经历出血的处于抗血小板药物治疗下的患者的治疗的制作方法

经历出血的处于抗血小板药物治疗下的患者的治疗
发明领域
1.本发明总体上涉及使用调节人血小板活化和凝集的药剂治疗处于抗血小板药物治疗下的患者。特别是在手术期间/之后经历出血并发症的患者。此外，本发明涉及用于这样的用途的血小板内皮受体1(pear1)激动剂，诸如天然岩藻聚糖，合成的模拟岩藻聚糖的糖聚合物，诸如硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物或硫酸葡聚糖。


背景技术：

2.人血小板，也通俗地称为血小板，作为血管完整性的哨兵在血管中巡逻。血小板通过粘附至受损的血管壁、凝集、凝血的传播和血栓形成(后者也称为“血凝块”)而在生理止血中起到关键作用。另外，血小板随后还参与纤维蛋白溶解(血栓的分解)和血管壁的修复，从而恢复血流和血管完整性。
3.在病理生理情况(诸如动脉粥样硬化)下，动脉粥样硬化斑块的破裂会导致不适当的血小板凝集和血栓形成，这可能导致血管闭塞，从而导致急性心肌梗死(ami)或卒中，根据世界卫生组织(who)，它们是世界范围内的主要死因。
4.简单地说，血栓的形成涉及两个主要组成部分：活化的血小板和可溶的血液成分(后者被称为“凝血因子”)，并且其整体形成“凝血级联”。除了释放自分泌反馈介质(诸如血栓素a2(txa2)和二磷酸腺苷(adp))和建立松散的纤维蛋白原桥接凝集体以外，活化的血小板还将其外膜的组成和电荷变为所谓的“促凝表面”。凝血因子与该表面结合并且转化为其活性形式，最终将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而将松散的血小板凝集体转变为稳定的血栓。
5.在这方面，抗血栓形成药物分成两大组药物。一组是抗凝剂，靶向凝血级联的组分，诸如肝素或维生素k拮抗剂。另一组是抗血小板药物，直接干扰血小板的初始活化。因此，抗凝剂允许血小板凝集但是阻碍凝血，而抗血小板药物阻碍初始血小板活化和凝集，并且由此类似地阻碍凝血。抗凝剂主要用于显示出可能导致未来血栓形成事件的临床适应症的患者。相比之下，抗血小板药物立即以高剂量施用至经历ami或卒中的患者。从这样的事件中幸存下来的患者必须经常接受抗血小板药物的终生治疗，以防止这样的危及生命的并发症的复发。沿着这条路线，干扰txa2合成和信号传导的药物(诸如阿司匹林)与adp的p2y12受体的拮抗剂(诸如氯吡格雷(clopidogrel)、坎格雷洛(cangrelor)或替格瑞洛(ticagrelor))的组合代表了治疗急性事件及其复发的当今双重抗血小板疗法(dapt)的“金标准”。如果这样的患者需要可以提前计划的手术或牙科作业，则目前优选的做法是控制性暂时停药。然而，当处于抗血小板药物治疗下的患者急需即时/急性手术时，出血并发症是不可避免的。
6.然而，在极少数情况下，患者可能因为所显示的症状和这样的事件的相对较高的发生率而被误诊为经历ami或卒中，并且将因此立即施用超高剂量的速效p2y12受体拮抗剂，诸如氯吡格雷、坎格雷洛或替格瑞洛。当患者随后被诊断为经历例如急性主动脉夹层(ad)而不是ami或卒中时，立即手术是不可避免的。选择的手术方法是将主动脉分开并且缝
入外科插入移植物。在主动脉和移植物之间的连接部位以及缝合处，由于缺乏血小板凝集、凝血和栓塞形成，出血延长，这是初始接受超高剂量p2y12受体拮抗剂的直接结果。
7.目前，在上述情况下不存在有效止血的解决方案。现有产品是局部止血剂、封闭剂和粘合剂。止血剂可以凝结血液。封闭剂可以产生封闭屏障。粘合剂将组织粘合在一起。胶原蛋白、明胶和纤维素是止血剂。是和h的发展。tachocomb由马胶原蛋白、牛凝血酶、牛抑肽酶和人纤维蛋白原制成。然而，这些产品均不能有效解决由p2y12受体阻断或dapt药物引起的手术期间的出血并发症。
8.解决在急性手术期间由p2y12受体拮抗药物或dapt引起的并发症的方法或产品的缺乏往往导致患者可能不得不在数天内忍受开放的胸部伤口并且接受大量输血，这两者都承担了额外的严重感染风险，直到出血停止以及外科医生可以闭合伤口之前。
9.因此，需要应对处于抗血小板药物治疗下的患者(尤其是急需立即手术的那些患者)中的出血并发症的治疗策略


技术实现要素：

10.因此，本发明优选地试图单独地或以任何组合的方式减轻、缓和或消除本领域中的以上确认的缺陷和缺点中的一个或多个，并且通过提供用于治疗患者(其中患者处于抗血小板药物治疗下)中的出血的血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂来解决至少上述问题。
11.还提供了在手术期间局部施用的局部止血剂、封闭剂或粘合剂，其中局部止血剂、封闭剂或粘合剂包括血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂，以用于处于抗血小板药物治疗下的患者中的出血。
12.附图简述
13.通过参考附图，从根据本发明的实施方案的以下描述，本发明能够实现的这些和其他方面、特征和优点将变得显而易见并得到阐明，其中：
14.图1a是急性主动脉夹层(ad)的图示，显示了主动脉的内层和中层的分离，b是主动脉的图示，其将膨胀程度与受影响的组织联系起来，并且c是开放式胸降主动脉置换术，其中主动脉被分开并且缝入外科涤纶插入移植物，
