一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用的制作方法

一种灰树花udp葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明属于食用菌分子生物技术和基因工程领域，具体涉及一种灰树花udp葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用。


背景技术：

2.多糖结构复杂，其由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖等各种单糖通过立体和区域糖苷键连接而成，是植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中提供能量、支撑细胞结构和发挥生物学功能的重要成分。目前虽然通过完全酸水解、甲基化分析结合核磁共振(nmr)光谱和原子力显微镜(afm)等化学方法阐明了植物和微生物多糖的精细结构。然而，udp-葡萄糖焦磷酸化酶(ugp)、udp-糖基转移酶(ugt)和葡聚糖合酶(gls)等多糖合成相关酶的合成途径和催化特性仍需继续深入研究。
3.ugt属于糖基转移酶家族(gts；ec 2.4.xy)，它将糖部分从活化的核苷酸糖供体(udp-葡萄糖[udp-glu]、udp-半乳糖和udp-木糖)转移到各种受体分子，例如核苷酸、糖类、脂质、蛋白质、抗生素和小分子/特殊代谢物。ugt已被证明在植物天然产物的糖基化中发挥不可或缺的作用，以调节植物生长和发育，包括激素稳态和授粉，以及环境相互作用，包括外源性解毒和对紫外线辐射的耐受性。最近，使用ugt作为生物催化剂来合成高价值的糖苷已经引起了人们的关注。
[0004]
糖基转移酶(gts；ec2.4.xy)属于转移酶家族，它将糖部分从活化的核苷酸糖(如udp-葡萄糖、udp-半乳糖和udp-木糖)供体转移到糖类或非糖类受体以合成寡糖、多糖、糖缀合物、抗生素和小分子。根据序列同一性、保守基序和糖苷键的立体化学，糖基转移酶分为114个家族。尿苷二磷酸(udp)-糖基转移酶(ugts)属于家族1，其广泛存在于植物、动物、真菌、细菌以及病毒中。
[0005]
灰树花是一种担子菌属真菌，富含碳水化合物(～50％，干基)、蛋白质(～20％)以及脂质(～5％)。目前灰树花多糖结构已被很好地表征，并被证明具有多种功能，包括抗肿瘤、免疫刺激、抗糖尿病和降血糖活性。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种灰树花udp葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明中从灰树花(grifola frondosa)中克隆得到了udp葡萄糖基转移酶ugt88a1，并将其命名为gfugt88a1；所述灰树花udp葡萄糖基转移酶能够用于体外催化合成低聚糖。
[0007]
本发明中首先提供了一种灰树花udp葡萄糖基转移酶，将其命名为gfugt88a1，其氨基酸序列如seq id no.2所示；所述udp葡萄糖基转移酶为尿苷二磷酸葡萄糖(udp-葡萄糖)依赖的葡萄糖基转移酶。
[0008]
编码上述灰树花udp葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码序列全长为1386个核苷酸。
[0009]
本发明中还提供了一种重组表达载体，所述重组载体含有上述灰树花udp葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，所述重组表达载体为适用于在大肠杆菌中表达的载体。
[0010]
本发明中还提供了含有上述重组表达载体的转基因工程菌，所述转基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。
[0011]
本发明中还提供了上述灰树花udp葡萄糖基转移酶的克隆表达方法，包括如下步骤：
[0012]
将编码udp葡萄糖基转移酶的核苷酸序列克隆入表达载体，然后转入大肠杆菌bl21(de3)中；最后经纯化得到udp葡萄糖基转移酶。
[0013]
本发明中还提供了上述udp葡萄糖基转移酶体外催化合成低聚糖的应用，所述应用为通过所述的udp葡萄糖基转移酶，将糖基供体udp-葡萄糖中的糖基转移并结合到昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖的受体寡糖上，合成更高聚合度的低聚糖。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015]
本发明首次异源表达灰树花多糖合成相关udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1，并发现udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1能够体外催化合成聚合度更高寡糖链的功能，填补了现有技术中udp葡萄糖基转移酶作用于高等真菌多糖合成过程的技术空白，具有十分重要的意义。
