含有二氨基庚二酸的细菌的定量方法与流程

本发明涉及被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌的定量方法。

背景技术

由于健康意志的提高等，向食品中实施有乳酸菌等的添加。这样的菌有时作为活着的菌(活菌)添加，有时作为死后的菌(死菌)添加。例如在功能性标示食品等中，作为功能性相关成分调配乳酸菌等细菌时，制品中所含的活菌数、死菌数的确定很重要。

作为样品中所含的活菌的定量方法，使用：使用琼脂培养基进行培养后，测量菌落的方法(培养法)等。例如专利文献1中，记载有一种活菌数测定方法，其特征在于，作为样本中所含的微生物的活菌数测定方法，具有使用悬浊用稀释液将样本制成悬浊液的工序，及测定上述悬浊液中所含的微生物的活菌数的工序，并记载有，可通过于琼脂培养基上进行培养的培养法实施悬浊液中所含的微生物的活菌数的测定。

另一方面，在死菌的粉末或添加其的制品的情况下，由于添加的菌为死菌，无法通过培养法测定菌数。测定无法通过培养法测定的样品的菌数时，实施总菌数的测定。总菌数的测定以使用显微镜的方法为主流，已知DAPI(荧光)染色法等代表性方法。在该方法中，针对将样本悬浊于稀释水而得的样品液，于显微镜下观察及测量细胞的形态，求取菌数。DAPI染色法的情况下，由于无法识别死菌与活菌，因此将测定结果作为总菌数(全部菌数)来处理。

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/157316号

技术实现要素：

乳酸菌之中存在细胞壁中含有二氨基庚二酸(以下也称DAP)的菌。该含有二氨基庚二酸的乳酸菌被添加至食品等中。然而，被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌的定量方法尚未研究。

此外，被检样品除了含有DAP的细菌之外，还含有不含DAP的细菌时，含有DAP的细菌的定量，例如含有DAP的细菌为活菌，不含DAP的细菌如果为死菌，可如上述所示通过培养法来实施。在含有：含有DAP的细菌与不含DAP的细菌的被检样品中，含有DAP的细菌及不含DAP的细菌均为活菌时，认为只要可以仅选择性培养含有DAP的细菌，在该条件下培养样品，通过对形成的菌落进行测量，可对含有DAP的细菌进行定量。

另一方面，含有DAP的细菌为活菌但无法对不含DAP的细菌进行选择性培养时，或者含有DAP的细菌为死菌时，无法通过培养法测定含有：含有DAP的细菌与不含DAP的细菌的被检样品中的含有DAP的细菌数。例如，含有DAP的细菌为死菌，不含DAP的细菌为活菌时，考虑由被检样品中的总菌数减去活菌数来求取含有DAP的死菌的数，但是存在活菌数与总菌数的测定方法不同的问题。含有：含有DAP的细菌与不含DAP的细菌的被检样品中所含的含有DAP的细菌无论为死菌还是活菌，均可选择性地对该细菌进行定量的方法也尚未研究。

本发明的目的在于提供一种新型的方法，该方法可对被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。

本发明者等为了解决上述课题进行深入研究，发现来自含有二氨基庚二酸的乳酸菌的二氨基庚二酸量与乳酸菌的菌数有高相关性，在含有二氨基庚二酸的细菌的定量中，可使用二氨基庚二酸作为指标。

即，本发明涉及以下分析方法。

[1]一种细菌的定量方法，其为对被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量的方法，其特征在于，包含以所述被检样品中的来自所述含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，对所述含有二氨基庚二酸的细菌进行定量的工序。

[2]根据[1]所述的细菌的定量方法，其特征在于，所述被检样品含有不含二氨基庚二酸的细菌。

[3]根据[1]或[2]所述的定量方法，其特征在于，所述含有二氨基庚二酸的细菌为死菌。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的定量方法，其特征在于，所述含有二氨基庚二酸的细菌为选自戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳酸杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、脂肪乳杆菌(Lactobacillus fabifermentans)、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、北海道乳杆菌(Lactobacillus hokkaidonensis)、寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)、苏伊士乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)及广布乳杆菌(Lactobacillus divergens)中的至少1种的乳酸菌。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的定量方法，其特征在于，所述含有二氨基庚二酸的细菌为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。