15.图2显示了原始轨迹，其例示了人血小板凝集的两个阶段(上部轨迹)以及来自致密颗粒的分泌adp(下部轨迹)和通过p2y12受体信号传导的自分泌作用对血小板凝集的第二和不可逆阶段的影响，
16.图3显示了未经预处理的(对照)血小板以及用有效tpα受体拮抗剂ici192,605和广泛体外施用的p2y12受体拮抗剂ar-c 66096预处理的血小板在血浆中的光透射方面的原始凝集轨迹，其中用胶原蛋白以及模拟凝血酶的sfllrn(它们都是已知的生理血小板激动剂)以及合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(平均单体单元为34个岩藻糖分子(c34))、来自墨角藻(f.vesiculosus，fv)的天然岩藻聚糖或硫酸葡聚糖(dxs)刺激。
17.图4显示了在血浆中人血小板的根据光透射的凝集程度。(a)显示了在ar-c66096(作为公知且接受的体外p2y12受体拮抗剂)的存在下所有施用的激动剂(如图3)在血浆中血小板凝集的实验结果。(b)显示了在ici192,506(有效的tpα受体拮抗剂)的存在下所有施用的激动剂的血小板凝集的实验结果。(c)显示了在ar-c 66096和ici 192,506二者的存在
下上述激动剂的血小板凝集的实验结果。在光透射方面，血小板凝集被记录20分钟。n＝5实验的数据表示为平均值
±
s.e.m.，并且通过单向anova和随后的bonferroni多重比较检验进行统计分析；对于图4a-c：**p≤.01，***p≤.001，ns＝不显著。
18.图5显示了由单体链长为329个单体(c329)、34个单体(c34)和13个单体(c13)的合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物的浓度增加诱导的分离血小板的凝集(在光透射方面)。
具体实施方式
19.以下描述集中于适用于接受抗血小板药物治疗的患者的治疗策略的本发明的实施方案。特别是治疗在手术期间/之后遭受出血并发症的患者。
20.在生理性原发性止血的过程中，血小板立即粘附至血管损伤部位处的裸露的内皮下膜，活化，并且释放自分泌介质诸如血栓素a2(txa2)和二磷酸腺苷(adp)，使得纤维蛋白原受体整合素αiibβ3的构象变为活化状态，并且最终凝集形成纤维蛋白原桥接的栓塞。对于txa2，血栓素/前列腺素类受体-α(tpα)是血小板的主要同工型，并且与凝血酶的受体(par-1和par-4)一样，与gα12/13和gαq偶联。对于adp，已在血小板上鉴定出gαq偶联的p2y1受体和gαi2偶联的p2y12受体。已知通过gαi的β/γ亚基的信号传导与颗粒分泌的放大以及整合素αiiaβ3的活化(称为
‘
由内向外(inside-out)’信号传导)有关，而α亚基下调腺苷酸环化酶(ac)水平并且由此下调环磷酸腺苷(camp)水平，所有这些对于充分和持续的血小板活化和凝集都至关重要。
21.由生理激动剂诱导的人血小板凝集(如图2所示)以两个阶段为特征。第一阶段由初级激动剂本身诱导，并且如果刺激太弱而无法引发自分泌反馈介质(如adp)从致密颗粒的释放，则由于纤维蛋白原受体整合素αiiaβ3的失活而是可逆的。当初级刺激的强度足以诱导adp分泌时，adp通过p2y12受体信号传导的自分泌作用放大和增强血小板反应，包括整合素αiiaβ3的活化，导致血小板凝集的第二和不可逆阶段。
22.尽管初级血小板激动剂在不同程度上的诱导血小板活化和凝集取决于中间txa2生成和自分泌信号传导，但是迄今为止所有已知的生理血小板激动剂，无论其初始信号传导级联如何使用，关键取决于adp释放和随后的p2y12信号传导。例如阿司匹林对txa2/tpα信号传导和例如替格瑞洛对adp/p2y12信号传导的组合抑制代表了当今抗血栓形成疗法的“黄金标准”。大多数(如果不是全部)的经历ami或卒中的患者处于该双重抗血小板治疗方案(dapt)下，以防止血栓形成事件的复发。
23.因此，对于处于抗血小板疗法下的患者，可能出现血小板凝集的第一阶段，但是如图2所示，该第一阶段是可逆的。其效果如图3所示，其中双重血小板抑制(阻断tpα/txa2和p2y12/adp受体)仅允许血小板凝集的第一但可逆的阶段，其响应于胶原蛋白以及模拟凝血酶和par-1活化的六肽sfllrn。
24.在接受抗血小板药物的患者中，血小板凝集被阻止或逆转。当这些患者需要即时或急性手术时，不同程度的出血并发症是不可避免的。
25.岩藻聚糖，即来自天然来源的具有不同链长的多硫酸化岩藻糖多糖，迄今已被建议用于临床环境，以具有凝血前或抗凝特性，这取决于报告或陈述的观察结果。然而，分子水平上的精确作用模式一直难以捉摸。在wo 2008103234中，建议可以将纯化的岩藻聚糖用
作抗凝剂，用于具有血栓形成前病况如深静脉血栓形成、动脉血栓形成和其他心血管疾病的患者。
26.岩藻聚糖对血小板活化和凝集的作用远未得到开发。先前已经报道了从墨角藻中分离的天然岩藻聚糖通过c型凝集素样受体2(clec-2)诱导人和鼠血小板活化和凝集。在与本公开相关的研究中，这些发现无法重现，并且血小板内皮受体1(pear1)反而被鉴定为主要受体，其通过天然岩藻聚糖以及合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物引发人血小板活化和凝集[1]。在确定pear-1的参与之前，已显示合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物是人血小板活化和凝集的有效激动剂[2,3]。然而，据报道pear1同样被硫酸葡聚糖活化；后者因此被包括在与本公开相关的研究中作为pear1诱导的信号传导的阳性对照。在kauskot等人[4]中，pear1细胞外结构域蛋白(缩写为pear1-ec)显示出以浓度依赖性方式诱导洗涤(分离)的人血小板的凝集，然而并未指出pear1-ec的可能临床应用。