[0016]
本发明中，克隆表达纯化得到的udp-葡萄糖基转移酶gfugt88a1能够以udp-葡萄糖作为供体，以不同聚合度的寡糖作为受体，催化合成聚合度更高的寡糖链。本发明对udp-葡萄糖基转移酶催化多糖合成具有重要的学术价值。
附图说明
[0017]
图1为pet-30a( )-gfugt88a1表达质粒图谱。
[0018]
图2为琼脂糖凝胶电泳图，图中，m：dna maker；lane1：pet-30a( )-gfugt88a1；lane2：pet-30a( )-gfugt88a1经ndei和hindiii双酶切验证。
[0019]
图3为将重组表达载体pet-30a( )-gfugt88a1转化到大肠杆菌bl21(de3)后的菌落pcr验证。m：dna maker；lane1：转化失败；lane2-5：转化成功。
[0020]
图4为gfugt88a1重组蛋白的异源表达验证图；其中a为sds-page蛋白电泳图；b为western-blot图。
[0021]
图5为akta纯化gfugt88a1重组蛋白的吸收峰图及收集的目的蛋白sds-page电泳图；图中，峰i代表杂蛋白，峰ii代表咪唑洗脱的目的蛋白gfugt88a1。
[0022]
图6为udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1以udp-葡萄糖作为供体、昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖分别作为受体进行的酶学性质测定结果图，其中a为酶动力学参数测定图；b为金属离子对gfugt88a1酶活性影响图；c为gfugt88a1最适温度的测定图；d-f分别为以昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖作为受体进行的gfugt88a1热稳定性的测定图；g为gfugt88a1最适ph的测定；h为gfugt88a1的ph稳定性测定图。
[0023]
图7为udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1以udp-葡萄糖作供体对不同聚合度寡糖作为受体底物进行体外合成产物的hplc分析图谱；其中a为以昆布二糖(lam2)为底物、b为以昆布六糖(lam6)为底物、c为以昆布九糖(lam9)为底物，图中自下而上分别对应反应时间0h，12h，24h，36h，48h；峰顶所对应数字指的是寡糖的聚合度。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0025]
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌或其他表达载体中表达gfugt88a1的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，在此不再赘述。
[0026]
以下实施例中，大肠菌株bl21(de3)、大肠杆菌top10可市售获得。大肠菌株bl21(de3)用于本发明中糖基转移酶gfugt88a1基因的表达。
[0027]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]
实施例1:灰树花udp葡萄糖基转移酶编码基因的克隆
[0029]
离心收集灰树花gf02(购自美国模式培养物集存库，americantypeculturecollection，60301
tm
)培养菌丝体，迅速加入液氮研磨成细粉，通过fungaltotalrnaisolationkit(sangonbiotech)提取灰树花总rna。使用primescript
tm
rtreagentkitwithgdnaeraser(takara)试剂说明书操作合成cdna。
[0030]
本实施例根据已公开的灰树花udp葡萄糖基转移酶(genbankaccessionnumber：obz67170)的编码基因，设计引物进行扩增，以反转录产物cdna为模板，序列atggtcaggc tgcgggtgat tgt(seq id no.3)和tcaaacaccg acagaatcaa ggagcg(seq id no.4)为引物进行pcr扩增。所述pcr扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s、退火30s，退火温度55℃，72℃延伸1.5min，反应34个循环，得到扩增产物。
[0031]
采用1％琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增产物，再用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr扩增得到的目的基因片段ugt88a1，由苏州金唯智对目的片段进行测序。测序结果经ncbi进行blast比对分析，确认其为编码灰树花udp葡萄糖基转移酶基因，命名为gfugt88a1。
[0032]
