花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。


背景技术：

2.呼吸道病毒是以呼吸道为入侵门户，在呼吸道粘膜上皮细胞增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的病毒，其侵入下呼吸道引起肺部感染性疾病，即造成呼吸道病毒肺炎。常见的呼吸道病毒包括流行性感冒病毒、副流感病毒、巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒，和某些肠道病毒，如柯萨奇、埃可病毒等，以及单纯疱疹、水痘-带状疱疹、风疹、麻疹等病毒等，婴幼儿还常由呼吸道合胞病毒感染产生肺炎。此外，部分肠道病毒如柯萨奇病毒、埃可病毒也可通过呼吸道感染导致出现肺炎的症状。
3.多种呼吸道病毒感染引发的肺炎严重威胁着人们的健康，因此寻找发现新的抗呼吸道病毒的药物非常有必要。
4.芸香科(rutaceae)花椒属植物(zanthoxylum)植物广泛分布于亚洲、非洲、美洲等地，其果实、根、茎、叶均可入药；例如花椒即花椒属植物的果皮，《中药大辞典》即记载了其诸多药用功效：温中散寒，除湿，止痛，杀虫，治积食停饮，心腹冷痛，齿痛，阴痒，疮疥等。花椒属植物的化学成分主要包括生物碱、酰胺、木质素、香豆素、黄酮类、挥发油和脂肪酸。其中，花椒碱(γ-fagarine)即是一种广泛存在于芸香科花椒属植物中的呋喃喹啉生物碱，具有如下结构；
[0005][0006]
近年来研究发现花椒碱具有解痉、抗病毒、抗细菌真菌等作用，然而，花椒碱对呼吸道病毒的作用和机理目前尚未见报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。
[0008]
进一步地，上述药物是治疗和/或抑制呼吸道病毒感染的药物。
[0009]
本发明提供了花椒在制备抗呼吸道病毒的药物中的用途。
[0010]
进一步地，上述药物是降低呼吸道病毒活性的药物。
[0011]
更进一步地，上述花椒是花椒属植物或其提取物。
[0012]
更进一步地，上述花椒属植物提取物含有生物碱。
[0013]
更进一步地，上述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。
[0014]
本发明还提供了一种抗呼吸道病毒和/或防治呼吸道病毒肺炎的药物，它是以花椒为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药物。
[0015]
进一步地，上述花椒是花椒属植物或其提取物。
[0016]
进一步地，上述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。
[0017]
本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。以花椒或其提取物为活性成分，或者以花椒碱或其药学上可接受的盐为活性成分的药物，可以有效抑制和/或治疗冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒等呼吸道病毒感染，有很好的临床应用前景。
[0018]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0020]
图1为16hbe细胞活性。
[0021]
图2为病毒滴度测定结果。
[0022]
图3为小鼠体重变化情况。
[0023]
图4为小鼠肺脏病毒滴度测定结果。
具体实施方式
[0024]
除另有说明外，本发明所用原料均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0025]
本发明利用vero-e6细胞培养hmpv活病毒，分离得到病毒液(moi＝10)，用于后续实验。
[0026]
实施例1、本发明含花椒碱的药物的制备
[0027]
花椒碱配制成浓度为6.25μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm的溶液。
[0028]
实验例1、细胞毒性实验
[0029]
细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的16hbe细胞，迅速放至37℃水浴锅中摇晃溶解，将溶解后的细胞加入到已经吸取3ml培养液的15ml bd管中，800rpm离心4min，弃去上清加入1ml的培养液重悬，重悬后的细胞加入到t25培养瓶中，放入培养箱中培养。
[0030]
细胞铺板：将16hbe细胞培养至接近80％时，消化，重悬细胞并计数，稀释细胞浓度为1*105/ml；每孔100μl加入到96孔板；细胞加药不同浓度(6.25μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm)的花椒碱溶液；设置对照孔和空白孔；放入孵箱过夜培养24h。吸出含药培养液，