[0027]
沿着这条路线，人类和其他物种中的pear1的内源性配体仍有待阐明。
[0028]
关于上述和图2所示的血小板凝集的两个阶段，观察到天然岩藻聚糖(来自墨角藻)和合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(链长为34个单体(c34))诱导了血浆中血小板凝集的“经典”双阶段过程。当用硫酸葡聚糖刺激血小板时观察到类似的轨迹(图3)。
[0029]
另外，在干扰txa2/tpα和adp/p2y12信号传导(双重抑制)的受体拮抗剂的存在下，已观察到各种程度的由胶原蛋白以及模拟凝血酶的par-1活化的六肽sfllrn引起的初级和可逆血小板凝集，并且如所预期的，缺乏第二和不可逆阶段。
[0030]
形成鲜明对照并且最值得注意的是，如本文中公开的，显示了天然岩藻聚糖(来自墨角藻)、合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(链长为34个单体(c34))以及硫酸葡聚糖引发血小板凝集的第一阶段，令我们十分惊讶的是这在tpα和p2y12拮抗剂二者(双重抑制；dapt)的存在下仍然是不可逆和持续的。
[0031]
在图4中总结了数据，其表明在不同程度上阻止了p2y12受体信号传导(图4a)、tpα受体信号传导(图4b)或二者(图4c)，但是明显和显著地阻止了由胶原蛋白或者模拟凝血酶的par-1激动剂sfllrn诱导的持续的血浆中的人血小板凝集。相比之下，尽管单抑制或双重抑制同样显著地阻止了响应于合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(链长为34个单体(c34))、天然岩藻聚糖(来自墨角藻)以及硫酸葡聚糖的第二波血小板凝集，由后三种化合物引发的第一波血小板凝集在评估持续时间(20分钟)内保持不可逆和持续，并且与由胶原蛋白或sfllrn引起的相比，凝集程度显著更高(除了硫酸葡聚糖，其可以通过相对较少的重复次数(n＝5)来解释)。
[0032]
换言之，发现pear1受体激动剂似乎能够诱导血浆中人血小板的大约半最大和持续的凝集，尽管阻断了p2y12受体信号传导、tpα受体信号传导或p2y12和tpα受体信号传导二者(双重抑制；双重抗血小板疗法；dapt)。
[0033]
因此，发现对于接受单或双抗血小板药物的患者，使用血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂(在本文中岩藻聚糖、合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物和硫酸葡聚糖)可以导致大约半最大和持续的血小板凝集。重要的是，对于接受抗血小板疗法的患者，血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂治疗将由此与使出血并发症减少和最小化直接相关。
[0034]
在一个实施方案中，血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂用于治疗患者中的出血，其中患者处于抗血小板药物治疗下。
[0035]
因此，血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂提供了一种可行的治疗选择，以在单或双抗血小板治疗方案下应对大量患者中的出血并发症。
[0036]
这样的治疗通常在出血点处施用以进行局部作用，诸如通过在创伤或出血点处局部施用血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂。
[0037]
在一个实施方案中，施用是局部施用。
[0038]
在一个实施方案中，施用是在创伤或出血点处的局部施用。
[0039]
对于较大的损伤，优选对损伤程度进行评估，以为最佳的损伤治疗提供信息。在严重出血情况下，施用血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂可以与其他止血措施结合，诸如缝合或暂时使用止血带。
[0040]
存在几种不同的抗血小板药物，诸如乙酰水杨酸(阿司匹林)、非甾体抗炎药(nsaid)、双嘧达莫、p2y12二磷酸腺苷(adp)受体拮抗剂和整合素αiibβ3功能抑制剂。例如阿司匹林对txa2/tpα信号传导和例如替格瑞洛对adp/p2y12信号传导的组合抑制是标准抗血栓形成疗法。
[0041]
在一个实施方案中，抗血小板药物或抗血小板疗法包括一种或多种抑制txa2合成和/或作为tpα受体拮抗剂的药物，和/或一种或多种作为adp受体抑制剂和/或作为p2y12受体拮抗剂的药物。
[0042]
在一个实施方案中，抗血小板药物或抗血小板疗法包括一种或多种选自乙酰水杨酸、三氟柳(triflusal)和特鲁曲班(terutroban)的药物和/或一种或多种选自噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷、坎格雷洛、普拉格雷(prasugrel)、依利格雷(elinogrel)和替格瑞洛的药物。