根据本发明，可提供一种新型的方法，该方法可对被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。使用本发明的定量方法时，例如被检样品除了含有二氨基庚二酸的细菌之外，还含有不含二氨基庚二酸的细菌时，可选择性地对该样品中的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。本发明的定量方法在食品、医药品等中所含的含有二氨基庚二酸的细菌的定量、含有该细菌的制品的品质管理等中有用。

附图说明

图1A为表示基于培养时间的乳酸菌S-PT84的菌数的经时性变化的图表。图1B为表示基于培养时间的二氨基庚二酸量的经时性变化的图表。

图2为表示图1A的纵轴的乳酸菌S-PT84菌数(个/g)与图1B的纵轴的二氨基庚二酸量(mg/100g)的相关性的图表。

图3为表示乳酸菌S-PT84原料重量与该原料中所含的二氨基庚二酸量的相关性的图表。

具体实施方式

本发明的细菌的定量方法为对被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量的方法，其特征在于，包含以来自上述被检样品中的上述含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，对上述含有二氨基庚二酸的细菌进行定量的工序。

本发明的被检样品通常为含有：含有二氨基庚二酸的细菌的样品。

在本说明书中，二氨基庚二酸(DAP)是指2，6-二氨基庚二酸。

作为含有二氨基庚二酸的细菌，可列举细胞壁的构成成分中含有二氨基庚二酸的乳酸菌，例如Lactobacillus pentosus(戊糖乳杆菌)、Lactobacillus plantarum(植物乳酸杆菌)、Lactobacillus paraplantarum(类植物乳酸杆菌)、Lactobacillus fabifermentans(脂肪乳杆菌)、Lactobacillus vaccinostercus(牛痘乳杆菌)、Lactobacillus hokkaidonensis(北海道乳杆菌)、Lactobacillus oligofermentans(寡发酵乳杆菌)、Lactobacillus suebicus(苏伊士乳杆菌)、Lactobacillus mali(马里乳杆菌)、Lactobacillus divergens(广布乳杆菌)等乳酸菌。

含有二氨基庚二酸的细菌可为1种，也可为2种以上，但优选为1种。在本发明的一种方式中，含有二氨基庚二酸的细菌优选为Lactobacillus pentosus(戊糖乳杆菌)。

含有二氨基庚二酸的细菌可为活菌，也可为死菌。由于被检样品中的来自上述含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量与该细菌数相关，因此可以该二氨基庚二酸量为指标，测定上述含有二氨基庚二酸的细菌的菌数(对细菌数进行定量)，可对该细菌进行定量。本发明的定量方法对于含有二氨基庚二酸的细菌的细菌数的测定有用。由于本发明的细菌的定量方法以被检样品中的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标对含有二氨基庚二酸的细菌进行定量，因此该细菌为活菌或死菌的任一种均可，可对该细菌进行定量。

上述被检样品也可含有不含二氨基庚二酸的细菌。本发明的方法对于含有：含有二氨基庚二酸的细菌与不含二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的含有二氨基庚二酸的细菌的定量有用。