实施例2：pet-30a( )-gfugt88a1表达载体构建
[0033]
根据上述克隆测序得到的gfugt88a1的核苷酸序列，进行大肠杆菌中密码子优化，优化后的核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示。添加6
×
his标签后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0034]
seq id no.1：
[0035]
atggttaggctaagagttatagtagttacatttctaacaactgctgcactatacgaccgtatcaagagcgagattagccgtagcttcgagccgaacgaggaacacctgctggaccgtatccgtgttattgcgctgcagaagaacctgcaagatcacttcggtggcgacaccctggataccgcgtttgaagacgcgtacagcaagctgatcagcgaggaaccgctgacctgcgttaaaaccggtaccagctatgatagcgtgcgtagcccggatgcggcgattgtggatttctttgcgattgttccgttcaacgcggcgaagaaactgaaccgtaacggcgaggaacgtcgtaacctgcgtgcgaaggtggaggcggaagttaaacgtagcggccgtccgttcaacctggtggcgaccgaggttctgtttggtagcgatggcagcgtggttcgtattccgggcctgccgccgatgtatgaccacgagtataacccgcaggacttcacctttagcgaagatctgggtgcgaaaattctgctgatgacctacgacaccctggaggcgagcgatggtgttccgctgctgagcgcggaagcgtatgagccggaatgcgtggcggcggttcgtgaatggttcgcgcagaccagccgtagcgtgaccgtttgcggtccgctgctgccgagcggcaagaacgcggcggcgcacgagaaacagcaaagcagcgagggtaacgaaattcaaaagtttctggacagcaccctg
gaaagccacggtacccacagcctgctgtacatcagcttcggcagcatgttttggccggcgaagccggacgtgatttgggcgttcctggatgtggttatggagctgaaaatcccgtttattctgagccatgcgagcccgctggcggtggttccggaggaagtgagccagaaagttcgtgaatatggtctgggcctgctgagcccgtggaccccgcagcaaaccatcctgaaccatccggcgaccggttggtttgtggcgcacggtggccacaacggtgttctggaggcgaccaccgcgggcgtgccgcagattttctggccgtttgcggcggatcaaccgctgaacgcggttcacctgacccacaacctggacgtggcgtacgagctgatcgaagttcgtaccggcaagggcctgctgccgattctgcgtaccggttataccccggtgggtaccccggaggcggttcgtaacgaagcgaaggacgtgctgaccaaagcgtttggcgaggatggcgagcgtaagcgtgcgaaactgcaagcgctgaagaaagcgctggcggagagctgggcggaagatggtccgagccgtcgtgatgttgaggcgctgctggatagcgttggcgtt
[0036]
seq id no.2：
[0037]
mvrlrvivvtflttaalydrikseisrsfepneehlldrirvialqknlqdhfggdtldtafedayskliseepltcvktgtsydsvrspdaaivdffaivpfnaakklnrngeerrnlrakveaevkrsgrpfnlvatevlfgsdgsvvripglppmydheynpqdftfsedlgakillmtydtleasdgvpllsaeayepecvaavrewfaqtsrsvtvcgpllpsgknaaahekqqssegneiqkfldstleshgthsllyisfgsmfwpakpdviwafldvvmelkipfilshasplavvpeevsqkvreyglgllspwtpqqtilnhpatgwfvahgghngvleattagvpqifwpfaadqplnavhlthnldvayelievrtgkgllpilrtgytpvgtpeavrneakdvltkafgedgerkraklqalkkalaeswaedgpsrrdvealldsvgv。
[0038]
设计带有表达载体pet-30a( )的多克隆酶切位点的特异引物，引物序列为：
[0039]
