以神经激活为指标的成纤维细胞I型胶原产生促进剂的筛选方法、和包含神经激活剂的成纤维细胞I型胶原产生促进剂与流程

以神经激活为指标的成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选方法、和包含神经激活剂的成纤维细胞i型胶原产生促进剂
技术领域
1.本发明涉及胶原产生促进剂，具体涉及以神经激活为指标的成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选方法和包含神经激活剂的成纤维细胞i型胶原产生促进剂。


背景技术：

2.存在于皮肤的真皮的成纤维细胞产生胶原、弹性蛋白、透明质酸这样的成分。胶原是通过构成网眼结构而保持皮肤的弹力的不可或缺的成分。但是，如果由于老化、紫外线、压力等而胶原的产生量降低，则成为皮肤弹力降低、皱纹、松弛的原因。
3.提出了用于促进皮肤中的胶原产生的多个方法。可列举例如，胶原产生促进剂的施与。作为用于筛选胶原产生促进剂的方法，有以细胞内谷胱甘肽量为指标的方法(专利文献1)、为了检测前胶原的分泌而利用融合蛋白质的方法(专利文献2)等。要求探索促进成纤维细胞中的胶原产生的药剂的进一步的方法。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2006-151860号公报
7.专利文献2：国际公开第2016/152882号
8.专利文献3：日本特开2009-155227号公报
9.专利文献4：日本特开2006-241042号公报
10.非专利文献
11.非专利文献1：kumamoto et.al.,experimental dermatology,2014,23,58-77
12.非专利文献2：tsutsumi et.al.,experimental dermatology,2012,21,876-894
13.非专利文献3：zhang et.al.,plos one|https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212659
14.非专利文献4：sloniecka et.al.,plos one|https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134157
15.非专利文献5：liu et.al.,pain.2013october；154(10):2169-2177.doi:10.1016/j.pain.2013.06.043.


技术实现要素：

16.发明要解决的课题
17.本发明的目的是提供以新的作用机制作为指标的成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选方法。
18.用于解决课题的手段
19.本发明者们进行了深入研究，结果发现了感觉神经与成纤维细胞的相关性，发现了如果激活神经细胞或神经祖细胞，则成纤维细胞的i型胶原产生被促进。基于该知识，发
明了通过以神经激活作为指标从而能够筛选成纤维细胞i型胶原产生促进剂这样的新的筛选方法和成纤维细胞i型胶原产生促进剂。
20.本发明涉及以下发明：
21.[1]成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选方法，以神经激活作为指标。
[0022]
[2]根据项目1所述的方法，所述筛选方法包括：
[0023]
使感觉神经细胞与候选药剂接触而进行培养的工序，
[0024]
测定所述细胞的神经活性的工序，
[0025]
基于候选药剂的神经激活作用，选择成纤维细胞i型胶原产生促进剂的工序。
[0026]
[3]根据项目1或2所述的方法，所述神经激活通过感觉神经细胞内的细胞内阳离子浓度来测定。
[0027]
[4]根据项目1～3的任一项所述的筛选方法，所述神经激活通过激活躯体感觉神经受体来实现。
[0028]
[5]根据项目4所述的方法，所述躯体感觉神经受体是trpa1、trpm8和/或trpv1。
[0029]
[6]成纤维细胞i型胶原产生促进剂，包含神经激活剂。
[0030]
[7]根据项目6所述的成纤维细胞i型胶原产生促进剂，所述神经激活剂包含薰衣草油。
[0031]
发明的效果
[0032]
通过以神经激活作为指标，能够实现成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选。
附图说明
[0033]
图1通过以细胞内ca
2
浓度作为各时间点(t)的荧光强度(ft)，用以测量开始时间点的荧光强度(f0)作为1的比(ft/f0)显示，从而表示各trp受体的活性。横轴为时间，将添加薰衣草油和阳性对照的时间点作为箭头显示。实线显示添加薰衣草油、然后添加阳性对照的情况，虚线表示作为对照不用薰衣草油进行刺激、仅添加阳性对照的情况。
[0034]
图2：图2a显示ips细胞来源的感觉神经祖细胞。图2b将添加了ips细胞来源的感觉神经祖细胞的培养上清液时(条件培养基：右侧的柱)的i型胶原的mrna表达量，用不添加时(对照：左侧的柱)作为100％的相对值表示。误差棒表示平均值
±
sd，**表示通过非配对t检验而有统计学上的显著性差异(**p＜0.01)。
[0035]
图3：图3a表示将经试验物质(辣椒素:cap 0.25μm、肉桂醛:cnm125μm、薰衣草油:lo 0.005％)刺激的ips细胞来源的感觉神经祖细胞的培养基上清添加到成纤维细胞中的情况下的i型胶原的mrna表达量。图3b显示以上述试验物质成为相同浓度的方式直接加入成纤维细胞中的情况下的i型胶原的mrna表达量。各图中，胶原产生用以对照(不添加试验物质:对照)作为100％的相对值表示。误差棒表示平均值
±
sd，*表示通过非配对t检验而有统计学上的显著性差异(*p＜0.05)，n.s.表示无统计学上的显著性差异。
[0036]
图4表示将与图3b的情况相比为高浓度(4倍)的试验物质(辣椒素:cap 1μm、肉桂醛:cnm 500μm、薰衣草油:lo 0.02％)直接加入到成纤维细胞中的情况下的i型胶原的mrna表达量。胶原产生用以对照(不添加试验物质:对照)作为100％的相对值表示。误差棒表示平均值
±
sd，**表示通过非配对t检验而有统计学上的显著性差异(**p＜0.01)，n.s.表示无统计学上的显著性差异。
具体实施方式
[0037]
皮肤中存在感受温度、触觉、痛觉这样的刺激的各种受体，这些刺激被传达到背根神经节(drg：dorsal root ganglion)。对于皮肤已经报告了表皮细胞与感觉神经的相互作用(非专利文献1、2)，对于成纤维细胞与感觉神经的关系报告了参与创伤治愈(非专利文献3、4)。然而，正常的皮肤中的感觉神经与成纤维细胞的关系尚未被阐明。
[0038]
通过本发明者们的研究得知，成纤维细胞中的胶原产生通过神经激活而被促进，显示了通过神经激活能够筛选促进成纤维细胞中的i型胶原产生的药剂。
[0039]
本技术说明书中，神经激活是指激活感觉神经细胞。在本技术发明中，在神经激活的测定中使用的感觉神经细胞可以是将来自皮肤等感觉器官的感觉信息传递到中枢的传入神经的神经细胞，例如，背根神经节(以下称为drg)，也可以是其祖细胞，或者是人工地制成而使其介由trpa1、trpm8、和/或trpv1等所期望的神经受体而被激活的细胞，例如，将肾脏上皮细胞等基因导入细胞以表达上述受体的方式通过转染等而进行重组而得的细胞、由ips细胞制成的ips细胞来源的感觉神经细胞及其祖细胞。
[0040]
神经激活例如可以通过na

