一种抗菌释氧功能性凝胶敷料及其制备与应用的制作方法

1.本发明属于医用敷料领域，具体涉及一种抗菌释氧功能性凝胶敷料及其制备与应用。


背景技术：

2.正常的伤口愈合过程可以通过各种细胞反应发生，包括角质形成细胞，成纤维细胞，内皮细胞，巨噬细胞以及血小板的活化。而糖尿病创口的病理环境和正常皮肤创口有明显不同，其创口处的氧化微环境以及高血糖环境严重阻碍糖尿病皮肤创口的愈合进程。在糖尿病创口处，包括中性粒(白)细胞在内的免疫细胞在高血糖环境下会产生大量的活性氧(ros)，ros水平的升高会导致创口处细胞受损而使伤口无法治愈。而高血糖则易导致创口处细菌感染，目前主要处理手段是使用抗生素来抑制细菌，但细菌出现抗药性后，抗生素将不起作用。此外，高血糖症可引起血管收缩并抑制血管新生，从而阻断氧气供应阻碍愈合过程。尽管现在已经有一些针对糖尿病创口的治疗手段，但现有的治疗手段很少考虑到糖尿病创口特殊的病理环境。因此设计合成一种能克服上述难题并高效治疗糖尿病创口的功能性水凝胶有重要的临床意义。
3.壳聚糖(cs)是甲壳素的脱乙酰基产物，是自然界中少见的带正电的高分子化合物，本身具有非凡的生物学特性，例如可生物降解，生物相容性以及良好的细胞结和能力。近期壳聚糖水凝胶已经被应用于各种生物医学应用中，包括药物递送、伤口敷料和组织工程支架等。但单一组分的壳聚糖材料抗菌性和湿组织粘附性有限，从而限制了cs在医学领域中的应用。为了改善cs的物理化学性质，通常会对cs进行改性来提高其性能。
4.贻贝通过足丝可以在湿润的条件下附着到各种基材表面，足丝中的主要成分是富含邻苯二酚(儿茶酚)基团的黏性蛋白，在贻贝蛋白的交联和粘附过程中发挥着重要作用。之前有研究通过邻苯二酚改性壳聚糖材料可以通过氧化成胶并且使其具有一定的组织粘附性，但是该材料的机械性能有限而且没有很好的抗菌性。
5.尽管在针对糖尿病创口修复领域已经报道了一些合成凝胶敷料，但兼顾可注射性、强组织粘附性、强抗菌性、清除ros并能持续释氧的复合水凝胶敷料制备技术尚未见报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种抗菌释氧功能性凝胶敷料的制备方法。本发明通过壳聚糖-氢化咖啡酸和四臂聚乙二醇-邻苯三酚的氧化交联，制备壳聚糖-聚乙二醇-邻苯三酚凝胶敷料，可以显著提高敷料的组织粘附力、机械性能以及抗菌能力；在敷料内部均匀载入δ-mno2纳米酶则可以帮助清除糖尿病创口处产生的ros，消除细胞氧化应激并能持续释放氧气。释放氧气有两种作用，第一可以在糖尿病伤口低氧状态下改善皮肤细胞的存活率；其次氧气能够刺激皮肤细胞产生用于创口修复的生长因子，最终帮助重塑组织及加速创口愈合。
mno2纳米酶的质量比为(120-200):(67-120):(0.5-1):(2.5-12.5)，更优选为120:67:1:12.5。
27.优选的，步骤(4)中所述高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾，高碘酸盐以溶液的形式投入，高碘酸盐溶液浓度为2-5mg/ml，溶剂为pbs溶液。
28.优选的，步骤(4)中δ-mno2纳米酶以溶液的形式投入，δ-mno2纳米酶溶液浓度为5wt％。
29.优选的，步骤(4)中所述静置为在室温下静置5-10min。
30.本发明制得的抗菌释氧功能性凝胶敷料可制成冻干海绵、水凝胶等临床使用的器械用于愈合糖尿病创口。
31.与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
32.(1)本发明提供的抗菌释氧功能性凝胶敷料的制备方法简便易行、绿色无污染、便于商品化。
33.(2)本发明针对糖尿病创口易被细菌感染、富含活性氧的特点，设计出具有强抗菌性能、清除活性氧并能持续释放氧气的抗菌释氧功能性凝胶敷料。
