禽腺病毒4型、8型双重荧光定量PCR快速检测试剂盒及方法与流程

禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法。


背景技术：

2.禽腺病毒(fowl adenovirus，fadv)是一种无囊膜线性双股dna病毒，基因组约40～45kb。1950年由van den ende分离得到第一株禽腺病毒。因后续研究中该病毒可从鸡胚中分离，命名为鸡胚胎致死孤儿(chicken embryo lethal orphan,celo)病毒。禽腺病毒目前在世界范围内广泛流行，且在我国各地也均发现相关报道。主要危害家禽导致心包积液、肝脏包涵体肝炎等症状。
3.据相关研究显示该病i群血清型多达12种，在我国境内鸡群种该病毒主要以血清4型(fowl adenovirus type 4，fadv-4)、血清8型(fowl adenovirus type8，fadv-8)型为主。其中fadv-4致死率高达70％～90％，因其首次报道的地点得名鸡安卡拉病。病理解剖结果主要表现在心脏肿大并包含有大量黄色积液，且积液呈透明胶冻样渗出物；fadv-8致死率较低或不致死，病理解剖结果主要以肝脏肿大、出血、边缘钝圆、质脆伴随大小不一的白色坏死灶为主。
4.禽腺病毒血清型众多且感染后持续排毒，导致该病的防控难度大大提高。根据各地的相关流行病学调查结果表明各血清型间存在一定量的混合重感染，给养禽业造成重大损失。因此，建立快捷、特异分型鉴定检测方法对日常养殖或者流行病学监测十分重要。
5.禽腺病毒分型诊断方法有普通pcr检测、巢式pcr检测(nested-pcr)、荧光定量pcr检测、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)等检测方法。这些检测方法各有优劣，普通pcr检测技术从分子平出发，具有一定准确性，易于开发，但灵敏度较其他检测方法弱，故临床检测中较难进行推广；巢式pcr灵敏度虽高于普通pcr，但总检测时间较长；lamp检测法极为灵敏，故对实际操作的技术要求就进一步提高，实验中对ep管的开盖容易形成气溶胶污染，干扰实验结果准确性，使得该方法假阳性问题较为突出。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
7.本发明的第一目的在于提供一种禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒，包括：
8.fadv-4f：5'-cgctttaaccgtggtcg-3'(seq id no.1)；
9.fadv-4r：5'-ttcaagtagagggaggtaacaa-3'(seq id no.2)；
10.fadv-8f：5'-acccactattacacccaacac-3'(seq id no.3)；
11.fadv-8r：5'-aaatcgtaactacggaagacg-3'(seq id no.4)。
12.所述快速检测试剂盒可同时检测fadv-4与fadv-8，满足实际使用中对fadv-4与fadv-8的疾病快速检测与流行情况监控，其中针对fadv-8的检测还能同时囊括fadv-8a和fadv-8b两种分型，有助于全面区分样本沾染的病毒种类。
13.进一步，所述快速检测试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸预混液、sybr green
ꢀⅰ
染料。所述快速检测法是利用sybr greenⅰ染料实现的荧光定量pcr，由于不需要制备探针，使得检测成本大幅降低，更有利于大规模的样品检测。
14.进一步，所述dna聚合酶、缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸预混液是采用宝日医生物技术(北京)有限公司的premix taq
tm
预混酶提供。
15.进一步，所述快速检测方法还包括阳性质粒标准品。所述阳性质粒标准品的制备步骤包括：
16.使用如seq id no.1、seq id no.2所示的引物对或如seq id no.3、seq id no.4所示的引物对进行病毒基因组的扩增；
17.将扩增产物与载体连接，经鉴定正确即为阳性质粒标准品。
18.本发明的第二目的在于提供利用上述快速检测试剂盒进行非疾病诊断用途的检测方法，包括扩增反应程序为：50℃维持3min；95℃维持3min；95℃维持15s，55℃维持15s，72℃维持45s，40个循环。基于该扩增反应程序，感染禽腺病毒4型的样品和感染禽腺病毒8型的样品会具有不同的标准曲线。禽腺病毒4型(fadv-4)的标准曲线为y＝-4.244lgx 49.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝72.13％。禽腺病毒8型(fadv-8)的标准曲线为y＝-3.39lgx 39.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝79.66％。
19.本发明包括以下有益效果：