、k

、或ca
2
等阳离子向感觉神经细胞内的流入来测定。例如，如非专利文献5所记载的那样，在如果添加候选药剂则与添加前相比感觉神经细胞的细胞内ca
2
这样的阳离子增加的情况下，可以判断为有神经激活作用。在与添加了对照药剂时的神经激活作用相比，添加了候选药剂时的神经激活作用增加的情况下，可以确定候选药剂具有神经激活作用。阳离子浓度的增加可以是指在添加了候选药剂时增加例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、或500％以上。可以选择具有神经激活作用的候选药剂作为成纤维细胞i型胶原产生促进剂。对照的神经激活作用可以在仅不包含候选药剂的实验体系中预先确定，也可以同时进行实验而比较。或者，阳离子的流入虽然不限定，但也可以通过进行细胞内成像等来测定。
[0041]
感觉神经细胞的激活也可以通过激活drg或躯体感觉神经受体来实现。drg的激活也可以通过例如非专利文献1、2所述的方法测定。作为躯体感觉神经受体的例子，有感受温度等刺激的瞬时受体电位(transient receptor potential，trp)通道。trp通道是存在于细胞膜的6次跨膜型的离子通道，透过na

、k

、ca
2
等阳离子。在人中有trpv、trpm、trpa、trpp、trpml、trpc的6个亚家族。这些受体有时接受不同种类的刺激，例如，trpv1被高温、辣椒素激活，trpm8被低温、薄荷醇激活，trpa1被低温、肉桂醛激活。在本发明的一方式中，神经激活是激活trp通道，例如，激活皮肤中的trpa1、trpm8、和trpv1中的1个、2个或全部。
[0042]
作为本发明的成纤维细胞i型胶原产生促进剂的筛选方法的一例，可列举包括以下工序的方法：
[0043]
使感觉神经细胞与候选药剂接触而进行培养的工序，
[0044]
测定感觉神经细胞的神经活性的工序，
[0045]
基于候选药剂的神经活性作用，选择成纤维细胞i型胶原产生促进剂的工序。
[0046]
使感觉神经细胞与候选药剂接触的工序可以通过在包含感觉神经细胞的溶液中添加候选药剂，或者制备包含感觉神经细胞与候选药剂的溶液来进行。测定神经激活的工序如上所述例如可以通过na