不含二氨基庚二酸的细菌并无特别限定。作为不含二氨基庚二酸的细菌，例如可列举Lactobacillus delbrueckii(德氏乳杆菌)、Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)、Lactobacillus crispatus(卷曲乳杆菌)、Lactobacillus gasseri(格氏乳杆菌)、Lactobacillus helveticus(瑞士乳杆菌)、Lactobacillus johnsonii(约氏乳杆菌)、Lactobacillus kefiranofaciens(马乳酒样乳杆菌)、Lactobacillus casei(干酪乳杆菌)、Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)、Lactobacillus coryniformis(棒状乳杆菌)、Lactobacillus sakei(沙克乳杆菌)、Lactobacillus brevis(短乳杆菌)、Lactobacillus buchneri(布赫内氏乳杆菌)等乳酸菌；Bifidobacterium animalis(动物双歧杆菌)、Bifidobacterium bifidum(两歧双歧杆菌)、Bifidobacterium breve(短双歧杆菌)、Bifidobacterium infantis(婴儿双歧杆菌)、Bifidobacterium longum(长双岐杆菌)、Bifidobacterium adolescentis(青春双岐杆菌)等双歧杆菌等细菌。不含二氨基庚二酸的细菌，可为1种，也可为2种以上，但优选为1种。在一种方式中，作为不含二氨基庚二酸的细菌，优选不含二氨基庚二酸的乳酸菌、双歧杆菌等，更优选双歧杆菌。在一种方式中，被检样品也可为含有二氨基庚二酸的细菌与不含二氨基庚二酸的双歧杆菌及/或乳酸菌(优选为双歧杆菌或乳酸菌)的样品。不含二氨基庚二酸的细菌可为活菌，也可为死菌。在含有：含有二氨基庚二酸的细菌与不含二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的细菌的定量中使用本发明的方法时，不含二氨基庚二酸的细菌为活菌或死菌的任何一种均可，以被检样品中的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，可选择性地对含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。

在一种方式中，含有二氨基庚二酸的细菌优选为死菌。

本发明的细菌的定量方法可作为含有：含有二氨基庚二酸的死菌与不含二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的含有二氨基庚二酸的死菌的定量方法使用。本发明的定量方法对于含有：含有二氨基庚二酸的死菌与不含二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的含有二氨基庚二酸的死菌数的测定有用。此外，本发明的细菌的定量方法作为含有：含有二氨基庚二酸的死菌与不含二氨基庚二酸的活菌的被检样品中的含有二氨基庚二酸的死菌的定量方法有用。含有二氨基庚二酸的细菌为死菌时，无法如上所述通过培养法进行定量。此外，在DAPI(荧光)染色法中，可求取含有：含有二氨基庚二酸的细菌与不含二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的总菌数，但难以对含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。本发明的细菌的定量方法，即使当被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌为死菌，且该样品含有不含二氨基庚二酸的细菌时，也可选择性地对该样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。

在本发明的定量方法中，以被检样品中的来自上述含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，对上述含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。

本发明的定量方法也可包含对被检样品中的二氨基庚二酸量进行定量的工序。本发明的定量方法也可为以下细菌的定量方法，其包含对含有：含有二氨基庚二酸的细菌的被检样品中的二氨基庚二酸量进行定量的工序，及以上述被检样品中的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，对上述含有二氨基庚二酸的细菌进行定量的工序。被检样品中的二氨基庚二酸量的定量方法并无特别限定。被检样品中的二氨基庚二酸量的测定，例如可将被检样品供于酸水解，并通过对分解液中所含的二氨基庚二酸量进行定量来实施。本发明的定量方法也可包含将被检样品供于酸水解，并对分解液中所含的二氨基庚二酸量进行定量的工序。由分解液中所含的二氨基庚二酸量可求取来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量。以所得的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量为指标，可对上述含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。

酸水解的条件采用可分解含有二氨基庚二酸的细菌的细胞壁的条件即可。酸水解可在酸的水溶液中进行。酸水解中可使用例如盐酸等酸。从操作简便的角度出发优选盐酸。酸的水溶液中的酸浓度优选为0.5～12N，更优选为3～9N，进一步优选为5～7N。在一种方式中，酸水解的温度优选为70～150℃，更优选为90～130℃，进一步优选为100～120℃。酸水解的时间例如可设置为0.5小时以上，优选1小时以上，更优选6小时以上，进一步优选8小时以上，此外可设置为40小时以下。在一种方式中，酸水解的时间例如可设置为0.5～40小时，优选1～40小时，更优选6～40小时，进一步优选8～40小时。二氨基庚二酸量的定量方法并无特别限定，可通过使用氨基酸分析仪的氨基酸分析、使用高效液相色谱(HPLC)的方法、使用LC-MS的方法等来实施。在一种方式中，优选通过氨基酸分析对二氨基庚二酸进行定量。