20.结果显示，fadv-4标准曲线为y＝-4.244lgx 49.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝72.13％；fadv-8标准曲线为y＝-3.39lgx 39.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝79.66％。不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，其中x轴为质粒标准品的拷贝数，y轴为循环阈值，符合预期结果。当ct值小于35、熔解曲线出现单一峰值且tm值为82.5～83.5℃之间时，判定该样品为fadv-8阳性；当ct值小于35、熔解曲线出现单一峰值且tm值为86.5～87.5℃之间时，判定该样品为fadv-4阳性；当ct值小于35、熔解曲线出现双峰且一个峰tm值为82.5～83.5℃之间、另一个峰tm值为86.5～87.5℃之间时，判定该样品为fadv-4、fadv-8混合阳性；其他情况均判定为阴性。灵敏性结果显示，该方法能检测出fadv-4阳性与fadv-8阳性的最低拷贝数分别为1.38
×
104copies/μl与1.38
×
103copies/μl。特异性结果显示，该方法对dfv、h9无扩增，对fadv-11、h7、ndv及ibv虽有扩增，但其ct值均大于35循环，结果判定为阴性，其表明该方法能特异性扩增fadv-4与fadv-11特异性扩增，具有良好特异性。重复性试验结果显示，组内变异系数均少于1.5％，组间变异系数均少于3.0％，重复性良好。该检测方法具有耗时短、成本低的优势，具有良好的市场应用前景。
附图说明
21.图1是实施例3中fadv-4的标准曲线图；
22.图2是实施例3中fadv-8的标准曲线图；
23.图3是实施例4中特异性试验的扩增曲线图；
24.图4是实施例4中特异性试验的溶解曲线图；
25.图5是实施例5中pcr体系退火温度优化的扩增曲线图；
26.图6是实施例5中pcr体系退火温度优化的溶解曲线图；
27.图7是实施例5中pcr体系引物浓度优化的扩增曲线图；
28.图8是实施例5中pcr体系引物浓度优化的溶解曲线图；
29.图9是实施例6中敏感性试验的扩增曲线图；
30.图10是实施例6中敏感性试验的溶解曲线图。
具体实施方式
31.下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1、引物的设计。
33.根据ncbi上已公布禽腺病毒4型(fadv-4)与禽腺病毒8型(fowl adenovirus type 8a、fowl adenovirus type 8b，fadv-8a、fadv-8b)基因序列，结合来自广东省内的gddl-4、gdb3-8a、gdt08-8b毒株全基因组。结合ncbi收集已有的相关基因序列分析比对后发现fadv-8a与fadv-8b基因序列相近，因此分别设计可特异性扩增fadv-4与fadv-8的检测引物如seq id no.1至seq id no.4所示。
34.实施例2、质粒标准品的制备。
35.(1)目的片段的pcr扩增以及纯化。
36.分别使用引物fadv-4f、fadv-4r与fadv-8f、fadv-8r对病毒基因组进行pcr扩增，普通pcr反应体系如表1：
37.表1常规pcr反应体系
[0038][0039]
将以上各组分混匀于反应管内，反应程序设定参数：94℃持续4min；94℃持续30s，55℃持续30s，72℃持续30s，35个循环；72℃，10min。所述上游引物为fadv-4f时，所述下游引物为fadv-4r；同理，当所述上游引物为fadv-8f时，所述下游引物为fadv-8r。
[0040]
pcr反应结束后，将产物加入含goldview的1％琼脂糖凝胶中，电泳30min，凝胶成像系统中进行目的条带切除，使用omega胶回收试剂盒进行目的产物回收。具体步骤如下：
[0041]
(1-1)将单一目的测dna条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量(提前记录离心管重量)。
[0042]
(1-2)向胶块中加入1倍体积buffer pg(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，以此类推)。
[0043]
(1-3)50℃水浴温浴，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。
[0044]
(1-4)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μl buffer ps，13000rpm，离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0045]
(1-5)将步骤(1-3)所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0046]
(1-6)向吸附柱中加入450μl buffer pw，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0047]
(1-7)13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
[0048]
