多发性内分泌瘤变综合征1的治疗的制作方法

1.本技术涉及肿瘤治疗领域。具体而言，本技术涉及men1缺陷肿瘤的治疗方法和治疗药物。


背景技术：

2.多发性内分泌瘤变综合征1(multiple endocrine neoplasia syndrome 1，men1)是一种由men1基因突变引起的肿瘤综合征。men1经常在胰腺神经内分泌肿瘤(pannets)，胶质瘤，室管膜瘤，甲状旁腺肿瘤等[1-3]中发生变异。men1的种系失活突变改变导致men1综合征，这是一种以多个神经内分泌肿瘤为特征的自体显性肿瘤[4]。men1综合征导致的肿瘤组织类型较多，因此很难通过早期筛查进行控制。men1的突变导致异常定位和功能失活，包括几种信号蛋白调节(tgf-β，nf-κb，akt)[5，6]。然而，men1失活的肿瘤机制在很大程度上是未知的，目前没有有效的治疗方法可用于靶向men1缺陷肿瘤或防止men1综合征患者发展神经内分泌肿瘤。
[0003]
参考文献
[0004]
1.lemmens，i.，et al.，identification of the multiple endocrine neoplasia type 1(men1)gene.the european consortium on men1.hum mol genet，1997.6(7)：p.1177-83.
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6.wang，y.，et al.，the tumor suppressor protein menin inhibits akt acttvation by regulating its cellular localization.cancer res，2011.71(2)：p.371-82.


技术实现要素：

[0010]
在本文中，发明人通过基于crispr-cas9的合成致死筛选，确定抑制dhodh为治疗含有men1突变的肿瘤的目标，并且以活性氧化磷酸化为主。此外，来氟米特(leflunomide)成功地防止了具有生殖系men1突变的小鼠的神经内分泌肿瘤的发展，为men1综合征的治疗提供了新的见解。
[0011]
在一些实施方案中，本文提供线粒体氧化磷酸化抑制剂在制备用于治疗或预防
men1缺陷性肿瘤的药物中的用途。本文的研究已经发现抑制线粒体中的氧化磷酸化能够杀死men1缺陷细胞，由此确认线粒体氧化磷酸化抑制剂可以用于治疗或预防men1缺陷性疾病。线粒体氧化磷酸化抑制剂可以通过测量添加候选药物测试线粒体氧化磷酸化进行。线粒体氧化磷酸化抑制剂可以是抑制参与线粒体氧化磷酸化的基因或其表达产物的任何适当药物，例如小分子化合物，sirna，rnai，和/或crispr-cas系统，以及其它本领域适当的其它抑制剂如核酸适体和抗体(例如单克隆抗体)。
[0012]
在一些实施方案中，本文所述线粒体氧化磷酸化抑制剂包括例如抑制men1缺陷导致的氧化磷酸化增强的抑制剂，例如抑制dhodh基因或其表达产物的抑制剂，例如抑制参与线粒体氧化磷酸化的基因或其表达产物的抑制剂，例如抑制ndufv1、ndufa11、ndufb11、cox5a、fdx1和/或sdhd基因或其表达产物的抑制剂。
[0013]
在一些实施方案中，本文所述抑制剂包括例如抑制dhodh、ndufv1、ndufb11和/或sdhd基因或其表达产物的抑制剂。
[0014]
在一些实施方案中，本文所述抑制剂包括例如特异性抑制基因表达的sirna，rnai，和/或crispr-cas系统。
[0015]
在一些实施方案中，本文所述抑制剂包括例如抑制基因或其表达产物的小分子化合物。
[0016]
本文所述抑制剂可以通过本领域已知的各种方法制备和测试，例如可以通过已知的方法设计针对特定基因序列的sirna，rnai，和/或crispr-cas抑制剂，以及针对特定基因表达产物的抗体等。
[0017]