被检样品优选含有二氨基庚二酸的细菌以外的成分中不含二氨基庚二酸。被检样品除含有二氨基庚二酸的细菌以外不含含有二氨基庚二酸的成分时，上述分解液中所含的二氨基庚二酸全部来自含有二氨基庚二酸的细菌。此时，可将被检样品中的二氨基庚二酸量作为来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量使用。

含有二氨基庚二酸的细菌以外的成分中含有二氨基庚二酸时，可通过另外对被检样品中的含有二氨基庚二酸的细菌以外的成分测定二氨基庚二酸量，从被检样品中的二氨基庚二酸量减去来自含有二氨基庚二酸的细菌以外的成分的二氨基庚二酸量，求取来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量。本发明的定量方法也可包含对被检样品中的含有二氨基庚二酸的细菌以外的成分的二氨基庚二酸量进行定量的工序。

由所得的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量，可求取含有二氨基庚二酸的细菌的菌数。由上述二氨基庚二酸量求取含有二氨基庚二酸的细菌的菌数的方法并无特别限定，例如，关于被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌，优选使用事先使用菌数已知的样品制作的校准曲线来实施的方法。具体而言，就校准曲线而言，使用样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌的菌数为已知的样品，如上所述将该样品供于酸水解，由对分解液中所含的来自含有二氨基庚二酸的细菌的二氨基庚二酸量进行定量而得的测定值来制作。校准曲线通常使用含有与被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌相同种类的细菌，且其菌数为已知的样品来制作。在本发明的定量方法中，可测定被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌的总菌数(活菌与死菌的总菌数)。在本发明的定量方法中，被检样品中所含的含有二氨基庚二酸的细菌全部为活菌时，可测定其活菌数，该细菌全部为死菌时，可测定其死菌数。

本发明的定量方法可为被检样品中的含有二氨基庚二酸的细菌及不含二氨基庚二酸的细菌的定量方法。本发明的定量方法也可包含对被检样品中所含的不含二氨基庚二酸的细菌进行定量的工序。例如上述不含二氨基庚二酸的细菌为活菌时，本发明的定量方法也可包含对上述被检样品中的不含上述二氨基庚二酸的活菌进行定量的工序。此时，含有二氨基庚二酸的细菌的定量工序，与不含二氨基庚二酸的活菌的定量工序的实施顺序并无特别限定。

活菌的定量方法并无特别限定。例如，在活菌数的测定中可使用培养法等。例如，在不含二氨基庚二酸的活菌的定量工序中，培养上述被检样品，通过测量上述不含二氨基庚二酸的活菌的菌落对上述活菌进行定量即可。培养可通过于琼脂培养基上实施培养的培养方法(固体培养法)实施即可。

培养及活菌的菌落测量，可根据细菌的种类，通过公知的方法实施。例如，制备被检样品的稀释液，用琼脂培养基培养该稀释液，对形成的菌落数进行测量即可。此时形成的菌落数为该琼脂培养基中培养的稀释液中所含的细菌的活菌数。因此，由菌落数与稀释倍率可求取被检样品中所含的细菌的活菌数。

就培养的条件而言，含有二氨基庚二酸的细菌为死菌时，为不含二氨基庚二酸的活菌的生长条件即可。被检样品含有2种以上的活菌时，也可使用选择性培养基等进行培养，测定各细菌的活菌数。例如，含有二氨基庚二酸的细菌为活菌时，通过不使该细菌生长，并使用不含二氨基庚二酸的活菌的生长条件、选择性培养基等，可选择性地对不含二氨基庚二酸的活菌进行定量。

作为本发明中使用的被检样品并无特别限定，例如可列举食品(包括健康食品)、医药品、化妆品、它们的原料等。被检样品的形态并无特别限定，为固体状、粉末状、膏状、胶状、凝胶状、药片状、液状的任一种形态均可。根据需要可将被检样品粉碎，供于二氨基庚二酸的定量、活菌的定量。