(1-8)将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl buffer eb，室温放置2分钟。13000rpm离心1分钟。收集dna溶液即为目的片段，-20℃保存。
[0049]
(2)目的片段的连接。
[0050]
参照takara公司pmd18-t vector载体使用说明书，进行目标序列与载体连接反应，反应体系如表2所示：
[0051]
表2连接反应体系
[0052][0053]
混匀后，置pcr仪中16℃作用4h，-20℃保存。
[0054]
(3)重组质粒的转化。
[0055]
(3-1)将步骤(2)获得的连接产物分别加入50μl感受态细胞中，做好编号。同时设立pmd18-t质粒的阳性对照，以及不加入任何质粒dna的感受态细胞对照。
[0056]
(3-2)将连接产物和感受态细胞轻轻混匀后，立即冰浴30min，然后42℃热激90s，然后立即冰浴10min。
[0057]
(3-3)每管加入400μl新鲜lb液体培养基，在37℃恒温箱中缓慢摇动培养45min。
[0058]
(3-4)取100μl菌液涂布于含amp(100μg/ml)的1.5％(w/v)lb琼脂平板中，37℃倒置培养12～16h。
[0059]
(4)质粒的筛选与鉴定。
[0060]
挑取生长良好的单菌落接种在500μl含氨苄青霉素(amp)的lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中振荡培养4～6h，进行pcr鉴定，见表3：
[0061]
表3 pcr鉴定反应体系
[0062][0063]
将以上各组分混匀后，执行pcr程序：94℃持续4min；94℃持续30s，55℃持续20s，72℃持续30s，34个循环；72℃持续10min。所述上游引物为fadv-4f时，所述下游引物为fadv-4r；同理，当所述上游引物为fadv-8f时，所述下游引物为fadv-8r。
[0064]
将pcr鉴定为阳性且条带大小正确的菌液送往生工生物工程有限公司进行测序分析。
[0065]
(5)阳性质粒的提取。
[0066]
将测序结果为正确的菌液进行扩大培养，使用takara质粒提取试剂盒进行质粒提取，具体步骤如下：
[0067]
(5-1)大肠杆菌的培养。从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养(培养12-16小时，培养超过16小时细胞将难以裂解，质粒收量也会随之降低)。
[0068]
(5-2)取1～4ml的过夜培养菌液，12000rpm离心2分钟，弃上清。
[0069]
(5-3)用250μl的solutionⅰ(含rnase a)充分悬浮细菌沉淀。
[0070]
(5-4)加入250ul的solutionⅱ轻轻上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
[0071]
(5-5)加入350ul的4℃预冷的solutionⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
[0072]
(5-6)室温12000rpm离心10分钟，取上清。
[0073]
(5-7)将试剂盒中的spin column安置于collection tube上。
[0074]
(5-8)将操作步骤(5-6)的上清液转移至spin column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。
[0075]
(5-9)将500ul的buffer wa加入spin column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。
[0076]
(5-10)将700ul的buffer wb加入spin column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。
[0077]
(5-11)重复操作步骤(5-10)一次。
[0078]
(5-12)重新将spin column安置于collection tube上，12000rpm离心1分钟，除尽残留洗液。
[0079]
(5-13)将spin column安置于新的1.5ml的离心管上，在spin column膜的中央处加入50ul的灭菌水或elution buffer，室温静置1分钟。
[0080]
(5-14)12000rpm离心1分钟洗脱dna。
[0081]
(6)阳性标准质粒的制备。
[0082]
使用超微量分光光度计测量质粒浓度并根据基因拷贝数(copies/ul)＝6.02
×
10
23
×
质粒浓度(ng/ul)
×
10-9
/[质粒大小(bp)
×
660]，计算出其基因拷贝数，再以10倍倍
比稀释至101copies/ul，-20℃保存备用。
[0083]
实施例3、标准曲线的构建。
[0084]
取阳性质粒进行引物浓度优化，选择108、107、106、105、104共5个浓度梯度作为模板进行实时荧光定量pcr扩增反应。反应体系如表4所示：
[0085]
表4双重实时荧光定量pcr体系
[0086][0087]
将以上各组分混匀后，执行扩增反应程序：50℃维持3min；95℃维持3min；95℃维持15s，55℃维持15s，72℃维持45s，40个循环。熔解曲线阶段：1.6℃/s，95℃，15s；1.6℃/s，60℃，60s；0.2℃/s，95℃，15s。