用pbs清洗三次，加入新的培养液，并加入10μl的cck-8试剂；作用1-4h后，使用酶标仪测定450nm吸光度值，按照以下公式，计算细胞存活率。
[0031]
a＝a
c-a0/a
b-a0[0032]ac
为加药孔；
[0033]ab
为含有细胞的未加药孔；
[0034]
a0为不含细胞的未加药孔；
[0035]
得到的结果如图1所示，结果表明，在各浓度的花椒碱作用下，16hbe细胞的细胞活性均高于80％，说明花椒碱无明显细胞毒性。
[0036]
实验例2、抑制病毒活性实验
[0037]
实验前一天将对数生长期的细胞消化重悬后，将2*105/孔16hbe细胞接种于24孔板，生长过夜。第二天，细胞汇合度达到70-80％，加入hmpv病毒液200μl(moi＝10)，孵箱中感染2h；吸取病毒并用pbs清洗三遍，配制200μm的花椒碱母液，用含有3％fbs的dmem培养液稀释成不同浓度的含药溶液(0μm，12.5μm，25μm，50μm，100μm，200μm)，实验组分别每孔加入相应的含药溶液。作用24h后，弃去上清，使用总提取rna试剂盒提取rna，按说明书操作提取rna。使用逆转录试剂盒(ag11706-s)，将提取到的rna进行逆转录；使用taqman荧光探针法，荧光定量pcr(q-pcr)，根据q-pcr实验中不同组别的cq值，考察加入不同浓度花椒碱后细胞内病毒载量。
[0038]
结果如图2所示，实验结果表明，花椒碱溶液的加入能够有效降低细胞内病毒载量，其中，加入花椒碱的含药溶液浓度不低于50μm时能显著降低细胞内病毒载量，即降低病毒滴度，说明花椒碱可以有效抑制病毒活性。
[0039]
实验例3、小鼠病毒感染治疗实验
[0040]
购买5-6weeks的balb/c小鼠，17-20g；雌性；适应一周。
[0041]
实验分组：(共3组，每组3只)：
[0042]
1、病毒感染组(hmpv)；2、药物组(实施例1)，给药剂量为50mg/kg；3、利巴韦林组，给药剂量为50mg/kg；
[0043]
实验步骤：
[0044]
1、实验前准备，小鼠随机分组，标记；
[0045]
a.病毒准备：实验前将病毒从-80℃冰箱取出，置于冰上；
[0046]
b.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1％的戊巴比妥(剂量为50mg/kg体重)，置于饲养笼内，等待约5～10min；
[0047]
2、病毒滴注
[0048]
将麻醉后的小鼠固定，纯化的hmpv病毒对小鼠进行滴鼻处理(病毒滴度为10^7)，充分打开气道，两只鼻孔交替滴入病毒液10μl，共滴注60μl；观察小鼠情况，直至小鼠苏醒，可采取适当保暖措施。
[0049]
3.病毒组每日给予灌胃0.4ml的生理盐水，药物组每日口服灌胃花椒碱溶液；利巴韦林组每日灌胃利巴韦林溶液；
[0050]
4.连续给药4天，并称量小鼠体重；观察小鼠的状态；5天后，摘眼球取血；取小鼠肺组织分别置于ep管冻于-80℃冰箱中考察肺脏病毒滴度。
[0051]
a.眼球取血：
[0052]
小鼠摘眼球取血，1500rpm，4℃；离心10min，小心吸取上清。用于病毒滴度检测(q-pcr)、炎性因子水平(elisa)、免疫细胞种类考察(淋巴细胞；t细胞；巨噬细胞)。
[0053]
b.淋巴结淋巴细胞悬液制备
[0054]
1)小鼠摘眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠后取出小鼠淋巴结。向一个洁净的细菌培养皿中加入1ml pbs，然后再在平皿的口上铺上100目不锈钢钢网(钢网尽量大于平皿)，然后将摘取的淋巴结组织放到钢网上；
[0055]
2)用10ml的注射器手柄的末端对淋巴结进行研磨，直到无组织块。此过程中，要保证淋巴结组织一直浸润在pbs中；
[0056]
3)将研磨所得细胞悬液过100目滤网转移到15ml离心管中，并用pbs冲洗平皿，尽量收集更多的细胞，减少细胞损失；
[0057]
4)离心，4℃，500rpm离心1min；
[0058]
5)淋巴结过滤液体离心后弃除上清,4℃，500xg离心4分钟去上清液；加入1ml的pbs进行细胞计数后离心，冻存于-80℃，用于后续免疫细胞的分析。
[0059]
结果如图3、图4所示，可以看出，小鼠感染hmpv病毒后，小鼠体重会下降，而利巴韦林及花椒碱组可以改善小鼠体重降低。花椒碱给药组小鼠肺脏的病毒滴度低于hmpv组，且具有统计学差异，说明花椒碱能显著降低小鼠体内的病毒滴度，对hmpv感染导致的预防呼吸道病毒肺炎具有治疗作用，且效果与阳性对照药物利巴韦林相当。
[0060]
综上，本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。以花椒或其提取物为活性成分，或者以花椒碱或其药学上可接受的盐为活性成分的药物，可以有效抑制和/或治疗冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒等呼吸道病毒感染，有很好的临床应用前景。