根据本发明的定量方法，可简便地对含有：含有二氨基庚二酸的细菌的食品、医药品、化妆品等或它们的原料中所含的含有二氨基庚二酸的细菌进行定量。本发明的定量方法无论含有二氨基庚二酸的细菌为死菌还是活菌，均可对上述样品中的该细菌进行定量。本发明的定量方法，例如在这些食品、医药品、化妆品、其原料等的品质管理等中有用。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这些实施例。

＜二氨基庚二酸的定量方法＞

将样品提供给酸水解，用氨基酸自动分析法分析分解液对二氨基庚二酸进行定量。

(1)分析仪器等

·全自动氨基酸分析仪(JLC-500/V2，日本电子株式会社制)

·分析管柱[LCR-6(5μm，4.0mm i.d.×120mm，日本电子株式会社制)]

(2)试剂

·2，6-二氨基庚二酸(DAP)(东京化成工业株式会社)

·20％盐酸(精密分析用，富士胶片和光纯药株式会社)(6mol/L盐酸)

·2-巯基乙醇(富士胶片和光纯药株式会社)

·盐酸(氨基酸自动分析用，富士胶片和光纯药株式会社)

·柠檬酸三钠二水合物(氨基酸自动分析用，富士胶片和光纯药株式会社)

·辛酸[正辛酸](氨基酸自动分析用，富士胶片和光纯药株式会社)

·硫代二甘醇(氨基酸自动分析用，富士胶片和光纯药株式会社)

·柠檬酸钠缓冲液(H-01～H-04)(日本电子株式会社)

·日本电子用茚三酮显色溶液试剂盒-II(富士胶片和光纯药株式会社)

(3)试液的制备

·20％盐酸(含有0.04％2-巯基乙醇)

向20％盐酸500mL中加入2-巯基乙醇0.2mL并混合。

·柠檬酸钠缓冲液(pH2.2)

称量柠檬酸三钠二水合物980g，加入离子交换水约3500mL进行溶解。加入36％盐酸约700mL及辛酸5mL并搅拌，用20％盐酸调整至pH2.2后，用离子交换水调整至5000mL(原液)。加入原液500mL、硫代二甘醇100mL及离子交换水4000mL并搅拌，用20％盐酸调整至pH2.2后，用离子交换水调整至5000mL。

·0.01mol/L盐酸

向离子交换水400mL中加入20％盐酸80mL并搅拌(1mol/L盐酸)。用水将1mol/L盐酸稀释100倍。

(4)分析用样品的制备

1)将供于分析的样品取至水解用试验管，加入20％盐酸(含有0.04％2-巯基乙醇)20mL，在减压下进行封管。

2)于110℃下对封管后的试验管水解24小时。

3)冷却后，开管，用离子交换水将水解液定容至100mL。

4)分配该溶液10mL，用蒸发仪进行减压浓缩，使其干燥固化。

5)用柠檬酸钠缓冲液(pH2.2)5mL溶解残留物，将用膜过滤器(0.45μm)过滤后的物质作为试验溶液。

6)精密称量DAP 0.0475g，溶解至0.01mol/L盐酸中后，定容至100mL，作为标准原液(浓度：2.5μmol/mL)。

7)用柠檬酸钠缓冲液(pH2.2)将标准原液稀释至25倍，作为标准溶液(浓度：0.1μmol/mL)。

8)将试验溶液及标准溶液供至以下所示氨基酸自动分析仪的条件，由峰的高度对DAP进行定量。

(5)基于氨基酸自动分析仪的分析

通过以下所示分析条件分析通过上述方法制备的样品，实施DAP的定量。

(分析条件)

管柱：LCR-6(5μm，4.0mm i.d.×120mm，日本电子株式会社制)

流速：流动相0.42mL/min，反应液0.22mL/min

流动相：柠檬酸钠缓冲液(H-01～04)(日本电子株式会社)

反应液：日本电子用茚三酮显色溶液试剂盒-II(富士胶片和光纯药株式会社)

注入量：30μL

流动相中的柠檬酸钠缓冲液H-01～H-04的比例(vol％)及管柱温度示于表1。

(氨基酸自动分析仪时间程序)