34.(3)本发明制备的凝胶敷料兼顾可注射性、良好的机械性能(强拉伸性能及压缩性能)、强组织粘附性、抗菌性，其具有强组织粘附性和良好的拉伸性可以使其和创口有更好的贴合，特别是关节部位，可作为一种新型生物材料应用于细胞、组织工程、药物递送等生物学领域。
附图说明
35.图1为实施例1制备的δ-mno2纳米酶的tem图。
36.图2为实施例1制备的δ-mno2纳米酶的粒径分布图。
37.图3为凝胶的拉伸压缩性能测试过程示意图。
38.图4为凝胶的拉伸压缩性能测试结果图。
39.图5为凝胶的组织粘附性能测试结果图。
40.图6为凝胶的抗菌性能测试结果图。
41.图7为凝胶的释氧性能测试过程示意图。
42.图8为凝胶的释氧性能测试结果图，图中0wt％mno2代表不含δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料，1wt％mno2代表含1wt％δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料，0.25wt％mno2代表实施例1制备的含0.25wt％δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中使用的壳聚糖(分子量为5万，脱乙酰度为75％)购于西格玛公司，氢化咖啡酸、2,3,4-三羟基苯甲醛购于麦克林公司，四臂聚乙二醇-氨基(分子量为10000)购于上海源叶生物科技有限公司。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
44.实施例1
45.一、壳聚糖-氢化咖啡酸(cs-ha)的制备
46.(1)称取0.5g壳聚糖(cs)加入到49.5ml ph＝1.6的去离子水中(1mol/lhcl溶液调
节)，制成1wt％壳聚糖溶液，并用1mol/l的naoh将溶液调节至ph＝5.4；
47.(2)称取0.4g氢化咖啡酸(ha)加入到步骤(1)制备的壳聚糖溶液中，搅拌1h,并将混合溶液调节至ph为3.7-4.0(1mol/l hcl溶液调节)；
48.(3)称取1.2448g edc，以体积比为1:1的去离子水和乙醇作为溶剂配制50ml的edc溶液，加入到步骤(2)制备的cs-ha混合溶液中搅拌1h；
49.(4)将步骤(3)的反应产物在ph＝3.5的去离子水(1mol/l hcl溶液调节)中透析48h，真空冻干后得到cs-ha。
50.二、四臂聚乙二醇-邻苯三酚(4arm peg-thb)的制备
51.(1)称取100mg四臂聚乙二醇-氨基(4arm peg-nh2)加入到1ml pbs溶液中，制成0.1g/ml的4arm peg-nh2溶液；
52.(2)称取300mg 2,3,4-三羟基苯甲醛(thb)加入到3ml pbs溶液中，制成0.1g/ml的thb溶液；
53.(3)取0.3ml步骤(2)配制的thb溶液加入步骤(1)配制的4arm peg-nh2溶液中，室温下搅拌反应6h，制得4arm peg-thb溶液。
54.三、δ-mno2纳米酶的制备
55.(1)将2.2g四甲基氢氧化铵五水合物(tmaoh
·
5h2o)搅拌溶解于20ml3wt％h2o2中，制成溶液；
56.(2)将0.594g mncl2·
4h2o通过超声处理溶解在10ml的去离子水中，制成浓度为0.3mol/l的mncl2溶液；
57.(3)将步骤(1)制备的溶液在10s内快速加入到步骤(2)制备的mncl2溶液中，以600rpm的转速搅拌24h后，以2000
×
g的离心力离心5min得到大块的δ-mno2，在用水洗涤3次和用乙醇振荡离心2次之后干燥12h，制得δ-mno2；
58.(4)将步骤(3)制得的δ-mno2加入到去离子水中超声10h后，将溶液以8800
×
g的离心力离心10min，再用去离子水制成5wt％的δ-mno2纳米酶水溶液，对δ-mno2纳米酶用透射电镜(tem)进行观察。tem图片如图1所示，δ-mno2纳米片平整光滑、棱角分明、清晰可见，大小约为325.6nm。
