一种人类胸腺间充质基质细胞体外诱导活化及其应用的制作方法

1.本发明涉及间充质干细胞应用领域，具体涉及一种人类胸腺间充质基质细胞体外诱导活化及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞是一种非造血多能祖细胞及多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，间充质干细胞来源广泛，根据其来源分别称为骨髓mscs、脐带mscs、脂肪mscs、mscs等；这些不同来源的mscs都具有相似的细胞膜标志和自我更新、多向分化能力，但由于其来源不同，也各具特点；2019年际细胞与基因治疗学会间充质和干细胞委员会明确区分了间充质干细胞与间充质基质细胞，前者指的是具有自我更新和分化功能的干细胞群，后者指具有显著分泌、免疫调节和归巢特性的干细胞群。本专利研究的是来自人类胸腺的间充质基质细胞，称之为胸腺间充质基质细胞，胸腺基质细胞(thymicstromalcell,tsc)是指胸腺内的非胸腺细胞，主要由上皮细胞(thymiepithelialcell，tec)、成纤维细胞(thymicfibroblastcell,tfc)、巨噬细胞(thymicmacrophage,tm)、树突状细胞(dendriticcell，dc)组成。近来还发现有肥大细胞(mastcell)和b细胞(thymicbcell,tbc)。
3.人类胸腺间充质基质细胞来源于人类胸腺组织，是构成胸腺微环境的重要组成部分，其在胸腺的活性直接关系到t淋巴细胞的分化成熟，这就与人体的抗感染、抗肿瘤、免疫调节、自身耐受等免疫能力密切相关。因此，人类胸腺间充质基质细胞因其取材组织的优势，而具备更强的免疫调节能力，这是来源于骨髓、脐带等组织的mscs不可比拟的人类胸腺间充质基质细胞来源于人类胸腺组织，是构成胸腺微环境的重要组成部分，其在胸腺的活性直接关系到t淋巴细胞的分化成熟，这就与人体的抗感染、抗肿瘤、免疫调节、自身耐受等免疫能力密切相关，因此，研究人类胸腺间充质基质细胞的应用十分有必要。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种人类胸腺间充质基质细胞体外诱导活化方法，包括以下步骤：
5.s1、人类胸腺间充质基质细胞的分离、培养、传代和鉴定：
6.s1-1、取材：取因心脏病手术过程中需暴露手术视野而切除或胸腺本身疾病而切除的胸腺组织作为培养材料；
7.s1-2、人类胸腺间充质基质细胞的分离、原代培养、传代：
8.将用作培养材料的胸腺组织剪切成小块，经酶消化后制成细胞悬液，进行贴壁、换液、调整细胞浓度，并使用dmem营养液在37℃、5％co2的环境中培养，观察记录生长情况；根据细胞的生长情况，进行半量换液；
9.s1-3、人类胸腺间充质基质细胞的鉴定：
10.(1)细胞形态学和生长特性：观察人类胸腺间充质基质细胞是否具有具有间充质
干细胞典型的形态和生长特性；(2)细胞表面标志鉴定：荧光抗体和流式细胞术分析细胞表面标志；(3)细胞诱导分化能力鉴定：在体外诱导条件下人类胸腺间充质基质细胞均有多向分化能力，能分化为成骨细胞、脂肪细胞或成软骨细胞；(4)干性相关基因表达鉴定：采用荧光定量pcr方法，检测细胞sox2、nanog、oct4 mrna表达量；
11.s2、人类胸腺间充质基质细胞的体外诱导活化：
12.s2-1、人类胸腺间充质基质细胞体外诱导条件的选择和优化：
13.选择不同种类和剂量的细胞因子作用于细胞，分别于作用24、48和72小时三个时间点观察这些细胞因子对细胞增殖、凋亡的影响，观察细胞免疫活性相关分子mrna和蛋白在诱导前后的变化，最后确定最佳的诱导条件(细胞因子种类及作用时间)；
14.s2-2、体外细胞因子诱导的人类胸腺间充质基质细胞生物学特性的鉴定指标：
15.(1)收集诱导的人类胸腺间充质基质细胞，提取rna，进行荧光定量pcr和转录组基因芯片分析，明确诱导后细胞的mrna表达变化；(2)通过流式细胞术和蛋白转印技术鉴定相关免疫活性分子蛋白水平的变化特征；(3)通过体外细胞学方法观察诱导活化的人类间充质基质细胞免疫抑制活性；
16.s3、体外诱导的人类胸腺间充质基质细胞临床应用价值分析：
17.s3-1、人类疾病动物模型的制作：
18.按照文献公认的方法加以改良制作小鼠银屑病疾病模型、炎症性肠病疾病模型等；
19.s3-2、诱导前后人类胸腺间充质基质细胞及其衍生物的疗效分析：
20.分别通过局部涂抹和腹腔注射方式给药，观察对病变的治疗作用并对作用机制进行研究分析。
21.优选地，人类胸腺间充质基质细胞体外诱导条件的选择和优化。
22.优选地，体外细胞因子诱导的人类胸腺间充质基质细胞生物学特性的鉴定。
23.优选地，本发明公开了一种人类胸腺间充质基质细胞体外诱导活化的应用，人类胸腺间充质基质细胞经小分子诱导剂活化后在衰老胸腺组织重塑、自身免疫性疾病治疗上的应用。
24.本发明利用手术废弃的人体组织材料，制备人类胸腺间充质基质细胞，经体外诱导，使其具有一定的免疫调节活性，具有治疗临床相关疾病的潜力，如银屑病、皮疹、退行性骨关节病变、多发性硬化、重症肌无力等难治性自身免疫病。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
