纳米短肽DRF3在药物、NK细胞载体和生物医学的应用的制作方法

纳米短肽drf3在药物、nk细胞载体和生物医学的应用
技术领域
1.本发明涉及自组装短肽技术领域，更具体的是涉及自组装短肽在生物学、纳米医学、化妆品及保健品中的应用。


背景技术：

2.短肽在自然界中无处不在。它们被发现为激素、信息素、抗菌素、抗真菌剂在先天免疫系统、毒素和杀虫剂。但没有人认真认为肽可以作为支架水凝胶材料有用。自1990年在酵母蛋白中发现一个非常有趣的重复片段后，已经发生了显著的变化。现在人们认识到，由20种天然氨基酸制成的自组装肽具有真正的材料特性。目前，许多不同的应用已经发展从这些简单的和设计的自组装肽支架水凝胶，并在商业上提供。例子包括：(1)真正的3d组织细胞培养不同的组织细胞和各种干细胞，(2)修复和再生医学以及组织工程，(3)3d组织打印，(4)持续释放小分子，生长因子和单克隆抗体，(5)加速伤口愈合皮肤和糖尿病溃疡以及即时止血应用程序。
3.分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。近几年来，手性自组装短肽，已经发展成为一种新兴的纳米生物材料。它是一种仿ecm的生物支架纳米材料，能够模仿ecm的部分功能，从而影响细胞迁移、增殖、分化等生物学行为，可以作为细胞三维培养的基质材料，同时它在创伤修复、组织损伤修复等方面均有一定的作用。
4.自然杀伤细胞(natural killer cells，nk)是先天免疫系统重要的免疫细胞，是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，充当免疫反应的调节剂，nk细胞具有很强的免疫调节功能，可以通过直接杀伤肝星状细胞而具有抗纤维化活性，当机体受到外源性感染和肿瘤细胞侵袭时，nk细胞被活化，具有增殖和杀伤活性，能很好地清除受炎症所累的坏死细胞及肿瘤细胞，nk细胞通过表达激活和抑制受体信号的平衡，识别和杀死应激、转化或病毒感染的细胞，并分泌各种效应分子，nk细胞受到激活后，自身也分泌促进迁移的活性因子，而在个体差异、细胞亚群差异、以及nk细胞是否被激活等因素下，趋化因子受体的种类和水平具有很大的不同。如何为nk细胞创造一个良好的三维微环境并激活nk细胞、使nk细胞死亡率降低和增加nk细胞活性、制备成为活性更强、免疫原性更强、释放时间更久的nk疫苗是我们要解决的关键问题之一。
5.人体内dc分为淋巴系dc(lymphoid dc)和髓系dc(myeloid dc)，后者dc即为大多数dc的来源。淋巴系dc由胸腺中的前体细胞分化发育而来.活化后主要释放大量ⅰ型干扰素(interferon 1，ifn1)，参与病毒免疫应答；髓系dc主要参与免疫应答的诱导和启动。人体正常条件下，绝大多数dc处于未成熟状态，位于非淋巴组织的上皮和多种实质器官，具有很强的抗原摄取、加工和处理能力，但其表达共刺激分子和主要组织相容性复合体ⅱ类分子(maior histocompatib ility complex classⅱmolecules，mhcⅱ)类分子、细胞间黏附分子(intercellular cell adhesion molecules，icam)的水平低。如何激活dc细胞，使细胞间信号传递活跃，制备成为免疫原性更强、释放时间更久的dc疫苗是我们要解决的问题之
二。
6.近年来随着化妆品的普及，化妆品深受广大年轻人的喜爱和关注，美白、抗衰老、抗皱等发展日益迅速它一直受到相关学科领域、特别是医学美容、化妆品科学、护肤保健及皮肤抗衰老等领域的高度重视和普遍关注。
7.众所周知，透明质酸是人类和其他哺乳动物结缔组织的基本成分之一。它是人体表皮、上皮和神经组织中广泛存在的一种物质。透明质酸赋予皮肤独特的抵抗力和保形性。缺乏透明质酸会导致皮肤衰弱，促进皱纹和瑕疵的形成。随着年龄的增长，人体组织中透明质酸的浓度趋于降低，从而削弱了其组织修复功能。随着逐渐衰老并反复暴露于紫外线下，表皮细胞减少了透明质酸的产生，并且衰老速度增加。由于这个原因，基于ha的制剂今天仍然被认为是市场上最好的表皮填充剂，因为它们没有皮肤过敏反应的风险。最初，基于透明质酸的第一种制剂以悬浮在凝胶中的颗粒或微球形式制备。然而，这些基于胶凝微球的填充剂具有随时间推移稳定性差的缺点，在注入皮肤后数月趋于化学降解。因此，随着时间的推移，需要频繁地重新注入填充剂，以维持修复和表皮生长的恒定。近来已经发现通过使用特定的交联剂使透明质酸经历合适的交联步骤的优点，因此基于交联透明质酸的填充剂被用于面部的美容治疗中。但是还是需要频繁注射，效果，稳定性和安全性一般。
8.如何构建一个生物相容性更好、真实模拟细胞生长、机械强度更大和成胶更快的细胞三维微环境，如何获得稳定、安全、效果更好，降低毒性小或无毒性的、降解抵抗力更强和原位激活胶原新生等的类似于交联与非交联玻尿酸用途的产品及如何建立一个dc和nk细胞的生物相容性好、毒性小、能独立增强体内免疫力、包裹性好的促成熟剂，为制备效果更好的疫苗是我们亟待解决的重大问题。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供纳米短肽drf3在药物、nk细胞载体和生物医学的应用。
10.本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种自组装短肽，其氨基酸序列为：
11.drf3：arg leu asp ile lys val glu phe arg leu asp ile lys val glu phe。
12.本技术的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，它们都可以与pbs混合后自组装为可注入的水凝胶，作为细胞的三维培养支架，该支架模拟了细胞外机制，不单单是作为一个物理支架，还促进了细胞的成熟及分化，其降解产物为氨基酸具有无毒性；还可以作为dc细胞的促成熟剂、增加nk的杀伤能力，可以用于制备nk疫苗；本发明以一种新的自组装短肽分别作为化妆品的制备、佐剂的一种新思路，从源头改变化妆品的含量，其降解产物为氨基酸，不仅能作为保湿剂、缓释剂、润滑剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂，还可以对皮肤的修复具有辅助的作用，相当于皮肤的养料，其降解产物为氨基酸，具有良好的生物相容性；本技术的一种新的自组装短肽，结合其物理性能和微观下的纳米结构，分别与透明质酸联合使用，制备成为比单独使用透明质酸效果更好、更稳定、安全性更好、对降解抵抗力更强、毒性更小的联合体系，短肽也可以作为单独的填充剂使用。
13.进一步的，自组装短肽的中的氨基酸为l型，d型或dl型中的一种或多种。
14.进一步的，自组装短肽的中的氨基酸均为l型。
15.进一步的，自组装短肽的碳端酰胺化。
16.进一步的，自组短肽形成二级结构，二级结构包括α螺旋、β折叠、β蜷曲和无规则卷曲中的一种或多种。
17.一种自组装短肽作为抗原的应用。
18.一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用。
19.一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种。
20.一种自组装短肽在制备抗瘤的药物中的应用。
21.一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用
22.一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用。
