基于薄层色谱的防风检测方法与流程

1.本发明涉及防风检测技术领域，具体来说，涉及基于薄层色谱的防风检测方法。


背景技术：

2.防风为伞形科植物防风(saposhnikovia divaricata(turcz.)schischk.)的干燥根。本品主产于黑龙江、内蒙古、吉林、辽宁，其味辛、甘，微温，归属于膀胱、肝、脾经，有祛风解表、胜湿止痛以及止痉等功效。其主要化学成分为色原酮类、香豆素类、多糖类、挥发油类等，其中色原酮类为主要活性成分。现代药理研究表明防风具有解热、抗炎、镇静、镇痛以及抗肿瘤等药理活性作用，临床上常用于治疗风湿痹症、风疹瘙痒、惊吓抽搐以及破伤风等疾病。防风是很多中药复方的重要组成药味且被广泛应用于中医临床，所以全面有效控制防风药材质量具有重要意义。
3.目前，防风的薄层检测主要是依据2020版《中国药典》记载的方法进行的，具体包括：取本品粉末1g，加丙酮20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取防风对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取升麻素苷对照品、5-0-甲基维斯阿米醇苷对照品，加乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。但该方法存在一定的缺陷，其以丙酮作为提取溶剂，毒性较大，对实验者身体健康会造成较大的损害，且仅以升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷为检出成分的标准，检出成分较少，不利于防风药材质量的进一步鉴别。
4.针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。