agatatacat atggtcaggc tgcgggtgat tgt(seq id no.5)和gccgcaagctttcattaatg gtggtggtgg tg(seq id no.6)。
[0040]
将由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的gfugt88a1基因用seq id no.5和seq id no.6所示引物序列进行pcr扩增，限制性内切酶ndei和hindiii双酶切回收目的片段，同样用限制性内切酶ndei和hindiii双酶切表达载体pet-30a( )，酶切产物经胶回收试剂盒回收。
[0041]
然后采用hieffplus one step cloning kit一步法快速克隆试剂盒将克隆出的gfugt88a1片段重组至pet-30a( )载体中，转化至大肠杆菌top10感受态，利用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，提取质粒、双酶切验证(图2)获得正确重组表达载体pet-30a( )-gfugt88a1。质粒图谱如图1所示，目的基因片段gfugt88a1插入到质粒pet-30a( )上的ndei和hindiii酶切位点处。
[0042]
实施例3:gfugt88a1的异源表达与纯化
[0043]
将实施例2中得到的重组表达质粒pet-30a( )-gfugt88a1转化到大肠杆菌bl21(de3)中，利用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，挑取单菌落进行菌落pcr验证(图3)，挑取验证成功的阳性菌落接种到100ml lb(kan )液体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)中，37℃，180rpm摇动培养，直至od
600
为0.6～0.8，获得转基因工程菌。
[0044]
在上述转基因工程菌中加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，15℃诱导16h后收集菌体，用pbs缓冲液充分洗涤菌体，离心后称重。按照1g菌体加入10ml pbs缓冲液添加pbs缓冲液，使菌体充分悬浮，在冰浴的环境条件下对菌体进行超声破碎20min(250w，超声1.5s，间隙2.5s)，离心后收集上清和沉淀。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(sds-page)方法检测蛋白表达，以未经iptg诱导的工程菌作为对照，结果如图4a所
示。图中，nc和1，2为全菌液，nc1和3，4为上清，nc2和5，6为沉淀，从图中可以看出，带his标签的gfugt88a1蛋白分子量大小约为50kda。总目的蛋白(菌液中的所有目的蛋白)和菌体超声破碎后沉淀中的gfugt88a1条带亮度接近，表明gfugt88a1重组蛋白以包涵体的形式表达。另外，也通过western-blot验证了重组蛋白gfugt88a1的表达(图4b)。
[0045]
对收集得到的沉淀进行处理，以1g沉淀加20ml洗涤缓冲液(包括0.5m nacl，20mm tris，2m尿素，1mm edta，ph8.0)的比例添加缓冲液，洗涤收集到的沉淀，重复两次，然后离心得到包涵体。然后按1g包涵体加入20ml包涵体溶解缓冲液(包括0.5m nacl，20mm tris，8m尿素，1mm dtt，ph8.0)的比例添加包涵体溶解缓冲液，重新悬浮包涵体，并在4℃下震荡过夜。待包涵体充分溶解后，8000rpm，4℃的条件下离心30min，除去不溶物质，收集上清。
[0046]
使用ni-nta预装色谱柱在aktapurifier上对收集到的上清进行亲和纯化，具体操作步骤如下：
[0047]
首先，用2倍柱体积的结合缓冲液(包括0.5m nacl、20mm tris、8m尿素、ph8.0)以0.8ml/min的流速洗涤镍柱；上样后，用洗涤缓冲液(包括0.5m nacl、20mm tris、8m尿素、10mm咪唑，ph8.0)洗脱杂蛋白，直到观察到基线稳定；最后用洗脱缓冲液(包括0.5m nacl、20mm tris、8m尿素、500mm咪唑，ph8.0)以0.5ml/min的流速洗脱目的蛋白gfugt88a1，并收集峰洗脱液。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(sds-page)方法检测收集到的目的蛋白的分子量及纯度，结果如图3所示。图中可看出，在53kda左右有明显单一的重组蛋白条带，说明纯化完全。
[0048]
本实施例中还采用梯度透析法对上述纯化得到的目的蛋白进行复性，具体步骤为：
[0049]
将收集到的目的蛋白装入透析袋，先在6m尿素中透析12h，接着在4m尿素中透析12h，然后在2m尿素中透析12h，最后在不含尿素的缓冲液中透析12h。透析结束后用截留分子量(nmwl)为10kda的milipore超滤离心管进行浓缩，得到纯化的gfugt88a1，-80℃保存。
[0050]
实施例4：udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1酶学性质的测定