23.一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用。
24.一种自组装短肽作为主要成分用于制备医美产品或化妆品。
25.一种自组装短肽作为疫苗佐剂的应用。
26.一种自组装短肽的水凝胶。
27.所述的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
28.步骤1、将短肽加入水中配制成母液；
29.步骤2、向母液中加入离子或pbs制备成自组装短肽水凝胶。
30.进一步的，离子包括na

、mg
2
、k

、al
3
、ca
2
、zn
2
、fe
3
、fe
2
、h

、nh
4
、cl-、so
42-、no
3-、co
32-、ch3coo-、hco
3-、oh-、po
43-、hpo
42-、h2po
4-、hso
4-中的一种或多种。
31.进一步的，制备成的自组装短肽水凝胶的浓度为1ppm及以上。
32.更进一步的，制备成的自组装短肽水凝胶的浓度为1-10mg/ml。
33.具体的：将10mg自组装短肽加入1ml水中配置母液，再加入3ml pbs制备为自组装短肽水凝胶，浓度为2.5mg/ml，根据以上方法制备水凝胶，浓度可调整为1-10mg/ml。
34.含一种自组装短肽的水凝胶在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。
35.进一步的，一种生物医学材料，它包含所述的含一种自组装短肽的水凝胶。
36.本技术的技术方案中，在盐离子环境下触发短肽自组装，其中盐离子包括且不限于：na

、mg
2
、k

、al
3
、ca
2
、zn
2
、fe
3
、fe
2
、h

、nh
4
、cl-、so
42-、no
3-、co
32-、ch3coo-、hco
3-、oh-、po
43-、hpo
42-、h2po
4-、hso
4-等。
37.提供一种新型的自组装短肽，具有提高机体免疫力，抗肿瘤、抗感染的作用，作为药物、疫苗的佐剂。
38.提供一种新型的自组装短肽，负载药物、肿瘤疫苗、细胞、抗体、蛋白质，在体内持续稳定释放，增加药物的半衰期。
39.提供一种新型的自组装短肽，可作在化妆品、保健品中的成分之一。
40.本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。
41.原子力显微镜、冷冻扫描电镜下所形成的纳米纤维网状结构可应用于化妆品领域，作为其中的缓释剂、抗菌剂、持久保湿剂、润滑剂、流变调节剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂、稳定剂、缓冲剂等。
42.本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维，细胞能在其上进行三维劲附、生长，所以此自组装短肽可应用到人、动、植物细胞三维培养中。
43.本技术中，作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体的应用，可作为任何化合物的集合的载体及佐剂，所述的集合包含多种结构不同的化合物通过范德华力、氢键、疏水键等连接相互作用。其中所述的化合物具体而言包含且不限于天然存在的分子如：如糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸，包括dna和dna片段、rna和rna片段等，脂质、类固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖等或天然存在的分子类似物和衍生物或通过化学合成技术生成的小分子化合物。本发明所述的自组装短肽可以作为任意化合物组成的药物、大分子、蛋白质等的载体及佐剂。术语“核苷酸”或“核酸”指mrna、rna、crna、cdna或dna。该术语一般指长度至少10个碱基的聚合物形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的两种类型核苷酸的任一种)。该术语包括单链和双链形式的dna。
44.本技术中的“大分子”指相对分子质量在5000以上，甚至超过百万的生物学物质，如大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、siga、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种等。它与生命活动关系极为密切，由被认为单体的简单分子单位所组成。在溶液中有形成凝胶的物质。一般把相对分子质量超过一万的化合物称为大分子化合物或高分子化合物。它是由许多重复的结构单元组成，一般具有线状结构，有的具有枝状结构。许多具有重要生物作用的物质，如蛋白质和核酸等均属于这类化合物。
45.本技术中，所述“药物”只能影响机体生理、生化和病理过程，用以预防、诊断、治疗疾病和生育的化学物质，其中自组装短肽可作为药物的载体，所述“药物”作用类型具体而言包含且不限于：作用于传出神经系统药物(传出神经系统药、拟副交感神经药、胆碱受体阻断药、肾上腺素受体激动药、胆碱受体阻断药、肾上腺素受体激动药、肾上腺素受体阻断药)、作用于中枢神经系统药(镇静催眠药、抗癫痫药和抗惊厥药、抗帕金森病和治疗阿尔茨海默症药、抗精神失常药、镇痛药、解热镇痛抗炎药、麻醉药)、作用于循环系统及血液系统的药物(抗心律失常药、抗高血压药、抗慢性充血性心力衰竭药、抗动脉粥样硬化药、抗心绞痛药、影响血液及造血系统药)、作用于内脏系统药(利尿药和脱水药、镇咳、祛痰及平喘药、抗消化性溃疡及消化道功能调节药、作用于子宫平滑肌药)、作用于自体活性物质及内分泌系统药(肾上腺皮质激素药、甲状腺激素及抗甲状腺药、胰岛素及口服降血糖药、性激素药与避孕药)、化学治疗药(β－内酰胺类抗生素、氨基糖苷类及多占菌素类、大环内酯类、林可霉素类、万古霉素类、四环素类、氯霉素类、人工合成抗菌药、抗结核药、抗麻风药、抗菌药、抗病毒药、抗真菌药、抗寄生虫药、抗肿瘤药)、作用于免疫系统药(免疫抑制药、免疫增强药)。
46.本技术中，上述自组装短肽作为“药物”的载体，其中药物具体而言包括不限于(所述药物名称和化学名称皆具有一致性)：鸡卵白蛋白(ova)、肉毒素、酪胺、利血平、可卡因三环、卡巴胆碱、毛果芸香碱、烟碱、新斯的明、去甲肾上腺素、去氧肾上腺素、可乐定、肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴酚丁胺、沙丁胺醇、乙酰胆碱、氯贝胆碱、醋甲胆碱、槟榔碱、胆碱酯酶、青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林克拉维酸钾、哌拉西林钠他唑巴坦钠、头孢拉定、头孢曲松、庆大霉素、红霉素、阿奇霉素、克林霉素、复斱磺胺甲唑、诺氟沙星、莫