[0088]
结果如图1、图2所示，根据结果可以绘制fadv-4的标准曲线为y＝-4.244lgx 49.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝72.13％；fadv-8标准曲线为y＝-3.39lgx 39.05；相关系数r2＝0.998；扩增效率e＝79.66％。可得见不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，其中x轴为质粒标准品的拷贝数，y轴为循环阈值，符合预期结果。当ct值小于35、熔解曲线出现单一峰且tm值为82.5～83.5℃之间时，判定该样品为fadv-8阳性；当ct值小于35、熔解曲线出现单一峰且tm值为86.5～87.5℃之间时，判定该样品为fadv-4阳性；当ct值小于35、熔解曲线出现双峰且一个峰tm值为82.5～83.5℃之间、另一个峰tm值为86.5～87.5℃之间时，判定该样品为fadv-4、fadv-8混合阳性；其他情况均判定为阴性。
[0089]
实施例4、特异性试验。
[0090]
对已建立禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测方法进行禽腺病毒11型(fowl adenovirus type 11，fadv-11)、禽流感病毒h7、h9亚型(h7、h9)、新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)、鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，ibv)以及禽黄病毒(duck flavivirus，dfv)的cdna进行实时荧光定量pcr扩增，验证特异性。其结果见图3和图4，图中标号1为fadv-4、fadv-8混合样品，标号2为ibv样品，标号3为dfv样品，标号4为h7样品，标号5为h9样品，标号6为ndv样品，标号7为fadv-11样品。如图所示，该快速检测方法对dfv、h9无扩增，对fadv-11、h7、ndv及ibv虽有扩增，但其ct值均大于35循环，结果判定为阴性，表明其具有良好特异性。
[0091]
实施例5、双重实时荧光定量pcr体系优化。
[0092]
a)退火温度优化。
[0093]
分别使用54.2℃、55.1℃、56.2℃、57.3℃、58.4℃、59.3℃、60.1℃、60.7℃作为该双重实时荧光定量pcr方法的退火温度，其余条件不变，探究该反应体系的最佳退火温度。结果如图5和图6所示，在58℃左右时fadv-4与fadv-8熔解曲线峰值比较一致，其他温度下二者二者峰值差距较大或峰值较低，因此选择58℃为该反应体系最佳退火温度。
[0094]
b)引物浓度优化。
[0095]
将fadv-4与fadv-8的特异性引物1:1混合均匀，在反应体系中分别加入4μl、3.5μl、3μl、2.5μl、2μl、1μl、0.5μl混合引物，其他条件不变，探究该反应体系的最佳引物浓度。结果如图7和图8所示，当加入的混合引物的体积为3μl时，fadv-4与fadv-8熔解曲线峰值比较一致，其他体积下二者峰值差距较大或峰值较低，因此3μl为加入该体系的混合引物最佳体积。
[0096]
实施例6、敏感性试验。
[0097]
取拷贝数为108、107、106、105、104、103、102、101的fadv-4与fadv-8标准质粒1:1混合后作为模板进行实时荧光定量pcr扩增，以此来测定该双重实时荧光定量pcr检测出来的阳性质粒最低拷贝数。结果见图9和图10。图中标号a曲线为1.38
×
108copies/μl；标号b曲线为1.38
×
107copies/μl；标号c曲线为1.38
×
106copies/μl；标号d曲线为1.38
×
105copies/μl；标号e曲线为1.38
×
104copies/μl；标号f曲线为1.38
×
103copies/μl；标号g曲线为1.38
×
102copies/μl；标号h曲线为1.38
×
101copies/μl；标号i曲线为阴性对照。如图所示，fadv-4的熔解温度(tm)为87℃，fadv-8的熔解温度(tm)为83℃，该方法能检测出fadv-4阳性与fadv-8阳性的最低拷贝数为分别1.38
×
104copies/μl与1.38
×
103copies/μl。
[0098]
实施例7、重复性试验。
[0099]
对3份批次的质粒分别做3个批内重复和3个批间重复的实时荧光定量pcr扩增，比较ct值和tm值的变化情况，验证该方法的稳定性，以批内变异系数评价该方法的稳定性。结果如表5、6所示：
[0100]
表5 fadv-4重复性检验结果
[0101][0102]
表6 fadv-8重复性检验结果
[0103][0104]
组内变异系数均少于1.5％，组间变异系数均少于3.0％，表明该方法具有良好的重复性。
[0105]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在
不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。