在一些实施方案中，本文所述抑制剂包括例如fccp，寡戈米辛a，鱼藤酮和/或来氟米特。本文的研究已经显示men1缺陷细胞氧化磷酸化增强，men1缺陷细胞系依靠氧化磷酸化生存，对线粒体中的氧化磷酸化抑制剂如fccp，寡戈米辛a，鱼藤酮和/或来氟米特更敏感。因此，通过线粒体氧化磷酸化抑制剂能够特异性杀死men1缺陷细胞，从而用于预防或治疗men1缺陷疾病如肿瘤。
[0018]
在一些实施方案中，本文提供的线粒体氧化磷酸化抑制剂可以是不影响嘧啶合成途径的代谢物产生的那些抑制剂。本文的研究已经显示嘧啶合成途径的下游代谢物在men1野生型和men1缺陷细胞中之间没有显著差异，抑制dhodh参与的线粒体呼吸链功能能够特异性杀死men1缺陷肿瘤细胞。
[0019]
在本文中，men1缺陷性疾病包括各种由于men1基因缺陷导致的疾病，尤其涉及由于men1基因缺陷导致的肿瘤。men1基因缺陷可以通过现有技术已知的方法检测，包括例如检测来自受试者样品的men1基因的核酸序列或其表达产物。在一些实施方案中，men1缺陷性肿瘤可以包括例如men1缺陷导致的神经内分泌肿瘤，胶质瘤，室管膜瘤，甲状旁腺肿瘤，men1综合征。
[0020]
在一些实施方案中，本文提供获得用于预防或治疗men1缺陷肿瘤的药物的方法，包括测定细胞在候选药物存在下的线粒体氧化磷酸化活性，例如在men1野生型和/或men1缺陷细胞中测定候选药物存在下的线粒体氧化磷酸化活性。在一些实施方案中，线粒体氧化磷酸化活性降低(例如在men1缺陷细胞中特异性降低)表明所述药物可以用于治疗或预防men1缺陷性肿瘤。在一些实施方案中，所述方法还可以包括测定细胞在候选药物存在下嘧啶合成代谢活性，例如在men1野生型和/或men1缺陷细胞中测定候选药物存在下的嘧啶
合成代谢活性。在一些实施方案中，候选药物优选是不影响嘧啶合成途径代谢的药物。
附图说明
[0021]
图1：a.基于crispr全基因组文库筛选方案；b.比较men1-u251-wt和men1-u251-ko细胞敲降dhodh后的细胞生长活力；c.比较来氟米特在men1-wt和men1-ko细胞系中的ic50。
[0022]
图2：a.200μm来氟米特处理后，wt和ko细胞的乳清酸/二氢乳清酸比例；用200μm来氟米特或dmso培养men1-wt和men1-ko细胞48小时后b.ump、c.udp、d.dctp的相对代谢产物浓度。
[0023]
图3：a.cck-8法检测wt-对照组、wt-sindufv1组、ko-对照组、ko-sindufv1组细胞活力；b.cck-8法检测wt-对照组、wt-sindufb11组、ko-对照组、ko-sindufb11组细胞活力；c.cck-8法检测wt-对照组、wt-sisdhd组、ko-对照组、ko-sisdhd组细胞活力；d.fccp、oligomycin a、鱼藤酮在wt-men1和ko-men1细胞中的ic50值。
[0024]
图4：a.men1-wt和men1-ko细胞在不同浓度葡萄糖的培养基中培养49小时后的形态；b.不同浓度葡萄糖处理的men1-wt和men1-ko细胞产生atp的情况；c和d.通过seahorse监测细胞耗氧率(ocr)和细胞外酸化率(ecar)。
[0025]
图5：同位素标记的a.琥珀酸b.苹果酸c.柠檬酸d.乌头酸e.d-酮戊二酸f.甘油醛-3-磷酸g.甘油-3-磷酸h.丙酮酸i.乳酸。
[0026]
图6：a.men1敲除之后基因表达差异的火山图。蓝点表示下调基因(fold change＜0.5，fdr≤0.05)，红点表示上调基因(fold change＞2，fdr≤0.05)；b.men1-wt和men1-ko细胞中差异oxphos相关基因的热图；c.atac-seq峰差异火山图(fdr≤0.05)，蓝点表示men-ko细胞的衰减峰，红点表示增强峰；d.启动子可及性变化与基因表达变化的相关性；e.men1-wt和men1-ko细胞中atac-seq峰的分布特征；f.atac-seq差异峰的go分析；g.蛋白免疫印迹试验检测men1-wt、men1-ko、men1-ko-reconstituted细胞中dhodh的表达水平。
[0027]