[0051]
酶活力的测定方法：将实施例3中纯化得到的gfugt88a1与底物udp-葡萄糖和寡糖混合反应一定时间后，加入磷酸酶在37℃水解产生的核苷酸二磷酸1h，释放出无机磷酸盐；加入孔雀石绿试剂，在室温下孵育15min，测定600nm处的吸光值。通过标准曲线计算无机磷酸盐的量，每微克udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1蛋白(μg)单位时间(min)内释放出的1pmol的磷酸盐的量定义为1个酶活单位(pmol min-1
μg-1
)。
[0052]
(1)udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1底物特异性的测定：
[0053]
分别选取葡萄糖(glu)、昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)作为底物，按照上述的酶活力的测定方法进行测定gfugt88a1对葡萄糖(glu)、昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)为底物时的酶活力，进而得到udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1底物特异性。设置不同底物浓度为20μm，40μm，60μm，100μm，200μm，300μm，在37℃、ph7.0的条件下反应36h，测定gfugt88a1对葡萄糖(glu)、昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)的底物特异性。
[0054]
表1.gfugt88a1的底物特异性
[0055][0056]
由表1可知，gfugt88a1对lam9的比活性最高，为84.52pmol/min/μg，其次是lam6(70.13pmol/min/μg)和lam2(37.21pmol/min/μg)，这意味着底物低聚糖的高聚合度更有利于gfugt88a1从供体udp-葡萄糖转移葡萄糖部分到受体上。利用软件graphpadprism8.0.1，拟合得到酶动力参数km和vmax，使用lam9作为受体时，gfugt88a1有最高vmax为1.31μmmin-1
，最低km为24.15μm，kcat为1.34min-1
，kcat/km为0.055min-1
μm-1
；以lam2作为受体时，有最低vmax为0.943μmmin-1
，最高km为73.88μm，kcat为0.96min-1
，kcat/km为0.013min-1
μm-1
，这也证实了gfugt88a1对高聚合度寡糖的催化能力。
[0057]
(2)udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1最适温度的考察：
[0058]
采用上述酶活力的测定方法，在ph7.0的tris-hcl缓冲体系中，分别测定gfugt88a1在15℃，25℃，31℃，37℃，43℃，50℃，60℃条件来测定udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1酶活力，进而考察其最适温度。从图6c可见，gfugt88a1随着反应温度从15℃升高到37℃时达到最大活性(相对活性为100％)，随后在60℃时活性下降至50％。因此，37℃可以认为是将葡萄糖部分从udp-葡萄糖转移到昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)以延长低聚葡萄糖链的最佳温度。
[0059]
(3)udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1热稳定性的考察：
[0060]
将gfugt88a1酶液分别在20℃，40℃，60℃，80℃条件下保温30、60、120和240min，测定gfugt88a1的残留酶活力，以酶在未加热温度下的酶活为100％，进行计算其他条件下的酶活力。由图6d-f可知，在40℃以下的温度下保持240min后，gfugt88a1的活性稳定并保持在80％以上；当储存温度升至60℃时，gfugt88a1的相对活性逐渐下降至约30％；而使用lam2作为受体仍保持50％的残留活性，这表明gfugt88a1在较低聚合度的寡糖下表现出对
储存温度60℃的耐受性。gfugt88a1在80℃孵育120min后未检测到糖基化活性。
[0061]
(4)udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1最适作用ph及ph稳定性的考察：
[0062]
采用上述酶活力的测定方法，将缓冲液根据需要替换成：柠檬酸缓冲液(ph4.0～6.0)，tris-hcl缓冲液(ph7.0～9.0)，甘氨酸-naoh缓冲液(ph10.0)。37℃下反应36h后测定其酶活力。将gfugt88a1酶液分别在ph4.0-10.0条件下保温60min，测定gfugt88a1的残留酶活力，以酶在未保温条件下测定的酶活力为100％，进行计算其他条件下的酶活力。
