啉硅纳米粒子的透射电镜照片，从图中可以看出，该纳米粒子呈六方体核-壳状结构，粒径约为200nm，壳的厚度约为30nm，且壳上有精密的介孔结构。
45.参照图2，为本实施例制得的锌卟啉硅纳米粒子mpsns的元素分析图，其中图2(a)为mapping图像，图2(b)eds图谱；mapping图像表征了主要元素的分布(c、n、o、zn和si)(图a)，与eds结果一致(图b)。
46.实施例2
47.作为实施例1的基础上的进一步改进，本实施例中，所述锌卟啉硅纳米粒子上还修饰有叶酸，从而可提高该粒子的生物相容性和靶向性。
48.本实施例中，用经典的edc/nhs方法在锌卟啉硅纳米粒子表面修饰叶酸，具体方法为：将实施例1制得的锌卟啉硅纳米粒子加入到edc或nhs水溶液中并进行超声处理，然后再加入叶酸peg羧基，反应12小时，最后离心收集反应产物，得到修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子mpsns。以下图3-10中的mpsns均为修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子。
49.实施例3
50.作为实施例2的基础上的进一步改进，本实施例中，所述锌卟啉硅纳米粒子上还负载有药物r837。
51.本实施例中，负载r837的方法为：
52.将r837溶于稀醋酸中得到1mg/ml的r837水溶液，将10mg实施例2制得的修饰有叶酸的锌卟啉硅纳米粒子悬浮在10ml去离子水中制备成纳米粒子溶液，然后将r837水溶液加入到纳米粒子溶液中，室温下搅拌48h，离心得到负载有药物的锌卟啉硅纳米粒子mpsns@r837。
53.实施例4
54.对实施例2(mpsns)和实施例3(mpsns@r837)制得的纳米粒子进行性能测试。
55.参照图3，为纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图，从该纳米粒子的紫外吸收光谱可以看出，znp在425nm处有典型的soret带。而mpsns和mpsns@r837除了420nm处的soret带，在500nm和625nm处有两个强q带。此外，r837在该波段没有明显的紫外吸收。
56.参照图4，为纳米粒子荧光发射光谱(a)激发波长：450nm；(b)激发波长：650nm；该荧光发射光谱表明，在450nm激发下，znp，mpsns和mpsns@r837均有较强的荧光发射，在625nm和675nm处有多个发射峰，不仅如此，在650nm的激发下，mpsns和mpsns@r837在820nm处表现出强烈的荧光发射，而znp几乎没有荧光，这是由于znp聚集引起的发射。
57.参照图5，为锌卟啉硅纳米粒子mpsns@r837上的r837在不同ph下的释放测量实验结果，可以看出，在ph为5.0时，r837释放速度较快(20h时释放率约48.5％)，超过20h后释放约率达到58.6％,然而，在ph为7.4时释放率不到20％。说明mpsns@r837有高效的ph响应性药物释放能力，在酸性条件下(ph＝5.0)r837能高效释放。
58.释放测量实验的方法为：将2ml实施例3制得的mpsns@r837溶液(1mg/ml)分别加入不同ph值(ph 7.4或ph 5.0)的透析袋中，在37℃下搅拌，紫外吸收光谱法检测r837的释放量。
59.参照图6，为mpsns水溶液和纯水在光照下的温度变化曲线，可以看出，在光照(650nm，0.6w/cm2)600s后，mpsns的温度从14.7℃(环境温度)升高至50.2℃，而纯水的温度变化可以忽略不计，证明mpsns具有出色的光热转换能力，光热转换率为43.8％。
60.参照图7，为光照下mpsns单线态氧的生成的测量结果，本实施例中，用单线态氧荧光探针(sosg)测定了mpsns在光照下(650nm，0.6w/cm2)产生ros的能力，从结果可以看出，与纯水相比，mpsns和mpsns@r837表现出明显的sosg荧光增强，证明它们能高效产生ros。
61.参照图8，为细胞毒性实验结果，其中测量了mpsns与4t1细胞共孵育24h、48h后的细胞存活率，可以看出，不同浓度的mpsns(0-200ug/ml)与4t1细胞共孵育24h甚至48h，均未产生明显的细胞毒性，证明该粒子有良好的生物相容性。
62.参照图9，为r837、r837加光照(r837( ))、mpsns@r837、mpsns@r837加光照(mpsns@r837( ))对细胞的杀伤效果，可以看出，mpsns@r837和游离r837均能适度抑制4t1细胞的生长，证明免疫佐剂r837既能诱导树突细胞成熟，又能在一定程度上杀死癌细胞。显然，mpsns@r837( )在r837浓度较低时杀伤效率最高，说明激光诱导的ptt和pdt联合r837治疗可显著提高抗肿瘤效果。
63.参照图10，为4t1细胞经不同处理后，树突细胞的成熟情况；其中(a)transwell系
统设计，4t1细胞置于上腔室，树突细胞置于下腔室；(b)用流式细胞仪检测不同处理后树突细胞(cd11c cd80 cd86 )的表达水平；(c)树突细胞成熟百分比；(d)树突细胞悬液中il-12和tnf-α的分泌。本实施例中，用transwell系统研究了mpsns@r837中r837在体外对树突细胞成熟的影响。4t1细胞(不同处理后)和树突细胞分别培养于上室和下室，用流式细胞仪检测树突细胞的成熟，用elisa检测相关细胞因子(il-12,tnf-α)的分泌。从图10可以看出，在mpsns@r837( )组，树突细胞(cd11 cd80 cd86 )的表达量远高于其他组，说明受损的肿瘤细胞与免疫佐剂r837能有效促进树突细胞成熟；此外，细胞因子的分泌水平(il-12和tnf-α)与树突细胞成熟结果一致，以上结果表明mpsns@r837联合光照可高效增强免疫应答。
64.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。