[0043]
处于这样的药物治疗下的患者群体广泛，并且包括卒中患者、患有心脏病的患者和进行过外科手术的患者。
[0044]
在一个实施方案中，患者患有或已经患有选自由以下组成的组的病况：伴有或不伴有心房纤颤的卒中、心脏手术、心脏瓣膜的假体置换、冠心病(诸如稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和心脏病发作)，具有冠状动脉支架、外周血管疾病/外周动脉疾病和心尖/心室/附壁血栓、冠状动脉疾病、心脏病发作、支架或冠状动脉旁路移植手术(cabg)的患者。
[0045]
抗血小板治疗变得越来越有效，并且现代抗血小板疗法可以在施用后长达72小时内保持其效果。虽然这对于在终身治疗下的患者来说在便利性方面是一个明显的优势，但是如果患者需要计划外的立即手术，这代表了一个重大风险。
[0046]
在患者处于抗血小板疗法的手术期间或之后能够止血是至关重要的，并且特别是当患者已经接受了高预防剂量的抗血小板药物，诸如在72、48、24、12、诸如6、5、4、3、2或1小时内。这样的出血并发症包括接受连续的单或双抗血小板药物并且需要立即手术或牙科作业的患者。
[0047]
在一个实施方案中，出血是急性出血。
[0048]
在一个实施方案中，出血由外科手术引起。
[0049]
在一个实施方案中，抗血小板药物或抗血小板疗法已在72、48、24、12、6、5、4、3、2或1小时内施用至患者。
[0050]
这样的患者群体的一个具体实例与急性主动脉夹层(ad)相关，这是主动脉内层撕裂的灾难性表现。血液从真腔通过撕裂进入假腔，导致主动脉的内层和中层分离(剖开)，如
可以在图1a和1b中看到。
[0051]
夹层越深，气胀发展得越深，受灌注不良影响的组织就越多(图1b)。这种血液供应不足实际上解释了几种与ami或卒中类似的症状。
[0052]
14.229名个体的基于瑞典人口的研究(包括高尸检率)显示ad的发病率为3.4例/100.000人/年。包括未报告病例的估计数量，国际急性主动脉夹层登记处(international registry of acute aortic dissections，irad)分别评估了每100.000人的ad发病率(男性16人和女性7.9人)，平均发病年龄为63岁。相比之下，在这个年龄组中，在瑞典在100.000名居民中每年经历急性心肌梗死(ami)的发病率为大约400人。
[0053]
在这方面，ad的症状在很大程度上类似于严重血栓形成事件的那些症状，诸如ami或卒中，并且可以包括例如突然严重的胸部或上背部疼痛、呼吸短促、突然说话困难、丧失视力或者身体一侧的虚弱或麻痹。由于这些相似性和发病概率，当患者出现一种或多种上述症状而送至急救医院时，他们被立即施用高预防剂量的抗血小板药物，诸如氯吡格雷、坎格雷洛或替格瑞洛，其靶向血小板p2y12/adp受体。在一个实施方案中，抗血小板药物或抗血小板疗法包括施用药物氯吡格雷、坎格雷洛和/或替格瑞洛。
[0054]
在一个实施方案中，抗血小板药物或抗血小板疗法是双重抗血小板疗法(dapt)。这样的疗法可以是60-90mg替格瑞洛，每天两次，与70-100mg阿司匹林联合。
[0055]
当患者随后被诊断为经历ad而不是ami或卒中时，立即手术是不可避免的。通常，这需要开放式胸主动脉置换术，其中主动脉被分开并且缝入外科涤纶插入移植物。外科入路是通过胸部左侧的大切口。
[0056]
在主动脉和移植物之间的连接部位以及缝合处，由于缺乏血小板凝集，出血延长，这是初始接受超高剂量p2y12受体拮抗剂(诸如氯吡格雷、坎格雷洛或替格瑞洛)的直接结果。
[0057]
直到出血停止，患者可能需要输注多达30个血袋和/或在重症监护病房中打开胸腔长达两天。不管在经济方面，每次输血和打开胸腔的每一分钟都大大增加了严重感染的风险，增加了患者本已非常危急的情况。
[0058]
因此，对于在接受超高剂量的抗-p2y12血小板药物之后进行立即手术的急性主动脉夹层(ad)患者，使用血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂可以应对和停止出血并发症。
[0059]
在一个实施方案中，患者患有急性主动脉夹层(ad)。
[0060]
在一个实施方案中，患者已接受高剂量的p2y12受体拮抗剂，诸如180-480mg的替格瑞洛。
[0061]
在一个实施方案中，患者最初被误诊为经历ami或卒中，并且因此已接受高剂量的p2y12受体拮抗剂，诸如180-480mg的替格瑞洛。
[0062]
在一个实施方案中，血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂是多硫酸化多糖和/或硫酸化糖聚合物。如本技术中的数据所证明的，所有这些激动剂都引发血小板凝集。
[0063]
图3显示了硫酸化糖聚合物(硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物)、来自墨角藻的天然岩藻聚糖和硫酸葡聚糖的持续血小板凝集；接收的数据总结在图4中。对于所有这些血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂，尽管tpα/txa2信号传导、p2y12/adp信号传导得到抑制并且当这两种途径都被阻断(双重抗血小板疗法；dapt)时，清楚地看到不可逆的第一波血小板凝集。