西沙星、甲硝唑、呋喃妥因、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、对氨基水杨酸钠、氨苯砜、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素b、阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦、利巴韦林、索磷布韦维帕他韦、替诺福韦二吡呋酯、艾滋病用药、氯喹、羟氯喹、青蒿素类药物、葡萄糖酸锑钠、吡喹酮、阿苯达唑、利多卡因、布比卡因、罗哌卡因、氯胺酮、丙泊酚、瑞芬太尼、七氟烷、罗库溴铵、氯化琥珀胆碱、维库溴铵、芬太尼、哌替啶、吗啡、普瑞巴林、对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、美沙拉秦(嗪)、青霉胺、别嘌醇、秋水仙碱、苯溴马隆、金刚烷胺、苯海索、多巴丝肼、普拉克索、溴隐亭、新斯的明、卡马西平、丙戊酸钠、苯巴比妥、拉莫三嗪、尼莫地平、倍他司汀、甘露醇、胞磷胆碱钠、尼可刹米、石杉碱甲、奋乃静、氯丙嗪、氟哌啶醇、舒必利、氨磺必利、奥氮平、利培酮、帕利哌酮、阿立哌唑、帕罗西汀、氟西汀、阿米替林、氯米帕明、地西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、坦度螺酮、碳酸锂、咪达唑仑、硝酸异山梨酯、硝苯地平、美西律、美托洛尔、地高辛、卡托普利、缬沙坦、尼群地平、乌拉地尔、哌唑嗪、酚妥拉明、多巴胺、辛伐他汀、溴己新、羧甲司坦、复方甘草、氨茶碱、复方氢氧化铝、乳酶生、山莨菪碱、多潘立酮、开塞露、联苯双酯、地衣芽孢杆菌活菌、熊去氧胆酸、柳氮磺吡啶、呋塞米、氢氯噻嗪、甘油果糖、坦洛新(坦索罗辛)、非那雄胺、硫酸亚铁、右旋糖酐铁、维生素b12、腺苷钴胺、甲钴胺、阿司匹林、替格瑞洛、凝血酶、维生素k1、鱼精蛋白、肝素、华法林、尿激酶、达比加群酯、重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物、羟乙基淀粉、绒促性素、重组人生长激素、氢化可的松、甲泼尼龙、胰岛素、二甲双胍、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、阿卡波糖、利拉鲁肽、西格列汀、甲状腺片、左甲状腺素钠、甲巯咪唑、丙硫氧嘧啶、西那卡塞、丙酸睾酮、十一酸睾酮、黄体酮、甲羟孕酮、己烯雌酚、尼尔雌醇、维生素d2、氯苯那敏、苯海拉明、异丙嗪、雷公藤多苷、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、司莫司汀、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、巯嘌呤、羟基脲、氟尿嘧啶、依托泊苷、柔红霉素、羟基喜树碱、长春新碱、紫杉醇、顺铂、亚砷酸(三氧化二砷)、维a酸、卡培他滨、他莫昔芬、来曲唑、昂丹司琼、吉非替尼、利妥昔单抗、培美曲塞、维生素系列、葡萄糖酸钙、复方氨基酸18aa、脂肪乳氨基酸葡萄糖、口服补液盐、葡萄糖氯化钠、复方氯化钠、乳酸钠林格、葡萄糖、硫代硫酸钠、氯解磷定、碘解磷定、戊乙奎醚、亚甲蓝、纳洛酮、乙酰胺、青霉胺、破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、破伤风人免疫球蛋白、丝裂霉素、抗蛇毒血清、国家免疫规划用疫苗、泛影葡胺、碘化油、碘海醇、结核菌素纯蛋白衍生物、红霉素、咪康唑曲安奈德益康唑、莫匹罗星、鱼石脂、水杨酸、糠酸莫米松、维a酸、氯霉素、左氧氟沙星、阿托品、羟甲唑啉、垂体后叶注射液、避孕药、咖啡因等的其中一种或多种。
47.本技术中，作为细胞的“促成熟剂”，其中促成熟剂的含义应表现为：特化细胞，使细胞产生相应的蛋白、具备相关功能，如本技术中的dc细胞，加入短肽后培养dc细胞，dc细胞的cd86蛋白表达量升高，即认为dc细胞成熟。同样的，自组装短肽持续激活nk细胞，制备成为效果更好的nk、dc疫苗。
48.本技术中，drf3三维培养细胞，其中“细胞”包含不限于：dc细胞(树突状细胞)、nk细胞(自然杀伤细胞)、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、白细胞、吞噬细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、k淋巴细胞(k淋巴细胞)、胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞等，还包含不限于扁桃体、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、脑、胸、子宫颈、结肠直肠、食管、眼睛、头部和颈部、肾、肝、肺、淋巴结、神经系统、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、软组织、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫等器官中的原代及传代细胞的其中一种或多种。
49.以上所有细胞的种属包含不限于：包括单细胞真核生物如酵母和真菌以及多细胞真核生物如动物，非限制性例子包括无脊椎动物(例如，昆虫、腔肠动物、棘皮动物、线虫等)；真核寄生体例如，疟疾寄生体，如恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、蠕虫等)；脊椎动物(例如，鱼类、两栖类、爬行类、鸟、哺乳动物)；和哺乳动物(例如，啮齿类、灵长类如人类和非人灵长类)。
50.本技术中，术语“三维培养”是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞－载体复合物，改变或减少细胞在培养的过程贴壁的特性，使细胞在空间上获得更多的生存空间，减少细胞接触抑制，细胞附着与自组装短肽上，在显微镜下一般呈现为圆形。
51.本技术中，术语“类器官”是指类器官属于三维(3d)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。含有成体干细胞的组织样本、单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官其中类器官的种类包含且不限于：扁桃体、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、脑、胸、子宫颈、结肠直肠、食管、眼睛、头部和颈部、肾、肝、肺、淋巴结、神经系统、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、软组织、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫等其中至少一种。包含的肿瘤类器官主要有且不限于：结肠癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、淋巴瘤、神经癌、脑癌、皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、乳腺癌、骨癌眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、软组织肉瘤、中枢神经系统细菌细胞肿瘤(脑癌)、儿童颅外细菌细胞肿瘤、外角细菌细胞肿瘤、卵巢细菌细胞肿瘤、睾丸癌、心脏肿瘤、肝细胞癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤，胰腺神经内分泌肿瘤、肾细胞癌症、喉癌、白血病唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌(非小细胞、小细胞、肺泡肿和气管支气管肿瘤)、淋巴瘤、男性乳腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、间皮瘤、转移性鳞状颈部癌症(头颈部癌症)、口腔癌、多发性骨髓瘤/等离子细胞肿瘤、骨髓增殖性肿瘤、旁鼻窦癌、神经母细胞瘤、口腔癌、唇癌、咽癌、胰腺癌、胰岛细胞肿瘤、鼻腔癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体肿瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、t细胞淋巴瘤睾丸癌、鼻咽癌、食道癌、低咽癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾骨盆癌、尿道癌的过度性细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、血管肿瘤等的癌症所表现的肿瘤所提取的原代细胞的其中至少一种。