[表1]

(6)计算方法

由以下公式计算DAP含量(mg/100g)。

[数学式1]

A：试验溶液的峰高

B：标准溶液的峰高

50：上述(4)的1)～5)操作时的试验溶液的稀释倍率

W：样品采集量(g)

0.1：标准溶液的浓度(μmol/mL)

190.20：DAP的分子量

上述式的A及B中的峰为DAP的峰。

(7)定性确认

以(5)记载的方法对试验溶液与标准溶液进行分析，以与DAP标准溶液的洗脱保留时间一致的峰作为DAP。

＜试验例1＞

调查Lactobacillus pentosus SAM2336(以下称乳酸菌S-PT84)的菌数与二氨基庚二酸(DAP)量的相关性。乳酸菌S-PT84为保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程中心专利生物保藏中心(NITE-IPOD)(保藏编号：FERM BP-10028)，识别为Lactobacillus pentosus SAM 2336的乳酸菌。

培养乳酸菌S-PT84，测定各培养时间的乳酸菌S-PT84菌数与DAP量。

评价时，从0小时起至24小时为止，每3小时进行一次采样。在DAP量的测定中，对在规定时间采样的培养液150g进行杀菌、离心分离后，去除上清液，将向沉淀物中加水制备至1.5g的物质(100倍浓缩液)作为DAP量测定样品，通过上述二氨基庚二酸的定量方法，测定DAP量。此外，就乳酸菌S-PT84菌数的测定而言，从供于DAP量的测定的培养液中采集乳酸菌S-PT84，DAPI染色后，于显微镜下测定菌数。另外，关于菌数测定的样品，由于使用100倍浓缩液时，菌凝集，无法正确地测定，因此将培养液的测定结果上乘以100的值作为菌数。以这些结果为基础，研究DAP量与乳酸菌S-PT84菌数的相关性。

图1A及图1B为表示基于培养时间的乳酸菌S-PT84的菌数的经时性变化(图1A)及二氨基庚二酸量的经时性变化(图1B)的图表。图1A的纵轴的乳酸菌的菌数为每培养液1g的乳酸菌S-PT84菌数上乘以100换算成每100倍浓缩液的乳酸菌S-PT84菌数的值。图1B的纵轴的DAP量(mg)为每100倍浓缩液100g的值。图2为表示图1A的纵轴的乳酸菌S-PT84菌数(个/g)与图1B的纵轴的DAP量(mg/100g)的相关性的图表。如图1A所示乳酸菌S-PT84菌数从3小时起开始增加，21小时以后观察不到菌数的变化。此外，DAP量也表现相同的倾向(图1B)。进一步，对乳酸菌S-PT84菌数与DAP量的结果进行绘制，通过近似直线确认其相关性时，确认具有R²值高达0.984的相关性(图2)。

＜试验例2＞

为了确认乳酸菌S-PT84原料重量与DAP量的相关性，用上述二氨基庚二酸的定量方法实施每单位乳酸菌S-PT84原料重量的DAP的定量。本试验于3天中反复实施1次。

作为乳酸菌S-PT84原料，使用乳酸菌S-PT84的死菌粉末(大洋香料株式会社制，死菌1.8×10¹¹个/g含有品)。该死菌数为基于原料厂商的测定值。

表2为每单位乳酸菌S-PT84原料重量的DAP实测值及分析结果。将表2所示结果绘制而成的图表示于图3(横轴：样本量(乳酸菌原料)(g)，纵轴：分析结果平均(DAP量)(mg))。图3所示图表，表示乳酸菌S-PT84原料重量与该原料中所含的DAP量的相关性。

对乳酸菌S-PT84原料重量与DAP量的直线性进行确认时，确认R²值高达0.999的直线性(表2及图3)。由图3中所示数据求取的回归公式为y＝3.0331x 0.0099。

[表2]