图7：a-c.比较来氟米特对men1-u251-wt和men1-u251-ko细胞皮下移植瘤的抑制作用；d.men1敲除小鼠构建示意图以及整体给药试验流程；e-f.来氟米特对men1突变小鼠自发瘤移植瘤的抑制作用；g.来氟米特在men1突变小鼠中预防给药的给药方案；h.比较来氟米特不同给药方案对men1突变小鼠自发肿瘤的抑制作用。
具体实施方式
[0028]
我们首先用crispr/cas9的方法构建了men1敲除的u251细胞(men1-ko)。构建过程中使用的是px458质粒(addgene，#48138)，该质粒经bsmbi酶切(pxx458-bsmbi)后，将目的sgrna序列(3
′‑
tgtagatctcctcgtcttcc-5
′
)连入px458-bsmbi质粒，经转化，测序后，提取连接正确的质粒，采用流式细胞仪分选出单克隆细胞，经sanger测序和western blot验证，得到men1敲除成功的单克隆细胞，即为men1-ko。我们基于全基因组crispr/cas9文库筛选技术，在men1野生型(men1-wt)和men1缺失性(men1-ko)的胶质瘤细胞系u251中分别感染全基因组crispr/cas9文库病毒，经过2ug/ml的嘌呤霉素筛选后得到感染成功的细胞，留存文库sgrna数量的500倍的细胞(76441*500＝3.822
×
107)记为t0细胞。同时取3.822
×
107细胞继续传代培养，细胞经过14个倍增后，在两组细胞中分别收集3.822
×
107数量的存活细胞进行二代测序获得筛选数据，使用mageck算法对crispr筛选数据做质量控制，比对分析得到
了与men1具有协同致死效应的26个基因，经过细胞生物学实验验证表明dhodh-men1的协同致死效果最优，接下来进行对dhodh-men1的协同致死效果进行体内外实验验证和机制阐释。
[0029]
对于体外实验，首先，我们在men-wt和men1-ko细胞中分别敲降dhodh后，光学显微镜下观察两组细胞的生存状态的变化，拍照记录该变化。详细来说，敲降dhodh的方法如下，将men-wt和men1-ko细胞提前1天接种于六孔板中，次日将2.5μl sirna、1μl转染试剂opi-mem培养基配制成200μl的体系转染于细胞中(sirna合成于上海吉玛制药技术有限公司，具体序列如下：sidhodh-1-f：gccacgggagaugagcguutt；sidhodh-1-r：aacgcucaucucccguggctt；sidhodh-2-f：ccguggacggacuuuauaatt；sidhodh-2-r：uuauaaaguccguccacggtt)。其次，我们使用cck8和克隆形成实验检测men1-wt和men1-ko细胞中分别敲除dhodh后的增殖变化。此外，我们使用dhodh常见的抑制剂来氟米特(sigma，phr1378)同时处理两组细胞，计算来氟米特在两组细胞中的ic50，以此来评估两种细胞对来氟米特的敏感性。
[0030]
进一步我们使用甲醇提取men-wt和men1-ko细胞中的亲水代谢物质，进而利用靶向代谢组学(该检测在清华大学代谢平台进行)检测两组细胞中嘧啶代谢通路中常见代谢物的变化。此外，我们通过敲降筛选结果中的其他氧化磷酸化相关基因ndufv1、ndufb11、sdhd判断抑制其表达是否会影响men1-ko细胞的存活(详细操作步骤同上，所涉及的的序列如下：sindufv1-1-f：gcgacacgacagcacccaatt；sindufv1-1-r：uugggugcugucgugucgctt；sindufv1-2-f：ggugacugguacaagacaatt；sindufv1-2-r：uugucuuguaccagucacctt；sindufb11-1-f：ccgaggacgaaaacuuguatt；sindufb11-1-r：uacaaguuuucguccucgggt；sindufb11-2-f：cgugggaugggaugaaagatt；sindufb11-2-r：ucuuucaucccaucccacgct；sisdhd-1-f：aguuguuacugacuauguutt；sisdhd-1-r：aacauagucaguaacaacutg；sisdhd-2-f：gggcuuugcuauuucaacutt；sisdhd-2-r：aguugaaauagcaaagcccag)。