52.本技术中，术语“抗原”和其语法等同的表述(例如，“抗原性”)指可以由特异性体液免疫或细胞免疫的产物(如抗体分子或t细胞受体)特异性结合的化合物。抗原可以是任何类型的分子，例如包括半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如，低聚糖)、脂质和激素以及大分子如复杂糖(例如，多糖)、磷脂和蛋白质。常见类别的抗原包括但不限于病毒性抗原、细菌性抗原、真菌性抗原、原虫和其他寄生虫性抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫疾病、过敏和移植排异的抗原、毒素和其他杂项抗原其中至少一种。
53.本发明能作为胶原蛋白促进剂与胶原蛋白促进剂联用，具体而言如且不限于：抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠盐和抗坏血酸磷酸酯镁盐等抗坏血酸磷酸酯盐；抗坏血酸单硬脂酸酯、抗坏血酸单棕榈酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸四异棕榈酸酯等抗坏血酸脂肪酸酯类；3-o-乙基抗坏血酸、2-o-乙基抗坏血酸、鲸蜡基抗坏血酸、甘油抗坏血酸、己基甘油基抗坏血酸12等抗坏血酸醚类；抗坏血酸-2-葡糖苷等抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯类；
抗坏血酸硫酸酯、磷酸抗坏血酸生育酚酯等抗坏血酸衍生物；视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇等维生素a类；烟酰胺、谷胱甘肽、半胱氨酸、藏花酸、丝胶蛋白、牻牛儿醇(香叶醇)、甘油葡糖苷、乳铁蛋白、原花青素、泛酸、泛醇、大豆皂苷、白藜芦醇、异黄酮、辅酶q10、硫酸软骨素、乙酰葡糖胺、甘油磷脂酰胆碱、水解透明质酸、胶原蛋白肽、壳基质水解物、5'一磷酸腺苷、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸；以及朱槿、甘草叶、罗马甘菊、甘茶、山楂、凤仙花、莲叶、葛根、绣球菌、小球藻、维氏熊竹、牛蒡、山槐根、菜心、枇杷叶、紫苏、豌豆、桑叶、百里香、云杉、踊子草、鸭跖草、柏子仁、决明子、瓜蒌仁、地榆、苦参、柿、芍药、紫苏、陈皮、锦葵、生姜、母菊、草莓籽、当药、黄豆、小麦、人参、薏仁、防葵、小豆蔻、迷迭香、洋苏(鼠尾草)等具有胶原蛋白产生促进作用的植物提取物至少其中一种。
54.本发明可促透明质酸生成组装与透明质酸联合使用作为皮肤填充剂、抗皱，具体而言可联合的促生成剂如且不限于：透明质酸、胶原、抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠盐和抗坏血酸磷酸酯镁盐等抗坏血酸磷酸酯盐；抗坏血酸单硬脂酸酯、抗坏血酸单棕榈酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸四异棕榈酸酯等抗坏血酸脂肪酸酯类；3-o-乙基抗坏血酸、2-o-乙基抗坏血酸、鲸蜡基抗坏血酸、甘油抗坏血酸、己基甘油抗坏血酸等抗坏血酸醚类；抗坏血酸-2-葡糖苷等抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯类；抗坏血酸硫酸酯、磷酸抗坏血酸生育酚酯等抗坏血酸衍生物；视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇等维生素a类；烟酰胺、胡萝卜素、生育酚、生育三烯酚、硫酸软骨素、乙酰葡糖胺、甘油磷脂酰胆碱、甘油葡糖苷、水解透明质酸、胶原蛋白肽、谷甾醇、肌肽、肌酸、植酸、n-甲基丝氨酸、3-甲基环十五酮、皂苷、染料木黄酮、大豆黄酮、叶绿醇；以及墨角兰、辣薄荷、苹果薄荷、紫苏、白苏、柠檬、蒙桑、面包果、楮树、构树、无花果、石莼、欧锦葵、待雪草、黄柏、鱼腥草、蓍、杏仁、山楂、亚麻籽、栀子、荨麻、草莓籽、杨桃、百香果、海葡萄、藏红花、山茶、南瓜、丝瓜、芦笋、绞股蓝、苦参、陈皮、芍药、柿、丹参、积雪草、普洱茶、舞茸、莼菜、木贼、木梨、母菊等具有透明质酸产生促进作用的植物提取物至少其中一种。
55.本发明可抗衰老且与抗衰老剂联合应用作为抗衰老剂的制备，具体如且不限于：生育酚(维生素e)、维生素e磷酸酯二钠、生育酚乙酸酯、富勒烯、泛醌、葡萄籽提取物、茶提取物、视黄醇、视黄醇乙酸酯、银杏提取物、植物甾醇类、白藜芦醇、神经酰胺、人参根提取物、葛根素、大豆异黄酮等其中至少一种。
56.本发明所有所述包含自组装短肽字样，且包含自组装短肽功能的，其宏观表现均为水凝胶。
57.本发明的所述的16个序列为多肽，在这里称为“自组装短肽”。
58.本发明的有益效果如下：
59.1、提供了一种新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。
60.2、提供了一种新型自组装短肽这些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用干细胞、类器官三维培养，模拟细胞内的生存环境，提供细胞体外三维微环境。
61.3、提供一种新型具有载药功能的自组装材料，该材料能够负载药物、大分子，具有显著的抗肿瘤作用，为疫苗佐剂开辟了新路径。
62.4、提供一种新型疫苗佐剂功能的自组装材料，能够增强体内免疫能力，可用于保健品、药品的制备。
63.5、提供一种新型应用于化妆品领域的自组装材料，该材料可作为化妆品中的缓释
剂、抗菌剂、持久保湿剂、润滑剂、流变调节剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂、稳定剂、缓冲剂，为化妆品原料提供一种新型生物相容性良好、降解产物有益的水凝胶。
64.6、提供一种新型自组装短肽，作为dc的促成熟剂、nk细胞的激活剂等。
附图说明
65.图1是本发明自组装短肽drf3的圆二色谱图；
66.图2是本发明自组装短肽drf3的透射电镜图；
67.图3是本发明自组装短肽drf3的原子力显微镜图；
68.图4是本发明自组装短肽drf3的冷冻扫描电镜图；
69.图5是本发明自组装短肽drf3的刚果红染色图；
70.图6是本发明自组装短肽drf3的苯胺蓝染色图；
71.图7是本发明自组装短肽drf3对扁桃体细胞第三天的三维培养图；
72.图8是本发明自组装短肽drf3对扁桃体类器官第三天的三维培养图；
73.图9是本发明自组装短肽drf3与透明质酸酸混合后三维培养成纤维细胞的cck8毒性测试图；
74.图10是本发明自组装短肽drf3对结肠癌细胞的cck8攻毒实验图；
75.图11是本发明自组装短肽drf3对ova控释图；
76.图12是本发明自组装短肽drf3促进dc细胞成熟的流式分选图；
77.图13是本发明自组装短肽drf3促进nk细胞成熟的流式凋亡图。
具体实施方式
78.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
79.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
80.本发明所述的实施例若没有说明具体浓度，浓度均为2.5mg/ml。