技术实现要素：

5.针对相关技术中的问题，本发明提出基于薄层色谱的防风检测方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
6.为此，本发明采用的具体技术方案如下：
7.基于薄层色谱的防风检测方法，该方法包括以下步骤：
8.向对照药材混合物滴加甲醇溶解，得到对照品溶液；
9.向待测样品中加入提取溶剂进行提取过滤，得到供试品溶液；
10.分别对所述对照品溶液与所述供试品溶液进行薄层层析测定。
11.进一步的，所述对照药材混合物包括升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷且质量份数比为1：1：1：1，所述对照品溶液中每1ml各含有1mg的升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷。
12.进一步的，所述提取溶剂为75％-100％甲醇或75％-100％乙醇，且所述提取溶剂的量为所述待测样品的5-20倍量。
13.进一步的，所述向待测样品中加入提取溶剂进行提取的方法为采用超声提取10-30min，再选取上清液进行过滤得到供试品溶液。
14.进一步的，所述分别对所述对照品溶液与所述供试品溶液，进行薄层层析测定包括以下步骤：
15.分别吸取所述对照品溶液和所述供试品溶液在同一硅胶gf254薄层板上进行点样；
16.分别滴加展开剂，进行展开、取出与晾干；
17.分别喷洒显色剂，再烘干至斑点显色清晰；
18.置于紫外光灯下进行检视。
19.进一步的，所述对照品溶液和所述供试品溶液的吸取量各为2-10μl，所述对照品溶液和所述供试品溶液的点样宽度各为2-10mm。
20.进一步的，所述展开剂包括三氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-乙酸或三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯；
21.其中，三氯甲烷-甲醇份数比为4:1，乙酸乙酯-甲醇-水份数比为10:2:1，正己烷-乙酸乙酯-乙酸份数比为20:10:1，三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯份数比为4:2:1。
22.进一步的，所述滴加展开剂后的展开距离为7-9cm。
23.进一步的，所述显色剂为10％硫酸乙醇，烘干的温度为105℃，所述紫外波长为365nm。
24.进一步的，所述硅胶gf254薄层板包括普通gf254薄层板和高效gf254薄层板。
25.本发明的有益效果为：通过在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，能快速、有效的鉴别出防风，该方法操作简便、精密度和灵敏度高、稳定性好，且较现有技术能更准确鉴定防风，具有良好的应用前景。
26.具体为，通过考察供试品溶液的制备、薄层板的选择、展开条件、点样量、显色条件等影响因素，优化提取条件及展开条件，并对实验条件进行系统适用性试验。本方法采用75％甲醇作为提取溶剂，相较于中国药典记载的以丙酮作为提取溶剂，甲醇的毒性较小，更加安全；同时，还增加了两种成分分别为升麻素和亥茅酚苷作为检出标准，进一步优化了防风的薄层检出标准；并且，本方法提取检测的防风中各成分分离度良好，可反映防风药材的特征信息，具有专属性与整体鉴别性，而且有较好的重现性，建立了更加科学、系统、完整的防风质量控制体系，确保药材安全、有效、可控。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是根据本发明实施例的基于薄层色谱的防风检测方法的流程图；
29.图2是根据本发明实施例中展开剂为三氯甲烷-甲醇(4:1)的防风tlc色谱图；
30.图3是根据本发明实施例中展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(10:2:1)的防风tlc色谱图；
31.图4是根据本发明实施例中展开剂为二氯甲烷-甲醇(4:1)的防风tlc色谱图；
32.图5是根据本发明实施例中展开剂为三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4:2:1)的防风tlc色谱图；
33.图6是根据本发明实施例中提取溶剂为甲醇的防风tlc色谱图；
34.图7是根据本发明实施例中提取溶剂为乙醇的防风tlc色谱图；
35.图8是根据本发明实施例中不同料液比的防风tlc色谱图；
36.图9是根据本发明实施例中不同超声提取时间的防风tlc色谱图；
37.图10是根据本发明实施例中不同点样量的防风tlc色谱图；
38.图11是根据本发明实施例中不同点样宽度的防风tlc色谱图；
39.图12是根据本发明实施例中展开距离为7cm的防风tlc色谱图；
40.图13是根据本发明实施例中展开距离为8cm的防风tlc色谱图；
41.图14是根据本发明实施例中展开距离为9cm的防风tlc色谱图；
42.图15是根据本发明实施例中高效gf254薄层板的防风tlc色谱图；
43.图16是根据本发明实施例中普通gf254薄层板的防风tlc色谱图；
44.图17是根据本发明实施例中青岛海洋薄层板的防风tlc色谱图；
45.图18是根据本发明实施例中黄海牌薄层板的防风tlc色谱图；
46.图19是根据本发明实施例中温度为4℃的防风tlc色谱图；
47.图20是根据本发明实施例中温度为25℃的防风tlc色谱图；
48.图21是根据本发明实施例中温度为35℃的防风tlc色谱图；
49.图22是根据本发明实施例中湿度为40％的防风tlc色谱图；
50.图23是根据本发明实施例中湿度为60％的防风tlc色谱图；
51.图24是根据本发明实施例中湿度为80％的防风tlc色谱图；
52.图25是根据本发明实施例中不同时间保存的防风tlc色谱图。
具体实施方式
53.为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点。
54.根据本发明的实施例，提供了基于薄层色谱的防风检测方法。
55.现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，如图1所示，根据本发明实施例的基于薄层色谱的防风检测方法，该方法包括以下步骤：
56.s1、向对照药材混合物滴加甲醇溶解，得到对照品溶液；
57.其中，所述对照药材混合物包括升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷且质量份数比为1：1：1：1，所述对照品溶液中每1ml各含有1mg的升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷。
58.s2、向待测样品中加入提取溶剂进行提取过滤，得到供试品溶液；
59.其中，所述提取溶剂为75％-100％甲醇或75％-100％乙醇，且所述提取溶剂的量为所述待测样品的5-20倍量；
60.所述向待测样品中加入提取溶剂进行提取的方法为采用超声提取10-30min，再选
取上清液进行过滤得到供试品溶液。
61.s3、分别对所述对照品溶液与所述供试品溶液进行薄层层析测定，包括以下步骤：
62.s31、分别吸取所述对照品溶液和所述供试品溶液在同一硅胶gf254薄层板上进行点样；
63.其中，所述对照品溶液和所述供试品溶液的吸取量各为2-10μl，所述对照品溶液和所述供试品溶液的点样宽度各为2-10mm；
64.所述硅胶gf254薄层板包括普通gf254薄层板和高效gf254薄层板。
65.s32、分别滴加展开剂，进行展开、取出与晾干；
66.其中，所述展开剂包括三氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-乙酸或三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯；