[0063]
由图6g-h可知，在ph7.0时，gfugt88a1表现出最高的活性，当ph降至6.0或增加至10.0时，gfugt88a1的相对活性显着降低至约40％甚至18％。在酸性条件下，酶活力随ph值下降迅速降低；在碱性条件下，催化效率随ph值升高而下降较缓，ph为9时，仍保持着较高酶活，表明gfugt88a1蛋白在碱性环境下更加稳定。
[0064]
(5)金属离子对udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1酶活性影响的考察：
[0065]
将金属离子(co
2
，fe
3
，ca
2
，mg
2
，fe
2
，mn
2
，cu
2
，ni
2
，k

，na

，zn
2
，al
3
，ba
2
)分别与gfugt88a1混合，混合溶液中金属离子终浓度为1mm，在37℃下放置1h后，再按照表1加入反应体系中的剩余物质。在ph7.0、37℃条件下反应36h，评估酶活性，以不添加金属离子的实验组作为对照。
[0066]
图6b表明na

对gfugt88a1活性约有20％的增强作用，co
2
、ca
2
、mg
2
、mn
2
、k

会轻微抑制gfugt88a1的活性，而fe
2
和cu
2
则对gfugt88a1活性有明显的抑制作用，酶活力降低了约60％。
[0067]
综上所述，udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1可以催化多种底物反应，因此可以使用udp-葡萄糖作为供体，催化昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)合成具有更高聚合度的低聚糖。其中，udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1更喜欢更高聚合度的寡糖作为底物，具体表现为使用昆布九糖(lam9)作为受体时，udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1比活性最高为84.52pmol/min/μg。另外，udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1在ph7.0、温度37℃时表现出最高活性。
[0068]
实施例5：udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1体外合成产物的分析
[0069]
本实施例中，采用上述酶活力的测定方法，以反应不同时间为实验组，反应0h为对照组，采用高效液相色谱的方法来对udp葡萄糖基转移酶gfugt88a1的体外合成产物进行检测。
[0070]
其中，以反应时间为12h，24h，36h，48h为实验组，反应时间0h为对照组，具体的测定方法及条件为如下：
[0071]
在37℃，ph7.0条件下反应结束后，加入200μl甲醇，涡旋振荡5min，13000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液，即为酶反应产物。
[0072]
酶反应产物经hplc进行检测鉴定，所述hplc检测条件如下：nh2p-504e色谱柱(250
×
4.6mm，shodex)；elsd检测器：载气氮气，温度70℃，压力0.3mpa；流动相：57％色谱级乙腈(体积分数)；流速为1ml/min；柱温：恒温30℃；进样体积为10μl。
[0073]
hplc的图谱结果表明，反应后均出现了除供体udp-葡萄糖和受体底物(昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9))以外的新的信号峰，说明了酶促反应的发生。根据底物(标准品)的保留时间与聚合度，绘制了保留时间与聚合度的标准曲线，通过该标准方程(y＝1.896*x-6.041)来计算得到的反应产物的聚合度。如图7a，分别在对照组和实验
组中都观察到保留时间为1.89min的供体udp-葡萄糖和保留时间为4.20min的受体昆布二糖的单一峰，新的信号峰保留时间为5.25min，按上述标准方程计算其为聚合度为4的寡糖。如图7b所示，当使用昆布六糖作为受体时，发现了聚合度为8的寡糖，保留时间为7.41min。如图7c所示，在昆布九糖作为受体的情况下，合成的寡糖聚合度为15，保留时间为10.99min。并且在三个实验组中，没有检测到在受体昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)之间的其他聚合度的中间体及其合成产物，这表明gfugt88a1具有严格的底物结合位点。
[0074]
综上，gfugt88a1能够将udp-葡萄糖的葡萄糖部分转移到昆布二糖(lam2)、昆布六糖(lam6)、昆布九糖(lam9)以合成具有更高聚合度的低聚糖。
[0075]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。