81.实施例1
82.本实施例提供由l－氨基酸构成的自组装短肽drf3的制备
83.材料：
84.按照氨基酸序列备好原料如：fmoc-l-arg-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、fmoc-l-lys-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、fmoc-l-asp(otbu)-oh(芴甲氧羰酰基-l-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、fmoc-l-val-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-缬氨酸)、fmoc-l-phe-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-苯丙氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、fmoc-l-glu(otbu)-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、fmoc-l-leu-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-亮氨酸)、fmoc-l-ile-oh(9-芴甲氧羰酰基-l-异亮氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、tbtu(o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯)、hbtu(o-苯并三唑-1-基-n、n、n、n-四甲
基尿六氟磷酸脂)和hobt(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：dmf(n、n-二甲基甲酰胺)、tfa(三氟乙酸)、acn(乙腈)、冰乙醚、nmm(n-甲基吗啡啉)。
85.采用fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，工艺步骤简述如下：
86.(1)称取0.5mmol/g rink amide resin 20g于肽合成器中，用200mldcm(二氯甲烷)浸泡树脂30分钟后，再用400inidmf分三次清洗树脂，每次清洗时间为3min，抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用100ml20％哌啶/dmf震荡反应30分，反应结束后，抽滤干洗涤液，用400midmf清洗树脂5次，每次清洗3min，洗完后取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阳性，然后向反应器中加入原料：
87.fomc-l-leu-oh 14.312g
88.hbtu 14.15g
89.hobt 8.77g
90.nmm 8.27ml
91.dmf 243ml
92.上述原料加完后，反应40min，抽滤，用30ml dmf洗涤树脂4次，每次3分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
93.(2)再用40mldmf分4次洗涤树脂，然后在取少许树脂做前三酮检查，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：
94.(a)fomc-l-arg-oh 15.122g
95.(b)hobt 26.30g
96.(c)nmm 7.36ml
97.(d)dmf 247ml
98.上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mldmf分4次洗涤，每次3分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
99.(3)变换步骤
⑵
中(a)原料，(b)(c)(d)原料及加入量不变，重复步骤
⑵
的操作：步骤(2)中(a)原料替为对应的一级结构序列的氨基酸。
100.再重复一次
⑴⑵⑴
步骤的操作，各步骤的原料及用量不变，根据drf3序列合成；最后一个结朿后，脱出fmoc-保护基，20％哌啶/dmf(体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加入160ml 50％醋酸酐/dmf(醋酸酐的体积浓度)反应30分钟，用40mldmf洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥8小时。将50ml 90％tfa/dcm(tfa的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加乙醚，析出白色固体，抽滤固体，即得到粗肽，通过hplc(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥，即得本发明所述短肽drf3氨基酸序列为序列表中所述。
101.实施例2
102.如图1所示，自组装短肽drf3自组装24h的圆二色谱(cd)
103.在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在圆二色谱仪中显示，在组装24小时之后，短肽drf3均可自组装形成纳米纤维交织的膜状结构，两者的二级结呈镜像相关的β折叠结构，如图1所示，图1是自组装短肽drf3组装24h时的圆二色谱图；(wavelength波长；cd圆二色性)
104.实施例3
105.自组装短肽drf3自组装24h的透射电镜(tem)
106.1、实验材料
107.drf3，主要溶液有：去离子水h2o；pbs溶液(na

、k

、po
43-、hpo
42-、h2po
4-等)。
108.2、主要的实验仪器
109.透射电子显微镜(tem,h-200,hitachi)
110.3、实验方法
111.(1)以去离子水或pbs配制drf3至终浓度为100μm的工作液，用于透射电子显微镜的观察；(2)取少量工作液用1％磷钨酸负染：用洁净的吸头吸取一滴约(10-30μl)工作液滴于洁净的载玻片表面，用镊子小心地夹取一块由formvar膜覆盖tem的铜网，用铜网蘸取载玻片上的工作液，静置数秒，待工作液与铜网充分结合后，再用铜网蘸取少量1％的磷钨酸，对已吸附的工作液进行负染色；(3)用滤纸吸干铜网上多余的液体，在空气中静置数分钟待铜网干燥。
112.以tem扫描铜网，直接观察铜网上的短肽自组装结构。
113.4、实验结果
114.在37℃环境下自组装1小时后的自组装短肽在透射电镜中显示，在组装1小时之后，短肽drf3均可自组装形成纳米纤维交织的膜状结构，两者的二级结呈镜像相关的β折叠结构，可以有效地负载蛋白、药物、大分子、细胞等，为细胞生长提供了物理支架，支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种；一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。为如图2(分别为200μm、500μm、2μm)所示，图2是自组装短肽drf3组装24h时的透射电子显微镜图，图均显示短肽为现为网状结构。
115.实施例4
116.如图3所示，自组装短肽分别在400μm、1μm、2μm的原子力显微镜图，图均显示短肽为现为网状结构。