67.其中，三氯甲烷-甲醇份数比为4:1，乙酸乙酯-甲醇-水份数比为10:2:1，正己烷-乙酸乙酯-乙酸份数比为20:10:1，三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯份数比为4:2:1。
68.此外，所述滴加展开剂后的展开距离为7-9cm。
69.s33、分别喷洒显色剂，再烘干至斑点显色清晰；
70.其中，所述显色剂为10％硫酸乙醇，烘干的温度为105℃，所述紫外波长为365nm。
71.s34、置于紫外光灯下进行检视。
72.实施例一
73.步骤1、对照品溶液的制备：分别取升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷，加甲醇溶解，制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液；
74.步骤2、供试品溶液的制备：取防风药材样品粉末1g，加入5ml 75％甲醇，超声10min，取上清液滤过，作为供试品溶液，另取防风对照药材1g，同法制成对照药材溶液；
75.步骤3、薄层层析测定：取对照品溶液和供试品溶液各5ul，分别点于同一硅胶高效gf254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇为显色剂，烘干至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。
76.供试品显示为防风药材，其色谱图在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
77.在实施例一中所采用各设备、各试剂的配比以及操作的方法均为本发明的最优选择，进而实现最优的检测效果，以下为各参数实验与选择过程的对比：
78.1.不同展开剂的比较
79.实验选用了不同的展开剂，分别考察了三氯甲烷-甲醇(4:1)、乙酸乙酯-甲醇-水(10:2:1)、正己烷-乙酸乙酯-乙酸(20:10:1)以及三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4:2:1)等展开剂系统，最终发现三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4:2:1)效果最好，其实验结果的防风tlc色谱图如图2-5所示。
80.2.不同提取溶剂的比较
81.实验选用了不同的提取溶剂，分别考察了75％甲醇超声、85％甲醇超声、甲醇超声、75％乙醇超声、85％乙醇超声、乙醇超声等提取方法，经过比较，发现75％甲醇超声提取分离度较好，得到的斑点较多且清晰，并且节省溶剂，即采用的提取方法为75％甲醇超声提取，其实验结果的防风tlc色谱图如图6-7所示。
82.3.不同提取时间的比较
83.考察不同的提取时间，分别考察了超声10min，20min，30min，结果发现超声10min所得供试品显色后分离度较好，条带较为清晰，其实验结果的防风tlc色谱图如图9所示。
84.4.不同料液比的考察
85.考察不同的固液比，分别考察了1g样品加入5ml，10ml，20ml75％甲醇，结果发现当固液比为1:5时分离度较好，条带也较为清晰，其实验结果的防风tlc色谱图如图8所示。
86.5.不同点样量的比较
87.考察了不同点样量，分别点样2、5、8、10ul，最终发现5ul分离效果最好，显色后也能够观察到清晰条带，其实验结果的防风tlc色谱图如图10所示。
88.6.不同点样宽度的比较
89.考察了不同点样宽度，分别点样10mm,8mm,5mm,2mm,最终发现8mm分离效果最好，显色后条带清晰分明，其实验结果的防风tlc色谱图如图11所示。
90.7.不同展开距离的比较
91.考察了不同展开距离，分别展开7cm，8cm，9cm，最终发现当展开距离为8cm时，分离效果最好，条带最为清晰，其实验结果的防风tlc色谱图如图12-14所示。
92.8.不同规格gf254薄层板的比较
93.室温下取供试品溶液，照薄层色谱法试验，照薄层色谱法试验吸取上述供试品溶液各5ul，分别点于硅胶gf254板和高效硅胶gf254板上，三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4：2：1)为展开剂，展开8cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。最终发现高效硅胶gf254板分离效果较好，显色后条带清晰分明，其实验结果的防风tlc色谱图如图15-16所示。
94.9.不同厂家薄层板的比较
95.分别取5μl对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，分别点样于不同厂家的高效薄层板上。结果表明：在不同薄层板中，该方法均适用，斑点清晰，分离度好，其实验结果的防风tlc色谱图如图17-18所示。
96.10.不同温度的考察
97.取点样后的高效薄层色谱板，分别在不同温度下展开(4℃，25℃，35℃)，相对湿度(rh％)为60％。湿度选择依据：(9001原料药物与制剂稳定性指导原则)中国总体来说是亚热带，部分地区属湿热带，故长期采用温度为25℃
±
2℃、相对湿度60％
±
10％。结果表明，该方法对不同温度的试用性良好，其实验结果的防风tlc色谱图如图19-21所示。
98.11.不同湿度的考察
99.取点样后的高效薄层色谱板，分别在不同湿度(rh％)下展开(40％，60％，80％)，温度为25℃。结果表明，湿度对薄层展开效果影响不大，该方法对不同湿度的适应性较好，其实验结果的防风tlc色谱图如图22-24所示。
100.12.稳定性考察
101.用已确定的薄层方法(前处理、展开剂等)，把供试品分别放在室温保存(0，1，2d，3d),分别取5ul对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液，结果表明，不同保存时间的样品的色谱图是一致的，表明该前处理提取方法稳定，展开条件也稳定，其实验结果的防风tlc色谱图如图25所示。
102.综上，本发明方法展开剂为三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(4:2:1)，提取溶剂为75％甲
醇，超声提取时间为10min，料液比为1:5，点样量为5ul，点样宽度为8mm，展开距离为8cm，使用的薄层板为青岛海洋高效gf254硅胶薄层板，显色剂为10％的硫酸乙醇，在紫外灯365nm下检视，可使不同薄层板上升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷四种成分斑点均可以达到有效分离，该方法操作简单，节约溶剂，安全低毒，斑点观察方便，分析速度快，耐用性强。
103.综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，能快速、有效的鉴别出防风，该方法操作简便、精密度和灵敏度高、稳定性好，且较现有技术能更准确鉴定防风，具有良好的应用前景。
104.具体为，通过考察供试品溶液的制备、薄层板的选择、展开条件、点样量、显色条件等影响因素，优化提取条件及展开条件，并对实验条件进行系统适用性试验。本方法采用75％甲醇作为提取溶剂，相较于中国药典记载的以丙酮作为提取溶剂，甲醇的毒性较小，更加安全；同时，还增加了两种成分分别为升麻素和亥茅酚苷作为检出标准，进一步优化了防风的薄层检出标准；并且，本方法提取检测的防风中各成分分离度良好，可反映防风药材的特征信息，具有专属性与整体鉴别性，而且有较好的重现性，建立了更加科学、系统、完整的防风质量控制体系，确保药材安全、有效、可控。
105.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。