[0064]
天然岩藻聚糖的化学组成因生态生理参数而十分不同。第一个结构是在1950年由从墨角藻提取的岩藻聚糖中阐明的。随后确定岩藻聚糖由50％-90％的l-岩藻糖、35％-45％的硫酸酯和少于8％的糖醛酸构成，具有基于o-4硫酸化l-岩藻糖和一些糖如半乳糖、甘露糖、木糖和葡萄糖的α(1
→
2)-糖苷键的线性主链。后来发表了来自墨角藻的商业岩藻聚糖的修订结构，表明它主要由α(1
→
3)-l-岩藻糖线性主链组成，具有在o-4处的硫酸酯取代以及在o-4或o-2处分支的一些α-l-岩藻糖。
[0065]
在一个实施方案中，多硫酸化多糖是岩藻聚糖和/或硫酸葡聚糖。
[0066]
在一个实施方案中，多硫酸化多糖是岩藻聚糖。
[0067]
在一个实施方案中，岩藻聚糖从褐藻或褐海藻中提取。
[0068]
在一个实施方案中，岩藻聚糖从墨角藻中提取。
[0069]
然而，天然岩藻聚糖的异质结构可能在这样的应用中造成问题。此外，纯化批次之间的硫酸化度可能不同，这可能与其效果直接相关。经过纯化，很难获得完全纯净的样品，并且这种潜在的批次多样性使得给药变得复杂。
[0070]
因此，认识到合成的模拟岩藻聚糖的糖聚合物(诸如硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物)可以呈现出若干优点。
[0071]
在一个实施方案中，多硫酸化糖聚合物是硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物。
[0072]
模拟岩藻聚糖的糖聚合物可以通过几种不同的方式合成，诸如通过氰氧基介导的自由基聚合、硫醇介导的链转移自由基聚合技术或raft聚合。在本发明中，发现raft聚合提供未支化的多糖链并且提供对聚合物链长的良好控制。
[0073]
在一个实施方案中，硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物包含侧链碳水化合物的未支化链。
[0074]
在本发明中，将非人和非动物来源的人工合成的硫酸化岩藻糖糖聚合物(模拟岩藻聚糖的硫酸化糖聚合物)与纯化的岩藻聚糖进行比较。发现合成的硫酸化糖聚合物引起与纯化的岩藻聚糖所观察到的相同的对血小板凝集的持续影响(图3，图4)。
[0075]
选择链长以在施用浓度下提供足够的生物活性，同时仍然足够短以确保合成均匀的部分。另外，链长似乎适合合成糖聚合物或将糖聚合物偶联至接头/衔接蛋白。
[0076]
如图5所示，分离的血小板由几种不同链长的模拟岩藻聚糖的硫酸化糖聚合物诱导。此处，13、34和329个单体(单糖单元)的链长都会引发分离的血小板的完全和持续的凝集(还参见[3])。所示的剂量反应曲线清楚地表明，人工合成的硫酸化岩藻糖糖聚合物的单体链长越短，引起相同程度的血小板凝集所需的浓度就越高。
[0077]
在一个实施方案中，侧链碳水化合物的未支化链含有至少10个单糖单元，诸如至少13个单糖单元。
[0078]
在一个实施方案中，侧链碳水化合物的未支化链含有10至500个单糖单元，诸如10至350个单糖单元，诸如13至329个单糖单元。
[0079]
在一个实施方案中，侧链碳水化合物的未支化链含有13、34或329个单糖单元。
[0080]
人工合成的硫酸化糖聚合物是硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链聚(甲基丙烯酰胺)。最终产物例示于下式1中：
[0081][0082]
在一个实施方案中，硫酸化糖聚合物具有通式1，其中r＝so3na。在一个另外的实施方案中，n＝10至500，诸如13至329，诸如13、34或329。
[0083]
在一个实施方案中，硫酸化糖聚合物是硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链聚(甲基丙烯酰胺)。
[0084]
为了提供模拟岩藻聚糖的硫酸化糖聚合物，所有糖聚合物都用硫酸酯进行o-硫酸化。在本发明中，高度硫酸化是优选的，诸如超过50％的硫酸化，诸如超过60％、超过70％、超过80％或超过90％的硫酸化度。
[0085]
在一个实施方案中，岩藻聚糖或硫酸化糖聚合物被硫酸化到至少50％、诸如至少60％、优选至少75％、诸如至少85％的程度。在一个实施方案中，岩藻聚糖或硫酸化糖聚合物被硫酸化到50％至100％、诸如75％至95％、诸如85％至90％的程度。
[0086]
合成的硫酸化糖聚合物具有若干优点。它们可以被高度纯化，并且可以控制长度以及硫酸化度。合成的糖聚合物的硫酸化度都超过75％，对于图5中的合成的糖聚合物，c34的硫酸化度高达87％，c13的硫酸化度高达89％，并且c329的硫酸化度高达87％。侧链碳水化合物链还简化了合成的模拟岩藻聚糖的糖聚合物的连接，并且提供了连接的模拟岩藻聚糖的糖聚合物的均匀填充物或层。
[0087]
硫酸化糖聚合物的近似平均分子量低于500 000g/mol，诸如低于300000g/mol。在一个实施方案中，硫酸化糖聚合物的近似平均分子量为3500至275000g/mol，诸如7000至180000g/mol。
[0088]