同时，我们使用seahorse实验检测men-wt和men1-ko中细胞氧化磷酸化和糖酵解能力的变化。同时我们检测了多种常见的氧化磷酸化抑制剂在men-wt和men1-ko细胞中的ic50，以此评估两种细胞系对氧化磷酸化抑制剂的敏感性。此外，我们在men-wt和men1-ko细胞的培养基中加入4mm 13c6-glucose，对应的对照组加入非标记的葡萄糖，用甲醇提取不同组别的代谢物质，使用标记代谢组学方法检测各组中代谢物质的差异，绘制各组中葡萄糖代谢流；
[0031]
为了进一步解释导致dhodh-men1的协同致死效果的分子机制，我们提取了men1-wt和men1-ko细胞中的rna，进行rna-seq分析(海洛普斯公司)和atac-seq分析(北京泛生子生物科技有限公司)，对两组细胞中的基因转录变化，染色质开放性变化进行了综合分析。
[0032]
在体内实验中，我们首先进行了移植瘤模型的实验验证。将men1野生型(men1-wt)和men1缺失性(men1-ko)的u251细胞分别接种到裸鼠(balb/c)皮下，通过灌胃的方式对两组小鼠分别给予来氟米特药物，给药剂量为20mg/kg，每三天给药一次，每次给药时同时测量小鼠的体重和肿瘤体积，给药7次后，处死小鼠，取下肿瘤组织，比较各组肿瘤的体积，重量的变化。
[0033]
为了更好的模拟men1综合征的发生发展过程，我们通过crispr/cas9敲除技术，构建了men1-/
小鼠(c57bl/6j)，据报道这种小鼠常在9-12个月时于多个部位自发产生肿瘤，包括胰腺，甲状旁腺，胃等。我们取出men1-/
小鼠自发形成的肿瘤，并进行多次传代稳定后，
将自发瘤等量地接种到了40只小鼠皮下，其中20只通过灌胃的方式对小鼠给予来氟米特药物，给药剂量为20mg/kg，另外20只给予对照溶剂(1％的羧甲基纤维素)，7次给药后，处死小鼠，比较各组中肿瘤发生率的变化，以及两组中肿瘤的大小。
[0034]
此外，我们评估了来氟米特预防men1-/
小鼠自发瘤的效果。我们将men1-/
小鼠分为四组，分别是野生型对照组：给予正常粮食喂养；突变型对照组：给予正常粮食喂养；突变型持续给药组：从6月龄开始持续喂养含100mg/kg来氟米特的粮食；突变型间歇给药组：从3月龄开始每隔28天喂养含100mg/kg来氟米特的粮食28天。每组小鼠的数量，年龄基本一致，小鼠年龄在19个月时，处死四组小鼠，取下胰腺组织，做he染色和cyn，sga染色，评估每组小鼠胰腺神经内分泌肿瘤的发生率。
[0035]
实验结果
[0036]
1.全基因组crispr筛选发现men1缺乏与dhodh抑制剂合成致死
[0037]
为了寻找men1的合成致死基因，我们u251-men1 / (men1-wt)和u251-men1-/-(men1-ko)细胞中进行基于全基因组的crispr的敲除筛选，以发现能够选择性杀死men1缺乏的细胞的潜在基因靶点(图1a)。在19114个基因中，我们确定了26个对men1-ko细胞生存能力至关重要的基因。
[0038]
为了验证筛选出的最优候选基因，我们选择了在sgrna计数上发生显著变化的基因。我们发现，针对这些基因的进行sirna敲降可以有效地减少men1-wt和men1-ko细胞中的mrna水平。其中敲降dhodh可显著抑制men1缺乏的肿瘤细胞。与men1-wt细胞相比，大多数men1-ko细胞在sirna抑制dhodh后死亡(图1b)。接下来，我们试图探讨men1缺乏是否会影响对dhodh抑制剂的敏感性。来氟米特是一种有效的dhodh抑制剂，已经进行了临床评估。来氟米特在men1-ko细胞系中的ic50为32μm，比men1-wt细胞低4倍。当men1在men1-ko细胞中重建时，来氟米特的敏感性显著降低(图1c)。因此，上述结果表明，dhodh是men1特异性合成致死靶标。
[0039]
2.合成致死的相互作用并不是由于嘧啶代谢物的合成不足。