、k

、或ca
2
等阳离子向感觉神经细胞内的流入来测定。
[0047]
本发明的方法可以进一步包含使利用候选药剂给与刺激而培养感觉神经细胞之
后的培养液与成纤维细胞接触，测定成纤维细胞的i型胶原产生的工序。
[0048]
成纤维细胞的i型胶原产生可以通过测定成纤维细胞中的i型胶原的mrna量或蛋白量来确定。作为mrna量的测定，可以使用pcr、rna印迹等本技术领域已知的方法来进行。例如，如实施例所记载的那样，可以通过使用i型胶原的引物进行定量的pcr来测定。对于蛋白质的量，可以使用蛋白质印迹、免疫染色、facs等本技术领域已知的任意的方法进行。例如，也可以使用与i型胶原特异性地结合的抗体。胶原产生可以将公知文献、例如专利文献1、2、非专利文献4等所述的方法直接或改变而使用。
[0049]
在本发明的其他方式中，本发明涉及包含神经激活剂或由神经激活剂组成的成纤维细胞i型胶原产生促进剂。神经激活剂可以使用在神经学及其他领域已知的神经激活剂。例如，获得有drg激活作用的物质、或者有trpa1、trpm8、和trpv1的任意1个、2个、或全部的激活作用的物质，筛选这些物质作为成纤维细胞i型胶原产生促进剂而进行开发。成纤维细胞i型胶原产生促进剂中的神经激活剂的比例是要不损害本发明的神经激活作用就不限定。本发明的成纤维细胞i型胶原产生促进剂可以以任意的施与途径使用，但从直接作用于皮肤的观点考虑，优选经皮施与。
[0050]
通过本发明的成纤维细胞i型胶原产生促进剂而由皮肤的成纤维细胞带来的胶原的产生被促进，从而可以期待皮肤弹力、屏障功能降低、皱纹、松弛这样的由胶原不足引起的问题的预防/改善。
[0051]
通过本发明筛选出的成纤维细胞i型胶原产生促进剂可以为了皮肤弹力的提高、皱纹、松弛的预防/改善等，而混配在功能性食品、化妆料、准药品、药品等组合物中。作为被混配的化妆品，可列举防晒、化妆水、美容液、美容霜、晒后修复水乳、防晒油等，但只要适合皮肤就可以混配于任意的化妆料。优选作为能够直接应用于皮肤的皮肤外用剂而混配。本发明的成纤维细胞i型胶原产生促进剂在不损害其效果的范围内，可以根据需要适当混配用于化妆品、药品等组合物的任意混配成分。作为所述任意混配成分，可列举例如，油分、表面活性剂、粉末、色料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、ph调节剂、中和剂等。例如，也可以包含促进胶原产生的其他药效成分等。
[0052]
在一实施方式中，本发明的神经激活剂或成纤维细胞i型胶原产生促进剂包含薰衣草油或由薰衣草油组成。本发明的神经激活剂、成纤维细胞i型胶原产生促进剂、或组合物中的薰衣草油的混配量只要不损害本发明的神经激活作用就不限定，可以任意设定成例如，0.0001～0.001重量％、0.001～0.005重量％、0.005～0.01重量％、0.01～0.02重量％、0.02～0.05重量％、0.05～0.1重量％、0.1～1.0重量％、1.0～10重量％、10～50重量％、50～100重量％等。
[0053]
薰衣草油已知对肌肤具有保湿、杀菌、抗炎症、和/或生物体组织修复促进作用等效果。另外，也报告了薰衣草油影响雌激素这样的女性荷尔蒙，该女性荷尔蒙影响成纤维细胞中的胶原产生(专利文献3、4)。但是，尚未报告薰衣草油介由神经激活而促进成纤维细胞中的胶原产生。
[0054]
实际上显示了，薰衣草油激活神经受体(图1)、施与了薰衣草油的神经祖细胞促进成纤维细胞胶原产生(图3a)。即，发现了通过薰衣草油等神经激活物质成纤维细胞胶原产生被促进。使薰衣草油等试验物质为高浓度不介由神经激活直接添加到成纤维细胞中胶原
产生也被促进(图4)。然而，即使在对成纤维细胞不能观察到直接作用这样的低浓度(图3b)下，也显示如果介由神经激活则成纤维细胞胶原产生被促进(图3a)，确认了成纤维细胞的胶原产生介由神经激活而被促进。
[0055]
本发明中使用薰衣草油是指将唇形科薰衣草属(lamiaceae lavandula)的植物体的花、叶、果皮、树皮、根、种子等干燥而通过水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂提取法等任意的方法获得的精油，可以使用狭叶薰衣草(lavandula vera，lavandula angustifolia)、宽叶薰衣草(lavandula latifolia)、宽窄叶杂交薰衣草(lavandula x intermedia)这样的任意的品种、亲缘种、杂交种。