合成的模拟岩藻聚糖的硫酸化糖聚合物可以具有整合的化学官能团，诸如用于将合成的模拟岩藻聚糖的糖聚合物连接到表面或基质的接头。这些特征可能是用于链霉抗生物素蛋白亲和结合的生物素化，聚乙二醇化，以增加溶解度、延长稳定性并且降低免疫原性或化学交联等。
[0089]
葡聚糖是一种复杂的支化多缩葡萄糖(来源于葡萄糖缩合的多糖)。iupac将葡聚糖定义为“糖苷键主要为c-1
→
c-6的微生物来源的支化聚-α-d-葡糖苷”。葡聚糖链具有不同的长度(3至2000千道尔顿)。硫酸葡聚糖是含有大约13％至21％(诸如17％)的硫的葡聚糖(17％相当于大约2.3个硫酸酯基团/葡糖基残基)。硫酸葡聚糖是肝素类似物。
[0090]
在一个实施方案中，多硫酸化多糖是硫酸葡聚糖。
[0091]
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的近似平均分子量为250000g/mol以上，诸如250000至2000000g/mol，诸如500000g/mol以上，诸如500000至2000000g/mol。
[0092]
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的近似硫含量为13％至21％，诸如15％至19％，诸如17％。
[0093]
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的近似硫含量为大约1.8至2.8个、诸如2.0至2.6个、诸如2.3个硫酸酯基团/葡糖基残基。
[0094]
本发明中的血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂可以是任何合适的形式，包括粉末、凝胶、溶液或这些的任何组合。为了促进血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂的使用，它也可以是在手术期间使用的局部止血剂、封闭剂或粘合剂的形式。在急性主动脉夹层(ad)的具体实例中，这样的粉末、凝胶、溶液或者局部止血剂、封闭剂或粘合剂可以用于主动脉和移植物之间的连接部位处以及缝合处。
[0095]
局部止血剂、封闭剂和粘合剂在本领域中正常使用，即直至达到所需效果。然而，在本发明中，这些可以用于处于抗血小板药物治疗下的患者。
[0096]
在一个实施方案中，提供了一种局部止血剂、封闭剂或粘合剂，其中局部止血剂、封闭剂或粘合剂包含根据权利要求1至18中任一项所述的血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂，其用于治疗患者中的出血，其中患者处于抗血小板药物治疗下。
[0097]
在一个实施方案中，局部止血剂、封闭剂或粘合剂在治疗患者中的出血中使用，其中使用是局部使用。
[0098]
在一个实施方案中，局部止血剂、封闭剂或粘合剂在治疗患者中的出血中使用，其中使用是治疗手术期间的患者中的出血。
[0099]
在一个实施方案中，包含局部止血剂、封闭剂或粘合剂的医用贴剂用于治疗患者中的出血，其中患者处于抗血小板药物治疗下。
[0100]
在一个实施方案中，局部止血剂、封闭剂或粘合剂用于在手术期间局部施用，其中局部止血剂、封闭剂或粘合剂包含血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂，以用于治疗处于抗血小板药物治疗下的患者中的出血。在一个实施方案中，血小板内皮凝集受体1(pear1)激动剂是硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物、天然岩藻聚糖或硫酸葡聚糖，以用于治疗处于抗血小板药物治疗下的患者中的出血。在一个另外的实施方案中，医用贴剂包含局部止血剂、封闭剂或粘合剂。
[0101]
材料和方法
[0102]
化学品
[0103]
胶原蛋白从chrono-log(chrono-log corporation，havertown，pa，usa)获得，par1活化肽sfllrn由jpt peptide technologies(柏林，德国)定制合成。来自墨角藻(fucus vesiculosus)的岩藻聚糖(纯度95％)购自sigma aldrich sweden ab(斯德哥尔摩，瑞典)。平均单体单元为13、34或329个岩藻糖分子的合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物是林雪平大学(university，林雪平，瑞典)物理、化学和生物(ifm)/化学(kemi)系peter konradsson教授友好馈赠，并且如之前描述生成[2,3]。adp/p2y12受体拮抗剂ar-c 66096以及txa2/tpα受体拮抗剂ici 192,605购自tocris,uk。
[0104]
富血小板血浆(prp)和贫血小板血浆(ppp)的制备
[0105]
经县地区伦理委员会(dnr 2015/543)批准，通过静脉穿刺从健康志愿者中获得血液，并且吸入供应商预装了柠檬酸三钠溶液的10ml注射器中(sarstedt，n
ü
mbrecht，德国，订单号：02.1067.001)，这些志愿者否认在捐赠前两周服用过任何药物。将血液以220g离心20分钟。将由此获得的prp转移到新鲜的15ml聚丙烯管中，并且将剩余的血液以2200g离心20分钟以将ppp与剩余的血细胞分离。
[0106]