26.实施例
27.一种人类胸腺间充质基质细胞体外诱导活化方法，
28.s1、人类胸腺间充质基质细胞的分离、培养、传代和鉴定：
29.s1-1、取材：取因心脏病手术过程中需暴露手术视野而切除或胸腺本身疾病而切除的胸腺组织作为培养材料；因心脏病手术过程中需暴露手术视野而切除或胸腺本身疾病
而切除的胸腺组织，属医疗废弃组织，取材符合医学伦理，不增加患者损伤，便于通过研究单位医学伦理委员会审核。
30.s1-2、人类胸腺间充质基质细胞的分离、原代培养、传代：
31.将用作培养材料的胸腺组织剪切成小块，经胰酶、胶原酶联合消化后制成细胞悬液，进行贴壁、换液、调整细胞浓度，并使用dmem营养液在37℃、5％co2的环境中培养，观察记录生长情况；根据细胞的生长情况，进行半量换液；
32.s1-3、人类胸腺间充质基质细胞的鉴定：
33.(1)鉴定细胞形态特征：观察人类胸腺间充质基质细胞具有纺锤形的间充质干细胞典型形态和漩涡样生长特性；(2)细胞表面标志鉴定：收集生长状态良好的人类胸腺间充质基质细胞，调节细胞浓度至1
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106/ml；取100μl人类胸腺间充质基质细胞分别加入2μl荧光标记单抗，流式细胞术检测细胞表面标志。结果显示为95％以上细胞表达cd105、cd73、cd90、cd44、cd29、hla-a等典型mscs标记物，不表达/低表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79a、cd19等造血细胞标记物；(3)体外诱导分化的鉴定：在体外诱导条件下人类胸腺间充质基质细胞能分化为成骨细胞、脂肪细胞或成软骨细胞。如诱导成骨分化的具体内容包括：纤维粘连蛋白包被培养板，以2
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104/cm2的细胞密度接种细胞，在dmem低糖完全培养基5％co2、37℃环境中培养，待细胞融合度达到60％以上时，加入成骨诱导分化完全培养基继续培养，隔天半量换液，3周后经茜素红染色，显微镜下观察钙结节形成；(4)干性基因表达鉴定：采用荧光定量pcr方法，检测细胞sox2、nanog、oct4mrna表达量。
34.s2、人类胸腺间充质基质细胞的体外诱导分化：
35.s2-1、人类胸腺间充质基质细胞体外诱导条件的选择和优化：
36.选择白细胞介素2、白细胞介素6、γ干扰素等对人胸腺间充质基质细胞进行诱导，选择出γ干扰素为细胞体外诱导较为理想的细胞因子。采用50、100、200、400ng/ml的γ干扰素进行体外诱导，分别在培养24、48、72小时对细胞功能性分子、细胞增殖能力、细胞免疫抑制活性进行分析。具体分析方法包括：(1)荧光定量pcr法检测ido、pdl1、hla-dr、cd54、cd80、cd86等分子mrna的表达；(2)流式细胞术检测pdl1、hla-dr、cd54、cd80、cd86等分子在细胞膜表面的表达；(3)蛋白电泳和转印技术分析细胞pdl1、hla-dr、cd54、cd80、cd86等分子蛋白表达水平；(4)采用cck8试剂盒检测细胞增殖能力；根据上述结果综合分析，确定出最佳体外诱导条件。
37.s2-2、体外细胞因子诱导的人类胸腺间充质基质细胞生物学特性的鉴定指标：
38.(1)人类胸腺间充质基质细胞的转录组学分析：收集诱导前后的人类胸腺间充质基质细胞，分别提取rna，进行转录组基因芯片分析，以较全面了解细胞因子诱导对人胸腺间充质基质细胞免疫活性相关分子表达的变化；(2)人类胸腺间充质基质细胞对t细胞活化的抑制作用分析：将体外诱导活化的人胸腺间充质基质细胞与活化t细胞共培养，采用cck8法分析t细胞增殖；采用流式细胞术分析t细胞活化分子cd69和cd25在cd4 t细胞和cd8 t细胞表面表达的变化；采用多因子检测的流式细胞分析法，分析共培养前后细胞因子水平的变化(包括il-2、il-4、il-6、il-10、il-13、il-17、il-22和ifnγ)。
39.s3、体外诱导的人类胸腺间充质基质细胞临床应用价值分析：
40.s3-1、人类疾病动物模型的制作：
41.以小鼠银屑病模型的制作为例。首先将小鼠背部皮肤脱毛，采用咪喹莫特(imq)乳
膏涂抹法建立小鼠银屑病皮肤模型，根据药物涂抹部位病变情况(皮肤红斑、鳞屑及其厚度)进行评分，根据皮肤病变严重程度给予0-12级评分。
42.s3-2、诱导前后人类胸腺间充质基质细胞及其衍生物的疗效分析：
43.在模型小鼠疾病进展期，分别通过皮肤局部用药和小鼠腹腔注射给予一定剂量的体外细胞因子诱导的胸腺间充质基质细胞，观察病程缩短，病变减轻。
44.本发明利用手术废弃的人体组织材料，制备tmscs，经体外诱导，使其具有一定的免疫调节活性，具有治疗临床相关疾病，如银屑病、皮疹、退行性骨关节病变、多发性硬化、重症肌无力等难治性自身免疫病的潜力，同时，tmscs因其取材组织的优势，而具备更强的免疫调节能力。
45.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。