117.1、实验材料
118.drf3，主要溶液：无菌去离子水h2o；millipore milli-q system，高压灭菌4℃保存备用。
119.2、主要仪器
120.原子力显微镜afm(multimode8)
121.3、实验方法
122.用去离子水配置drf3的工作液，最终浓度为100μm；分别将配置的drf3的工作液5μl滴在新剥光的云母片表面；当涂片完成后约30s，以1000μl去离子水冲洗除去未附着的短肽；将上述各短肽工作液涂片在室温中空气干燥；在气相中对云母片进行afm扫描，用spi4000的记录模式收集afm图像；使用20μm扫描器(400)、olympus si-df20微悬臂，及弹簧常量为12n/m的针(si，半径10nm，矩形基底200μm)；悬臂的自由共振频率为127khz；相位图
以512
×
512的像素解析度记录；为显示自组装短肽的纳米纤维结构，以600nm
×
600nm，200nm
×
200nm的范围进行扫描。
123.4.实验结果
124.在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在原子力显微镜中显示，图3是自组装短肽drf3组装24h时的原子力显微镜图，在组装24小时之后，短肽形成密集规则的纳米棒状纤维结构，棒状纳米纤维相互集结成致密的纳米纤维网状支架。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂等，为负载药物、细胞、蛋白、大分子提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、siga、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种；一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
125.实施例5
126.如图4所示，自组装短肽drf3分别在10μm、5μm、20μm的冷冻扫描电镜，图显示短肽drf3为纤维网状结构。
127.在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在冷冻扫描电镜中显示，图4是自组装短肽drf3组装24h时的冷冻扫描电镜图，在组装24小时之后，短肽形成密集规则的纳米棒状纤维结构，棒状纳米纤维相互集结成致密的纳米纤维网状支架。更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的纳米支架、药物载体、促细胞成熟剂、制备细胞疫苗等。
128.实施例6
129.如图5所示，自组装短肽drf3自组装24h刚果红染色
130.1、实验材料
131.短肽：drf3
132.混合液成分有：1)配制定浓度混合液体(含鸡卵白蛋白、免疫球蛋白、胰岛素、塞替派、卡莫司汀、丝裂霉素、胶原、羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、三尖杉酯碱、白细胞介素-2、白细胞介素-2、透明质酸、甲硝锉、嘌呤霉素、cd40、pd-l1)，其中组分中最低浓度为1ppm；2)染色液：刚果红染色。
133.2、实验过程
134.将10mg/ml的短肽溶液母液用pbs溶液稀释为2.5mg/ml置于37℃环境中分别自组装0小时、4小时、12小时、24小时后进行刚果红染色检测。吸取15μl短肽溶液于载玻片上，滴加刚果红染色液染色约30s，于光学显微镜下观察、拍照。
135.3、实验结果
136.加入配制定浓度混合液体(含鸡卵白蛋白、免疫球蛋白、胰岛素、塞替派、卡莫司汀、丝裂霉素、胶原、羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、三尖杉酯碱、白细胞介素-2、白细胞介素-2、透明质酸、甲硝锉、嘌呤霉素、cd40、pd-l1)，刚果红染色结果显示drf3在显微镜下呈
现纤维凝胶状，在12h基本完成组装、24h完全组装成功、48小时组装稳定，图5是自组装短肽drf3组装24h时的刚果红染色。更进一步表明，可用于制备医美产品，化妆品或保健品等领域，为负载药物、细胞、蛋白、大分子提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、siga、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种；一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用；一种自组装短肽作为主要成分用于制备医美产品或化妆品；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
137.实施例7
138.如图6所示，自组装短肽drf3自组装24h苯胺蓝染色
139.苯胺蓝染色液是masson三色染色试剂盒的组成之一，苯胺蓝染色液主要有苯胺蓝、弱酸等组成，呈酸性，常与丽春红品红染色液等配合使用对胶原纤维进行染色，染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。
140.1、实验材料
141.短肽：drf3
142.混合液成分有：1)配制定浓度混合液体(如鸡卵白蛋白、胶原、透明质酸、谷胱甘肽、甲状腺素、乙酰胆碱、贝伐珠单抗、亚砷酸、吉非替尼、吉非替尼、苯丁酸氮芥、cd40、cd19、cd21、pd-l1、维生素b
12
)，其中组分中最低浓度为1ppm；2)染色液：苯胺蓝染色液、95％乙醇、二甲苯、磷钼酸。
143.2、实验方法
144.切片常规脱蜡至水；用配制好的weigert铁苏木素染色液染色5-10min；酸性乙醇分化液分化1-2s，蒸馏水洗；masson蓝化液返蓝1min，蒸馏水洗；丽春红品红染色液染色5-10min，弱酸工作液洗3-5s，磷钼酸溶液分化1-2min；倒掉分化液，直接放入苯胺蓝染色液中染色1-2min，用弱酸工作液洗1min；95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5-10s；二甲苯透明3次，每次1-2min，中性树胶封固。
145.3、实验结果
146.图6是自组装短肽drf3组装24h时的苯胺蓝染色，混合含一定浓度的混合溶液(如鸡卵白蛋白、胶原、透明质酸、谷胱甘肽、甲状腺素、乙酰胆碱、贝伐珠单抗、亚砷酸、吉非替尼、吉非替尼、苯丁酸氮芥、cd40、cd19、cd21、pd-l1、维生素b12)，苯胺蓝染色显示drf3在显微镜下呈现纤维凝胶状，在12h基本完成组装、24h完全组装成功、48小时组装稳定。更进一步表明，可用于某些生物医学领域，还可用于制备医美产品，化妆品或保健品等，为负载药物、细胞、蛋白、大分子提供了理论基础，支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种；一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应
用；一种自组装短肽作为主要成分用于制备医美产品或化妆品；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
147.实施例8
148.选取扁桃体细胞作为通用细胞培养的模型或者代表，在drf3构建的三维环境中的培养。
149.将扁桃体细胞，分别置于37℃水浴中迅速溶解；再加入rpmi-1640(gibco公司)培养液，悬浮离心沉淀的细胞；然后接种于25cm培养瓶中，再加入培养液为rpmi-1640的完全培养基。