在试验例1中，在对各培养时间的乳酸菌S-PT84菌数与DAP量的相关性进行评价时，在乳酸菌S-PT84菌数与DAP量的近似直线中，确认R²值为0.984的高相关性。由于DAP含于乳酸菌S-PT84的细胞壁中，因此认为伴随乳酸菌S-PT84的增殖DAP量也增加。在试验例2中，对乳酸菌S-PT84原料重量与DAP量的相关性进行研究时，明确了R²值高达0.999的直线性。由此可知，通过测定DAP量，可计算含有DAP的细菌的菌数或该细菌原料的调配量。

此外，在上述二氨基庚二酸的定量方法的(4)分析用样品的制备的2)中，除了将水解时间设置为8、16、32或40小时以外，以与上述相同的方法评价乳酸菌S-PT84菌数与DAP量的相关性。即使将水解时间设置为8、16、32或40小时，也得到与实施24小时水解时相同的结果，可确认乳酸菌S-PT84原料得到充分水解。

＜实施例1＞

在乳酸菌S-PT84原料中，使用与试验例2相同的乳酸菌S-PT84的死菌粉末(大洋香料株式会社制，死菌1.8×10¹¹个/g含有品)。

作为不含DAP的细菌，使用双歧杆菌。将上述乳酸菌S-PT84原料及双歧杆菌原料混合，制备每100g含有4.1×10¹²个乳酸菌S-PT84(死菌)的样品。

通过上述的二氨基庚二酸的定量方法对样品中的DAP量进行定量。此外，以下述方法制作校准曲线，由样品中的DAP量求取乳酸菌S-PT84菌数。

(校准曲线的制作)

采集样品制备中使用的乳酸菌S-PT84原料0.1、0.3、0.5、0.8、1.0g，依照上述二氨基庚二酸的定量方法的(4)～(7)中记载的工序对DAP进行定量，制作DAP量与乳酸菌S-PT84原料的重量的回归直线。将该回归直线作为校准曲线使用。另外，将上述二氨基庚二酸的定量方法的(4)的5)变更为以下5’)。

5’)用柠檬酸钠缓冲液(pH2.2)20mL溶解残留物，将用膜过滤器(0.45μm)过滤后的物质作为试验溶液。

(乳酸菌S-PT84的菌数换算)

使用上述制作的校准曲线(回归直线)的斜率及截距，通过以下公式，计算每100g样品的乳酸菌S-PT84原料的重量。

(每100g样品的乳酸菌S-PT84原料的重量)(g/100g)＝(E-截距)/斜率

E：DAP含量(mg/100g)

通过以下公式，将每100g样品的乳酸菌S-PT84原料的重量换算为每100g样品的乳酸菌S-PT84菌数。

每100g样品的乳酸菌S-PT84菌数(个/100g)＝M×T

M：每100g样品的乳酸菌S-PT84原料的重量(g/100g)

T：单位乳酸菌S-PT84原料的重量的菌数(个/g)

[菌数(个/g)为乳酸菌S-PT84的菌数(死菌)(个/g)，原料厂商测定值]

用上述方法求取每100g样品的乳酸菌S-PT84的菌数，为4.2×10¹²个/100g。

实施例1中制备的样品中，除乳酸菌S-PT84以外含有双歧杆菌原料。对双歧杆菌原料实施DAP量的确认。结果未从双歧杆菌原料中检测出DAP。

就乳酸菌S-PT84原料而言，将菌体在培养基(含有酵母萃取物及葡萄糖)上培养后，固液分离并对其沉淀部分部进行冷冻干燥，经过粉碎从而原料化。由于考虑培养基混入该原料，因此针对乳酸菌S-PT84的培养基原料，实施DAP量的确认。结果从任何样本中均未检测出DAP。由以上结果认为，在实施例1中，由样品检测出的DAP均来自乳酸菌S-PT84。