[0040]
dhodh催化了嘧啶新生生物合成、合成和转化的第四个酶步骤，dhodh对生物活性和代谢具有重要的意义。在这种情况下，我们推测合成致死性是否由于men1-ko细胞中嘧啶代谢物不足。lc/ms结果认为，尽管来氟米特处理降低了men1-wt和men1-ko细胞中乳清酸/二氢乳清酸的比值(图2a)，但包括ump在内的嘧啶合成途径的下游代谢物两组(图2b-d)之间没有显著差异。从数据中推测，men1和dhodh的合成致死作用不是由于嘧啶合成的代谢物不足造成的，dhodh可能发挥其他功能，对men1产生合成杀伤作用。
[0041]
3.抑制氧化磷酸化有助于men1和dhodh合成致死。
[0042]
由于嘧啶生物合成途径不是合成致死的决定因素，我们推测涉及其他途径。dhodh不仅催化了嘧啶生物合成，而且与线粒体呼吸链功能密切相关。接下来，我们尝试探讨线粒体氧化呼吸是否影响men1和dhodh的合成致死相互作用。细胞活力检测表明，与wt细胞相比，敲降线粒体复合物相关基因ndufv1、ndufb11、sdhd可以杀死更多的men1-ko细胞(图3a)。此外，我们发现men1-ko细胞对线粒体中的氧化磷酸化抑制剂包括fccp(men1-wt vs men1-ko的ic50，2.56μm vs 1.53μm)，寡霉素(ic50 men1-wt vs men1-ko，10.29μm vs 0.06μm)和鱼藤酮(ic50 men1-wt vs men1-ko，1.08nm vs 0.41nm)更敏感(图3b)。综合起来，这些结果表明，对oxphos的抑制有助于合成杀伤力，dhodh是这种相互作用的关键枢纽。
[0043]
4.men1缺乏导致线粒体功能障碍。
[0044]
线粒体是人体的能量工厂，这对葡萄糖代谢非常重要。接下来，我们探讨了men1-wt和men-ko细胞在线粒体功能上的区别。我们惊奇地发现，与men1-wt细胞相比，men1-ko细胞可以在葡萄糖浓度较低的培养基中存活(men1-ko细胞，1mm vsmen1-wt细胞，4mm)(图4a)。在不同葡萄糖浓度下，men1-ko细胞的atp产量要高得多(图4b)。这一现象启发了我们进一步研究线粒体的功能。
[0045]
由于氧化磷酸化(oxphos)是线粒体中发生的重要代谢途径，我们进一步研究了oxphos是否在men1缺乏的细胞中的线粒体中发生改变。为此，我们使用seahorse测量线粒体呼吸速率和糖解。与men1-wt细胞相比，men1-ko细胞的耗氧率(ocr)显著提高，细胞外酸化率(ecar)明显降低，表明糖解功能降低，氧化磷酸化(oxphos)增强(图4c，d)。这些数据，进一步表明oxphos在men1缺陷细胞中得到了显著增强。
[0046]
此外，oxphos与葡萄糖代谢相关，因此使用13c6葡萄糖作为示踪剂分析men1沉默对葡萄糖代谢的影响。标记代谢物百分比显示，包括丙酮酸盐脱氢酶(pd)通路和丙酮酸盐类羧化酶(pc)通路，大多数tca中间体含量在men1-ko细胞中较高，特别是琥珀酸和柠檬酸在pd和pc通路中都高得多(图5a，b)。此外，柠檬酸盐、α酮戊二酸在pc通路中含量较高(图5c-e)。这些结果证实，men1-ko细胞具有增加的tca代谢。通过同位素分析，我们发现m 3甘油醛3-磷酸盐、m 3甘油3-磷酸、m 3丙酮酸盐和m 3乳酸同位素在men1-ko细胞中减小(图5f-i)。这表明，men1沉默可以诱导糖酵解代谢到tca代谢，促使它对dhodh抑制剂更为敏感，从而损害线粒体呼吸链功能。
[0047]
5.men1缺乏引起的代谢重新编程是由于oxphos相关基因的上调。
[0048]
接下来，我们试图阐明由men1缺陷引起的代谢重新编程的分子机制。我们对men1-wt和men1-ko细胞进行了转录组测序，发现两个细胞系之间有1353个基因存在显著表达差异，men-ko细胞中有538个基因上调(fold change＞2，fdr≤0.05)和815个基因向下调节(fold change＜0.5，fdr≤0.05)(图6a)。在敲除men1后，我们观察到大多数oxphos相关基因上调(图6b)。