150.其主要成分为1％双抗溶液(青链霉素－链霉素)、8-10％(体积浓度)胎牛血清(gibco公司)，把培养瓶置于37℃、体积分数为5％二氧化碳，培养箱中培养；
151.每2天换液一次，待细胞生长状况良好后即可将细胞分瓶传代；
152.传代时在超净台内先将培养瓶内培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25％的胰酶1ml使细胞游离，可以适当振荡；将培养瓶中液体移入离心管中，1000转/分，8分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用rpmi-1640的完全培养基培养液悬浮细胞，分瓶接种；当接种细胞生长状态良好后，备用；
153.三维培养步骤如下：(1)细胞生长状态良好后进行三维培养；(2)1000rpm离心，计数；(4)加入短肽等溶液，混合均匀，形成三维混悬细胞液；置96孔板于恒温培养箱(37℃，5％co
2)
进行培养，观察，分析；在二维环境中，部分扁桃体细胞为贴壁生长状态，呈长梭形；
154.在drf3所构建的三维环境中培养时，细胞呈球形镶嵌于短肽水凝胶中；细胞透亮并且边界清晰可见，表现为多层生长。
155.细胞的生长与增殖受到抑制，而在drf3构建的三维培养环境中，细胞透亮且细胞数量仍有增长。证明扁桃体细胞作为细胞培养的代表或者模型可以在短肽水凝胶构建的三维培养环境中生长、增殖且状态良好。更进一步表明，可用于生物医学领域如细胞培养和干细胞领域治疗，也可对制备某些特殊个性化医美产品提供了支持，支撑了一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。如图7所示，三维培养三天后的扁桃体细胞形态为圆形。
156.实施例9
157.自组装短肽三维培养扁桃体类器官
158.1.实验材料
159.(人)扁桃体组织，来源于重庆医科大学附属第一医院医疗废弃处置物，符合相应的国家及伦理法规。
160.2.实验方法
161.将手术新鲜取下的扁桃体组织浸泡于含有10％双抗的1640培养基中1h；将扁桃体组织取出放入培养皿中，将扁桃体组织剪碎为大小约为1mm
×
1mm的组织块；用消化酶在37℃烘箱中消化细胞2h。
162.将消化完的细胞制备成为扁桃体细胞悬液；将细胞悬液调整为浓度1
×
107个/毫升，转入24孔板中，每孔1ml；每孔加入200μl浓度为5mg/ml的自组装短肽，构建三维培养体
系。
163.转入细胞培养箱中培养。
164.3.实验结果
165.如图8所示，该体系下显微镜观察到细胞聚集生长成细胞团状，表明短肽形成的三维纳米物理支架支持组织及器官培养。
166.扁桃体为类器官模型，说明本技术的自组装短肽能应用于三维培养类器官培养领域，支撑了一种自组装短肽在制备细胞或类器官三维培养纳米支架材料中的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备dc疫苗的应用；一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用。
167.实施例10
168.自组装短肽与透明质酸酸混合后三维培养成纤维细胞的cck8实验
169.实验步骤：
170.将自组装短肽drf3(浓度为5mg/ml)与透明质酸酸混合(浓度、体积比例为1：1)后和成纤维细胞混合进行三维培养步骤实施例8所示。
171.1、制备细胞悬液：细胞计数
172.2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
173.3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
174.4、加入不同浓度的毒性物质
175.5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，依据毒性物质的性质、细胞敏感性、细胞周期来决确定定。一般需要要培养一代以上的时间。
176.6、加入10ul cck8：由于每孔加入cck8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
177.7、培养1-4小时：细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间(5-6小时)。
178.8、测定450nm吸光度：采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
179.实验结果：如图9(ha透明质酸；od吸光度)所示显示drf3与透明质酸联合三维培养成纤维细胞后，几乎无毒，或者毒性相比较透明质酸单独培养毒性更弱，表明短肽drf3能协同降低透明质酸的毒性，进一步的根据上述drf3的纤维网状结构与透明质酸的结构相似(但毒性更小)，几乎无毒或者细胞毒性极小、也为短肽替代透明质酸成为单独的填充剂提供了理论支撑，更进一步表明玻尿酸及其他化妆品主要化合物联合自组装短肽在医美领域、化妆品领域具有重大应用价值，支撑了一种自组装短肽作为主要成分用于制备医美产品或化妆品；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
180.实施例11
181.自组装短肽drf3对结肠癌细胞的cck8攻毒实验
182.cck8实验如实施例10示(concentration浓度；absorbance value吸光度值)。
183.这里测试了不同短肽浓度下对结肠癌细胞的毒性大小，分组为：1ug/ml、2.5mg/ml、5mg/ml
184.实验结果：如图10所示，在24和48小时下短肽浓度越高对结肠癌细胞的毒性越大，进一步表明短肽drf3作为抗肿瘤药物制备领域的应用前景，支撑了一种自组装短肽在制备抗瘤的药物中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
185.实施例12
186.如图11所示(days天；ova release ova释放)，drf3对抗原ova体外释放
187.检测drf3水凝胶中ova的释放情况，将含有200μlova置于200μl水凝胶中，然后在凝胶顶部加入200μlpbs溶液。
188.每天吸取100μlpbs并补充等体积的pbs溶液。通过bca测定法提取样品中的ova浓度，并计算累计的ova释放，并绘制曲线。
189.图11结果显示drf3能持续释放ova的时间在5天左右，drf3能持续释放ova的时间在10天左右。进一步表明，drf3可持续释放药物(蛋白)ova，为药物半衰期提供了极大的上升空间，更进一步地为自组装短肽能应用于临床医学领域特别是药物、大分子、疫苗、细胞领域多场景应用，提供了真实可能，支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、siga、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种。在这里我们以ova蛋白为模型证明了drf3能负载蛋白药物，进一步的drf3也有能力负载其他大分子蛋白(如免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白等以及说明书中提到的化合物)。
190.实施例13
191.自组装短肽drf3促进dc细胞成熟的流式分选实验
192.将短肽(2.5mg/ml)与dc细胞混合培养7天后，进行流式分选实验。
193.1接种细胞
[0194]3×
104/孔药物刺激一般作用24小时，上机。
[0195]
2上机方法