59.四、壳聚糖-聚乙二醇-邻苯三酚(cs-peg-thb)凝胶敷料的制备
60.(1)称取150mg步骤一制备的cs-ha溶于5ml pbs溶液中，制成0.03g/ml的cs-ha溶液；
61.(2)称取5mg高碘酸钾溶于1ml去离子水中，制成5mg/ml的高碘酸钾溶液；
62.(3)取0.4ml步骤(1)中制备的cs-ha溶液置于玻璃瓶中，先加入0.025ml步骤三制备的δ-mno2纳米酶水溶液并搅拌均匀，再加入0.02ml步骤(2)制备的高碘酸钾溶液，并加入0.05ml pbs溶液混合均匀获得cs-ha凝胶前溶液，将其通过医用注射器吸取并注射到模具中，室温下2-5分钟后自主交联形成cs-ha凝胶。
63.(4)取0.4ml步骤(1)中制备的cs-ha溶液置于玻璃瓶中，加入0.05ml步骤二制备的4arm peg-thb溶液(含0.0067g 4arm peg-thb)和0.025ml步骤三制备的δ-mno2纳米酶水溶液(含0.00125gδ-mno2纳米酶)混合均匀，再加入0.02ml步骤(2)中制备的高碘酸钾溶液并混合均匀，获得cs-peg-thb凝胶前溶液，将其通过医用注射器吸取并注射到模具中，室温下5-10分钟后自主交联形成cs-peg-thb凝胶敷料(δ-mno2纳米酶含量为0.25wt％)。
64.凝胶敷料性能测试
65.一、凝胶的拉伸压缩性能测试
66.(1)将凝胶两端固定后，向两侧均匀拉伸，记录可拉伸长度变化。
67.(2)将凝胶置于载玻片上，将另一块载玻片置于上方压缩凝胶至其总体积减小约90％后，记录凝胶压缩前后形态变化。
68.测试结果如图4所示，实施例1制备的cs-peg-thb凝胶的拉伸性能较cs-ha凝胶提高了近2倍，cs-peg-thb凝胶的压缩性能较cs-ha凝胶有显著的提高。
69.二、凝胶的组织粘附性能测试
70.凝胶的组织粘附性能以猪皮为基材使用搭接剪切测试：将新鲜的猪皮切成长方形(50mm
×
10mm)，并将实施例1制备的cs-ha凝胶前溶液与cs-peg-thb凝胶前溶液转移到两片猪皮上并涂抹均匀，粘合面积为4cm2；用500g的砝码压约24h，然后用万能试验机在5mm/min的拉伸速率下测量粘合强度。
71.测试结果如图5所示，cs-peg-thb凝胶的粘合强度达到了69.3kpa。
72.三、凝胶的抗菌性能测试
73.实施例1制备的cs-ha凝胶前溶液和cs-peg-thb凝胶前溶液各取200μl分别与10ml的细菌悬浮液共培养(无凝胶的细菌悬浮液作为空白对照组)，12h后将细菌悬浮液稀释一百倍，取1ml铺在lb琼脂板上培养18h，最后计算细菌存活率。
74.测试结果如图6所示，cs-peg-thb凝胶的抗菌性能是cs-ha凝胶的近4倍。
75.四、凝胶的释氧性能测试
76.按实施例1方法制备的不同含量δ-mno2纳米酶(0，1wt％)的cs-peg-thb凝胶敷料，将制备的不含δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料、含1wt％δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料以及实施例1制备的含0.25wt％δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料进行凝胶的释氧性能测试，步骤如下：在48孔板内载入凝胶敷料，将其浸入含有100μm h2o2的细胞培养液，用氧气探针(presens,oxy-1st trace，德国)实时监控测量液体中的氧气浓度变化，连续测试2h。
77.测试结果如图8所示，载入δ-mno2纳米酶的cs-peg-thb凝胶敷料在高活性氧环境下可持续释放氧气2小时以上。
78.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。