[0056]
本说明书中所提及的全部文献其整体通过引用而纳入本说明书中。
[0057]
以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，并不限定本发明的技术的范围。本发明的技术的范围仅通过权利要求书的记载而限定。以不脱离本发明的宗旨为条件，可以进行本发明的变更，例如，本发明的构成要件的增加、削除和替换。
[0058]
实施例
[0059]
实施例1：神经激活物质的筛选
[0060]
通过以下的方法测定表达trpa1、trpm8、和trpv1的细胞的细胞内ca
2
浓度，从而进行神经激活物质的筛选。
[0061]
(1)表达trpa1、trpm8、和trpv1的细胞的制成
[0062]
(1-1)质粒dna
[0063]
编码人trp受体的质粒dna，通过使分别编码它们的核酸、与适合在各个宿主细胞中表达的载体通过周知的方法连接而得的。
[0064]
(1-2)对hek293细胞的质粒dna转染
[0065]
作为基因导入细胞，将作为通用细胞的人肾脏上皮细胞(human embryonic kidney cells；hek293、理研)在96孔的多聚d赖氨酸被覆聚苯乙烯板(corning社)上以10,000～20,000细胞/孔的密度接种(100μl/孔)。接种2～3小时后，使用lipofectamine
tm ltx(invitrogen,usa)，以各质粒10ng/孔、试剂(reagent)0.3μl/孔、ltx 0.3μl/孔进行制备(20μl/孔)。3小时后，用培养基洗涤2次，1～2天后，进行以下测定。
[0066]
(2)利用细胞内ca
2
高通量筛选的神经激活测定
[0067]
(2-1)筛选对象物质
[0068]
作为筛选对象物质，使用精油33品/植物提取物178品/化合物98品的合计309品的物质。对于包含薰衣草油的精油/提取物类使用以20％浓度溶解于dmso而在-20度保存的制备物，对于化合物使用以1％浓度溶解于水、乙醇、dmso中的合适溶剂之后在-20度保存的制备物。
[0069]
(2-2)细胞内ca
2
浓度的测定
[0070]
为了测定在(1)中制成的细胞中添加了在(2-1)中制成的各筛选对象物质的制备物的情况下的细胞内ca
2
浓度，使用细胞内钙浓度指示剂calcium kitii-fluo4(同仁化学)和fdss(functional drug screening system,浜松
ホトニクス
)测定荧光强度。作为阳性对照，使用从和光纯药工业购买的辣椒素(034-11351)、肉桂醛(031-03453)、l-薄荷醇(132-03752)。
[0071]
在测定开始起30秒后添加上述制备物，在测定开始起3分钟后进一步添加阳性对
照，5分钟终止测定。关于相对于细胞的最终浓度，使精油/提取物类为0.02％，使化合物为0.001％，此时的稀释使用biomek(beckman coulter)。
[0072]
结果示于图1。作为阳性对照的辣椒素、l-薄荷醇、肉桂醛分别仅激活trpv1、trpm8、trpa1(相当于图1的虚线箭头)。另一方面，309种的成分中薰衣草油激活全部这些受体(相当于图1的实线箭头)。
[0073]
实施例2：由感觉神经细胞产生的成纤维细胞的i型胶原产生促进作用
[0074]
(1)感觉神经细胞的培养
[0075]
按照制造商的说明书培养人ips细胞来源的感觉神经祖细胞(i-sns,ax0055,axol bioscience,cambridge,united kingdom)(图2a)。具体地，将这些细胞在经sure-bond xf(ax0053)涂覆的24孔板上铺板，用添加了25ng/ml gdnf、25ng/ml bdnf、10ng/ml ngf、和10ng/ml nt-3的sensory neuron maintenance medium(感觉神经元维持培养基，snmm,ax0060)进行培养。在将培养基一半量每隔3～4天进行交换的同时，培养5周，使其分化成感觉神经细胞。5周培养后，收集培养液获得上清。
[0076]
(2)利用感觉神经细胞给与了刺激的成纤维细胞中的i型胶原产生
[0077]
(2-1)利用感觉神经细胞的刺激
[0078]