[0049]
为了描述染色质可达性和men1缺陷细胞中基因表达的调控机制，我们进行了atac-seq实验，以分析染色质可达性，并确定了29870个atac-seq差分峰(fdr≤0.05)，表示men1-wt和men1-ko细胞之间的开放染色质区域的差异。在这些差分峰中，men1-ko组中12，387个增强，有17，438个减小(图6c)。在已识别的差分峰中，我们观察到基因表达水平和启动子可及性之间的正相关(皮尔森相关系数r＝0.497，p＜0.001)(图6d)。此外，约38％的增强峰和20％的弱化峰在基因启动区被富集，这表明增强峰与基因转录启动更相关(图6e)。共有3294个基因具有差异启动子可及性(fdr≤0.05)和差异表达水平(fdr≤0.05)。
[0050]
此外启动子可及性增加和表达水平增加的基因在与线粒体功能相关的go分析中被富集(图6f)。此外，由于dhodh在oxphos中的关键作用我们发现敲除men1会导致dhodh表达上调，在men1-ko细胞中过表达men1，dhodh表达下调(图6g)。这些数据再次表明，men1-ko细胞系依靠氧化磷酸化生存。
[0051]
6.来氟米特抑制体内men1缺陷肿瘤的生长
[0052]
为了验证来氟米特在体内的抗肿瘤治疗效果，我们在裸鼠中建立了肿瘤异种移植模型。我们将men1-wt和men1-ko细胞系在小鼠中接种，通过灌胃的方式给药20毫克/千克来
氟米特，每3天一次。7次给药后，观察到来氟米特对men1-ko组生长抑制作用明显。在来氟米特的作用下，men1-ko异种移植的响应比men1-wt异种移植的响应好2.5倍(图7a-c)。综上关于肿瘤异种移植模型的数据表明，来氟米特抑制men1缺失的移植瘤的生长。
[0053]
先前的研究表明，涉及胰岛、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺皮质和垂体等肿瘤通常在16个月时出现在men1突变的小鼠中。为了研究来氟米特是否可以用于治疗men1敲除小鼠的自发肿瘤，我们使用crispr/cas9技术构建men1-/ 小鼠。men1-/ 小鼠用正常食物喂养，出现的肿瘤通过cga和syn阳性确认其神经内分泌来源。这种肿瘤组织通过两个传代后等量被接种到小鼠皮下。在接种后的第三天，20只小鼠通过灌胃给予20毫克/千克的来氟米特，每3天一次，其他20只小鼠被给予玉米油作为对照组。经过7个周期，对照组肿瘤发生率(肿瘤体积小于10立方毫米或无肿瘤生长，则记录为无肿瘤，否则记录为肿瘤)是100％(20/20)，显著高于来氟米特治疗组(30％，6/20)(图7d-e)，且来氟米特治疗组肿瘤重量低于对照组5.9倍(来氟米特治疗组与对照组，0.07克对0.43克)(图7f)。在治疗过程中，两组小鼠的体重没有显著差异。综上，我们的数据显示来氟米特可以减少men1突变鼠的自发肿瘤的体积，而不会造成显著的体重减轻。
[0054]
7.来氟米特可以防止men1敲除小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤
[0055]
为了探讨来氟米特能否预防men1敲除小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤，我们定制了含有100mg来氟米特/kg饲料的小鼠饲料。所有小鼠被分成4组，包括对照组(men1-wt或用正常食物喂养的men1-ko小鼠)和来氟米特治疗组(持续治疗组，从6月龄开始连续给予100mg/kg，共6个月；间隔治疗，从3月龄开始，每2个月灌胃100mg/kg，连续28天，共5次)(图7g)。所有小鼠在19个月龄时被处死，并收集胰腺作进一步分析。men1敲除导致胰腺神经内分泌肿瘤的发展(men1-wt-正常喂养vs men1-ko-正常喂养，0％，0/20 vs 65.5％，19/29)。在来氟米特治疗后，肿瘤的数量明显减少，连续治疗组比间隔治疗组(12.9％，4/31 vs 5％，1/20)效果更好(图7h)。