prp中的血小板凝集
[0107]
使用chrono-log发光凝集计(700型，chrono-log corporation，havertown，pa，usa)在37℃进行测量，其中使用最终体积为0.3ml的血小板悬浮液以900转/分钟进行搅拌。与单独的ppp(＝100％)相比，凝集表示为光透射百分比。
[0108]
血小板与载体或ar-c66096按指示预温育5分钟，随后用1μg/ml胶原蛋白、10μm sfllrn、30μg/ml c34、10μg/ml岩藻聚糖或30μg/ml硫酸葡聚糖(dxs)刺激(图4a)。
[0109]
血小板与载体或ici 192,506按指示预温育5分钟，随后用1μg/ml胶原蛋白、10μm sfllrn、30μg/ml c34、10μg/ml岩藻聚糖或30μg/ml硫酸葡聚糖(dxs)刺激(图4b)。
[0110]
血小板与载体或ar-c66096和ici 192,506按指示预温育5分钟，随后用1μg/ml胶原蛋白、10μm sfllrn、30μg/ml c34、10μg/ml岩藻聚糖或30μg/ml硫酸葡聚糖(dxs)刺激(图4c)。
[0111]
糖聚合物合成
[0112]
将2-甲基丙烯酰胺基乙基2,3,4-三-o-乙酰基-α-l-吡喃岩藻糖苷溶解在1,4-二噁烷(1.20m)中，并且添加cpbdt。将溶液转移到含有aibn和搅拌棒的管中，并且用n2(g)冲洗30分钟。将管密封，并且放入预热至90℃的油浴中。将溶液在90℃搅拌24小时，用1,4-二噁烷稀释，并且冷冻干燥。将粗制固体化合物通过悬浮在乙醚中进行纯化，离心，并且分离。该过程总共重复三次以产生过乙酰化二硫代苯甲酸酯封端糖聚合物，为粉红色粉末。然后将过乙酰化二硫代苯甲酸酯封端糖聚合物溶解在1,4-二噁烷(0.45ml/mmol单体单元)中。将溶液转移到具有磁力搅拌器和aibn(6.6当量/糖聚合物链)的管中。将管用n2(g)冲洗30分钟。将管密封，并且浸入预热至90℃的油浴中。将溶液搅拌过夜，用1,4-二噁烷稀释，并且冻干。将粗制过乙酰化糖聚合物悬浮在乙醚中，离心，并且分离，以产生过乙酰化糖聚合物，为白色粉末。该过程总共进行三次。将过乙酰化糖聚合物悬浮在甲醇(0.08ml/mmol单体单元)中，添加甲醇钠(1当量/摩尔单体单元)，并且在室温下搅拌过夜。将溶液用dowex marathon c(h )中和，过滤，并且蒸发溶剂。将粗制糖聚合物溶解在去离子水中，并且通过针对去离子水透析48小时进行纯化，其中经常更换去离子水。冻干得到糖聚合物，为白色松散粉末，即糖聚合物。
[0113]
为了提供模拟岩藻聚糖的糖聚合物,聚合物(2)通过以下反应硫酸化：通过剧烈搅拌，将糖聚合物溶解在dmf(0.01ml/mmol单体单元)中。添加三氧化硫-吡啶络合物(5当量/游离羟基)，并且将溶液在室温下搅拌44小时。将溶液倾析，并且将沉淀的粗制o-硫酸化糖聚合物溶解在0.9m nacl(水溶液)(90mmol nacl/mmol单体单元)中。将溶液在室温下搅拌46小时，并且针对0.1m nacl透析19小时，然后针对去离子水透析24小时，其中经常更换去离子水。将所得溶液冻干以得到o-硫酸化糖聚合物，为白色松散粉末。
[0114]
合成产生硫酸化度为87-89％的硫酸化聚合物。计算添加硫酸酯的效果，c13的近似平均分子量将为大约7260g/mol，c34的近似平均分子量将为大约16470g/mol，并且c239
的近似平均分子量将为大约178300g/mol。
[0115]
结果
[0116]
在图4a所示的结果中，评价干扰p2y12受体信号传导对由胶原蛋白、par-1活化肽sfllrn、合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(平均单体单元为34个岩藻糖分子(c34))、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖以及硫酸葡聚糖(dxs)诱导的血浆中人血小板凝集的影响。ar-c66096用作公知且接受的体外p2y12受体拮抗剂(一种最终发展为ar-c66931mx的前体)，其被更广泛地称为坎格雷洛，或商品名如所预期的，由胶原蛋白和sfllrn诱导的血小板凝集程度有效地降低，分别从85
±
2％到23
±
4％以及从91
±
3％到5
±
1％。由合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(c34：92
±
3％降至53
±
6％，p≤0.001)、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖(96
±
2％降至43
±
4％，p≤0.001)以及硫酸葡聚糖(dxs)(84
±
5％降至23
±
6％，p≤0.001)诱导的反应也明显和显著地受到ar-c66096的影响。然而，除了使用硫酸葡聚糖的实验以外，这些后面的反应的程度仍在所有设置中，显著高于在ar-c66096的存在下由胶原蛋白或sfllrn引发的那些。
[0117]