由以上结果可知，含有DAP的细菌的菌数可以DAP量为指标来测定。

＜实施例2＞

作为不含DAP的细菌使用双歧杆菌的Bifidobacterium bifidum(B.bifidum)NBRC100015株(以下称双歧杆菌NBRC100015)。双歧杆菌NBRC100015可由独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程中心获取(NBRC No.NBRC 100015)。为了与乳酸菌S-PT84原料混合，向双歧杆菌NBRC100015的培养液中添加脱脂粉乳制备粉末化的双歧杆菌NBRC100015原料(活菌3.4×10¹⁰个/g含有品)。另外，双歧杆菌NBRC100015原料的活菌数为基于一般财团法人日本食品分析中心的测定值。乳酸菌S-PT84原料使用与试验例2相同的乳酸菌S-PT84的死菌粉末(大洋香料株式会社制，死菌1.8×10¹¹个/g含有品)。

将乳酸菌S-PT84原料及双歧杆菌NBRC100015原料混合，制备每100g含有4.1×10¹²个乳酸菌S-PT84(死菌)、2.6×10¹²个双歧杆菌NBRC100015(活菌)的样品。

通过上述二氨基庚二酸的定量方法对样品中的DAP量进行定量。以与实施例1相同的方法，由DAP量与乳酸菌S-PT84原料的重量制作校准曲线，由样品中的DAP量求取乳酸菌S-PT84菌数。

由DAP量求取乳酸菌S-PT84菌数时，样品中的乳酸菌S-PT84的菌数为4.5×10¹²个/100g。针对所使用的双歧杆菌NBRC100015原料实施DAP量的确认时，未从该原料中检测出DAP。

样品中的双歧杆菌NBRC100015的活菌数，由使用琼脂培养基培养该样品后，测量菌落的方法(培养法)求取。样品中的双歧杆菌NBRC100015的活菌数为2.0×10¹²个/100g。

＜实施例3＞

作为不含DAP的细菌，使用乳酸菌Lactobacillus acidophilus(L.acidophilus)NBRC13951株(以下称乳酸菌NBRC13951)。乳酸菌NBRC13951可由独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程中心获取(NBRC No.NBRC 13951)。为了与乳酸菌S-PT84原料混合，向乳酸菌NBRC13951的培养液中添加脱脂粉乳制备粉末化的乳酸菌NBRC13951原料(活菌1.0×10⁸个/g含有品)。另外，乳酸菌NBRC13951原料的活菌数为基于一般财团法人日本食品分析中心的测定值。

乳酸菌S-PT84原料使用与试验例2相同的乳酸菌S-PT84的死菌粉末(大洋香料株式会社制，死菌1.8×10¹¹个/g含有品)。

将乳酸菌S-PT84原料及乳酸菌NBRC13951原料混合，制备每100g含有4.1×10¹²个乳酸菌S-PT84(死菌)、7.7×10⁹个乳酸菌NBRC13951(活菌)的样品。

通过上述二氨基庚二酸的定量方法对样品中的DAP量进行定量。以与实施例1相同的方法，由DAP量与乳酸菌S-PT84原料的重量制作校准曲线，由样品中的DAP量求取乳酸菌S-PT84菌数。

由DAP量求取乳酸菌S-PT84菌数时，样品中的乳酸菌S-PT84的菌数为4.7×10¹²个/100g。针对所使用的乳酸菌NBRC13951原料实施DAP量的确认时，未从该原料中检测出DAP。

关于样品中的乳酸菌NBRC13951的活菌数，由使用琼脂培养基培养该样品后，测量菌落的方法(培养法)求取。样品中的乳酸菌NBRC13951的活菌数为7.4×10⁹个/100g。

“关于食品卫生检查设施等的检查等业务的管理的实施”(平成九年(1997年)四月一日)(卫食第一一七号)的“精度管理的普通指南”的“III微生物学检查的精度管理”中记载有，添加的已知的微生物的回收率至少确保70％至120％的标准(“2精度管理所需要的目标值的设定”的“(1)回收率等的确认”)。在实施例1～3的乳酸菌S-PT84及实施例2、3的双歧杆菌NBRC100015与乳酸菌NBRC13951中，样品的菌数的测定值相对于由各原料的定量值计算的样品中的菌数(计算值)在上述范围内，可以说本发明的定量方法在细菌的定量上具有充分的精度。