作为成纤维细胞，分离知情同意后获得的新生儿包皮成纤维细胞，用含有10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(life technologies japan ltd.、东京、日本)在37℃、95％大气和5％co2的加湿气氛中使其增殖2天。将上述(1)的方法中得到的培养液的上清(300μl)与成纤维细胞的培养液以1:1的比例混合，培养4小时，通过下述(2-2)的方法测定胶原产生。作为对照，使用代替培养液的上清，将上述所示的ips细胞来源的感觉神经祖细胞用的培养基与成纤维细胞的培养液以1:1的比例混合而得的。
[0079]
(2-2)利用实时定量pcr测定i型胶原产生
[0080]
血清饥饿之后，由在神经细胞的培养基上清存在下或不存在下培养了4小时的成纤维细胞使用rneasy mini kit(250)(qiagen#74106)分离总rna。通过实时定量pcr，测定i型胶原的mrna表达量。具体地，使用taqman rna-to-c 1step kit(applied biosystems#4392938)、taqman探针和i型胶原α1的引物(hs00164004，taqman,applied biosystems)实施。作为内部对照使用β肌动蛋白(hs01060665)，表达量相对于β肌动蛋白归一化而求出。
[0081]
结果示于图2。在添加了神经细胞培养液的上清的情况下(条件培养基)，与不添加的对照(对照)相比，成纤维细胞的i型胶原的mrna表达量有意义地增加。由此提示，来源于神经细胞的成分具有促进成纤维细胞的胶原的产生的作用。
[0082]
实施例3：介由由各种物质的刺激带来的神经激活的胶原产生促进作用
[0083]
接着，为了确认在实施例1中判断为具有神经激活作用的物质介由神经激活而促进成纤维细胞的i型胶原的产生，测定介由或不介由经使浓度变化的各物质刺激的神经细胞的情况下的i型胶原产生。
[0084]
(1)试验物质
[0085]
使用从
フランスバイヤン
社购买的薰衣草油(将lavandula vera dc.的花进行水蒸气蒸馏而得的包含乙酸芳樟酯30％以上的精油)、以及从和光纯药工业购买的辣椒素(034-11351)、肉桂醛(031-03453)。
[0086]
(2)人ips细胞来源的感觉神经祖细胞的培养
[0087]
通过与实施例2相同的材料和方法回收培养5周以上的神经祖细胞的上清的总量(600μl)，将使上述(1)的试验物质成为在包含成纤维细胞的培养基中的最终浓度为0.25μm辣椒素、125μm肉桂醛、0.005％薰衣草油的方式添加而制备的培养基500μl再度加入神经祖细胞，在孵育器内静置15分钟。然后，回收包含试验物质的上清，加入dmem，以上清:dmem＝1:3的比例混合。在通过与实施例2同样的方法在12孔板中培养而得的成纤维细胞中应用上述混合物各1ml，静置4小时后回收rna。作为对照，制作将上述试验物质以最终浓度相同的0.25μm辣椒素、125μm肉桂醛、0.005％薰衣草油的方式制备而成的dmem，直接混合于成纤维细胞中，4小时静置后回收rna。对于回收rna与实施例2同样地进行利用实时定量pcr的i型胶原的测定。
[0088]
结果示于图3。如图3a所示，形成了经薰衣草油刺激的ips细胞来源的感觉神经祖细胞的培养上清促进成纤维细胞的i型胶原产生的结果。然而，如图3b那样，在不介由神经激活而将同浓度的薰衣草油直接添加到成纤维细胞的情况下，没有发现有意义的i型胶原产生的促进。
[0089]
实施例4：由高浓度的试验物质的直接添加产生的影响
[0090]
使用与实施例3的对象相比为高浓度的试验物质，调查由直接添加产生的影响。具体地，将实施例3的试验物质以最终浓度为4倍的1μm辣椒素、500μm肉桂醛、0.02％薰衣草油的方式添加，除此以外，通过与实施例3的对照实验相同的方法直接应用于成纤维细胞而进行胶原的测定。
[0091]
结果示于图4。如图4所示，在高浓度的试验物质中观察到成纤维细胞的i型胶原产生促进。然而，其效果在低浓度(图3b)观察不到，鉴于此，提示成纤维细胞的i型胶原产生介由薰衣草油等神经激活物质的神经激活而被促进。
[0092]
实施例5：筛选方法
[0093]
对接种于板的ips细胞来源的感觉神经祖细胞注入包含候选药剂的溶液。将该混合液的上清添加到成纤维细胞中。将添加后的胶原表达用定量pcr进行测定，通过与对照比较，从而能够确定候选药剂的成纤维细胞中的胶原产生作用。可以筛选具有胶原表达促进的候选药剂作为成纤维细胞i型胶原产生促进剂。