[0196]
在cellquest环境下，利用control细胞标定上样条件，并在已设好的文件夹(ins文件及set文件)下，保存好需要的上样文件关闭cellqest软件，打开mpm软件在mpm软件下进行一系列设定首先在autosample下，进行settinginitial及finalwashing操作，清洗整个管路管路清洗完毕进行上样条件设定主要设定上样体积(一般100ul)，混合体积(一般100ul)，混合次数，清洗次数等，在acquisition菜单下设定current plate(现在使用的板号是353263)，datestoragefolder(即数据储存文件夹)，acquisitiondocument及instrumentsettingsfile(上样条件从保存好的ins及set文件中选定)上样条件设定完毕，选定96孔板的上样范围在acquisition下选择acquire，上样完毕，退出上样板，使用水，清洗管路(将水加在96孔板上，以上样的方式清洗管路)
[0197]
须知：如果使用pbs作为上样鞘液，上样完毕后，换用水作为鞘液，并反复冲洗管路，防止pbs盐结晶堵塞管路。
[0198]
实验结果：图12是短肽三维培养dc细胞的流式分选图，与pbs组相比较短肽组中的dc细胞cd86表达明显增加，说明短肽促进了dc细胞的成熟，说明了短肽三维培养dc细胞可
以有效的激活dc细胞，促进dc细胞的成熟，制备dc疫苗，更进一步的验证了drf3能作为抗原成分进入体内，激活dc细胞，制备dc疫苗，为自组装短肽应用于疫苗、药物、大分子、蛋白质载体和佐剂奠定了理论基础，此实施例支撑了一种自组装短肽在制备药物载体材料中的应用；一种自组装短肽在制备大分子载体材料中的应用，大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、p53蛋白、p21蛋白、igg、siga、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
[0199]
dc疫苗的制备：1.将培养好的细胞以浓度为5
×
105个/ml加入1ml的培养基配置成为dc溶液。
[0200]
2.将200μl的drf3加入200μl的pbs(磷酸盐溶液)中，配置成溶液1。
[0201]
3.将溶液1迅速加入dc溶液中配置为dc疫苗。
[0202]
实施例14
[0203]
用流式分选术检测短肽培养nk细胞凋亡实验
[0204]
将短肽(2.5mg/ml)与nk细胞混合培养7天后，进行流式凋亡实验。
[0205]
1.用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60％-70％，吸出旧培养基，根据实验需求处理，继续培养。
[0206]
2.根据实验处理时间，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，pbs洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。(注意：悬浮细胞不需要胰酶消化，直接收集到离心管即可)
[0207]
3.加入步骤(2)中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5min，弃上清，收集细胞，用pbs轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤(2)中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的annexin v-fitc导致染色失败。
[0208]
4.取5-10万重悬的细胞，200g离心5min，弃上清，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞。
[0209]
5.加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀。
[0210]
6.室温(20-25℃)避光孵育10min。可以使用铝箔进行避光。
[0211]
7.200g离心5min，弃上清，加入190μl annexin v-fitc结合液重悬细胞。
[0212]
8.加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
[0213]
9.进行流式细胞仪检测，annexin v-fitc为绿色荧光，pi为红色荧光。
[0214]
注意：fitc为绿色荧光，此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞。
[0215]
实验结果：图13表示，与pbs组相比较短肽组中的nk细胞凋亡率更小，说明短肽构建的三维微环境与nk细胞具有良好的生物相容性，有效地激活了nk细胞，更进一步的在制备nk疫苗领域中具有重大应用价值，此实施例支撑了一种自组装短肽在三维纳米物理支架培养细胞中作为制备nk疫苗的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppm及以上。
[0216]
nk疫苗的制备：1.将培养好的细胞以浓度为5
×
105个/ml加入1ml的培养基配置成为nk溶液。
[0217]
2.将200μl的drf3加入200μl的pbs(磷酸盐溶液)中，配置成溶液1。
[0218]
3.将溶液1迅速加入nk溶液中配置为nk疫苗。
[0219]
进一步的通过以上实施例表明：
[0220]
1.我们通过测试短肽的圆二色谱检测了短肽可形成稳定的二级结构，为短肽drf3形成稳定的纤维网状结构奠定了理论基础。
[0221]
2.我们通过测试短肽的透射电镜图、原子力显微镜、冷冻扫描电镜图表明短肽drf3能够形成稳定的纤维网状结构，其可为细胞提供一个稳定的三维纳米物理支架，进一步的为drf3负载包裹药物、蛋白质、大分子、疫苗等奠定了理论基础。
[0222]
3.我们通过测试短肽(含药物)的刚果红、苯胺蓝染色表明短肽drf3能够与药物、蛋白混合形成纤维网状结构，为drf3负载药物、蛋白、大分子提供了直接证据。
[0223]
4.进一步的我们通过测试短肽drf3对鸡卵白蛋白(ova)的体外控释能力，更进一步地直接验证了短肽可以作为一个药物、蛋白、大分子的长久载体及佐剂，增加药物的半衰期。
[0224]
5.我们通过测试短肽drf3的三维培养能力，通过图表表明短肽能为扁桃体细胞、类器官提供一个稳定且持久的三维纳米物理支架，进一步的根据此模型，为我们后续培养包裹dc细胞、nk细胞，制备dc、nk疫苗提供了自信。
[0225]
6.我们通过测试短肽三维培养dc、nk细胞，用流式分选术鉴定dc细胞的成熟、鉴定nk细胞的死亡率，为短肽drf3可以促进dc细胞的成熟、激活nk细胞提供了直接证据，为drf3作为抗原成分提供了证据，为drf3能包裹nk、dc，制备成为dc、nk疫苗提供了证据。
[0226]
7.我们通过测试短肽drf3与结肠细胞培养的cck8攻毒实验表明了短肽对结肠癌细胞有毒性，为其作为疫苗及药物佐剂、也为其可成为杀伤肿瘤的药物提供了直接证据。
[0227]
我们通过测试短肽drf3与玻尿酸混合后三维培养成纤维细胞表明，我们联合透明质酸后可以降低透明质酸的毒性，进一步的表明玻尿酸及其他化妆品主要化合物联合自组装短肽在医美领域、化妆品领域具有重大应用价值，也为短肽可代替透明质酸作为填充剂提供了理论支撑。
[0228]
序列表：
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