如图4b所示，我们接下来研究和评价了干扰txa2释放和随后的tpα受体信号传导对由胶原蛋白、par-1活化肽sfllrn、合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(平均单体单元为34个岩藻糖分子(c34))、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖以及硫酸葡聚糖(dxs)诱导的血浆中人血小板凝集的影响。我们采用ici 192,605(一种有效的tpα受体拮抗剂)而不是使用乙酰水杨酸(asa；阿司匹林)，以防止细胞间txa2合成。
[0118]
由胶原蛋白和sfllrn诱导的血小板凝集显著降低，分别从90
±
3％到21
±
4％以及从91
±
3％到15
±
6％。由合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(c34：91
±
3％降至45
±
7％，p≤0.001)、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖(96
±
2％降至44
±
4％，p≤0.001)以及硫酸葡聚糖(dxs)(88
±
6％降至39
±
7％，p≤0.001)诱导的反应以较低的程度但仍然显著地受到ici 192,605的影响。尽管如此，除了使用硫酸葡聚糖的实验以外，这些后面的反应的程度仍在我们的设置下，显著高于在ici 165,605的存在下由胶原蛋白或sfllrn引发的那些。
[0119]
在其中p2y12受体和tpα受体二者分别被ar-c66096和ici 192,605阻断的条件下，我们最终评价了由胶原蛋白、par-1活化肽sfllrn、合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(平均单体单元为34个岩藻糖分子(c34))、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖以及硫酸葡聚糖(dxs)引发的血浆中的人血小板凝集。血小板与载体或ar-c66096和ici 192,506按指示预温育5分钟，随后用1μg/ml胶原蛋白、10μm sfllrn、30μg/ml c34、10μg/ml来自墨角藻(fv)的岩藻聚糖或30μg/ml硫酸葡聚糖(dxs)刺激。结果总结于图4c中。由胶原蛋白和sfllrn引起的血小板凝集被明显抑制，分别从86
±
2％到11
±
2％以及从93
±
2％到3
±
1％。由合成的硫酸化α-l-岩藻糖苷侧链糖聚合物(c34：92
±
3％降至48
±
9％，p≤0.001)、来自墨角藻(fv)的天然岩藻聚糖(95
±
2％降至44
±
6％，p≤0.001)以及硫酸葡聚糖(dxs)(88
±
6％降至37
±
6％，p≤0.001)诱导的反应通过ar-c66096和ici192,605的双重血小板抑制而不太突出但仍然显著地降低。尽管如此，除了使用硫酸葡聚糖的一些以外，这些后面的反应的程度仍在我们的设置下，仍然显著高于在ar-c66096和ici 192,605的存在下由胶原蛋白或sfllrn引发的那些。
[0120]
尽管上面已经参考一个或多个特定实施方案描述了本发明，但是本发明不旨在限
于本文阐述的特定形式。而是，本发明仅由所附权利要求限制，并且除了上述具体实施方案以外的其他实施方案在这些所附权利要求的范围内是同样可能的(例如与上述那些不同)。
[0121]
在权利要求中，术语“包括/包含”不排除其他元件或步骤的存在。此外，尽管被单独列出，但是多个装置、元件或方法步骤可以通过例如单个单元或处理器实现。另外，尽管各个特征可以被包括在不同的权利要求中，但是可以将这些特征有利地组合，并且包括在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行和/或不利的。另外，单数指代不排除复数。术语“一个(a)”、“一种(an)”、“第一”、“第二”等不排除复数。权利要求中的附图标记仅作为说明性示例提供，并且不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。
[0122]
参考文献：
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[0124]
[2]m.tengdelius,c.j.lee,m.grenegard,m.griffith,p.pahlsson,p.konradsson,synthesis and biological evaluation of fucoidan-mimetic glycopolymers through cyanoxyl-mediated free-radical polymerization,biomacromolecules 15(7)(2014)2359-68,10.1021/bm5002312.
[0125]
[3]m.tengdelius,c.kardeby,k.falker,m.griffith,p.pahlsson,p.konradsson,m.grenegard,fucoidan-mimetic glycopolymers as tools for studying molecular and cellular responses in human blood platelets,macromol biosci 17(2)(2017),10.1002/mabi.201600257.
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