抗B7-H3抗体及其使用方法与流程

抗b7-h3抗体及其使用方法
1.交叉引用
2.本技术要求于2019年7月3日提交的序号为62/870,549的美国临时申请的权益，该申请的全部内容通过引用方式并入。


背景技术：

3.b7-h3(也称为cd276)是一种在抗原呈递细胞(apc)表面上表达的主要糖蛋白。在人类中，该蛋白是由15号染色体上的基因编码的。b7-h3可以抑制t细胞对肿瘤细胞的侵袭(参见，例如vigdorovich等人structure 2013 21:707
–
717和chen等人,exp.cell res.2013 319:96
–
102)，并且因此被认为是一种免疫检查点抑制剂。该蛋白来自b7分子家族，其中许多分子与已知的检查点标志物相互作用，包括ctla4、pd-1和cd28。b7-h3和pd-1都是b7/cd28超家族的成员。由于b7-h3和pd-1均诱导对t细胞的抑制效应并改变其微环境以逃避抗肿瘤免疫应答，因此b7-h3被认为是与pd-1类似的免疫治疗靶标。
4.b7-h3也在许多癌症中过度表达，尽管目前b7-h3的受体尚未被表征。它的过度表达与人类患者的预后不良以及体外模型中肿瘤的侵袭和转移潜能有关。最近的证据表明，b7-h3除了免疫调节作用之外，还影响癌症进展(参见，例如castellanos等人,am.j.clin.exp.immunol.2017 6:66
–
75)。因此，抑制b7-h3可以减少恶性细胞的增殖、进展和转移。
5.b7-h3在癌症形成中的作用和作为免疫检查点的作用使其成为一个有吸引力的治疗靶标，特别是对肺癌、乳腺癌、脑癌、肾癌和前列腺癌，以及对其它免疫检查点阻断剂具有抗性或已经变得有抗性的肿瘤。b7-h3抗体在治疗转移性神经母细胞瘤的临床试验中显示出阳性结果(kramer等人,j neurooncol.2010 97:409
–
418)。
6.因此，需要有抑制b7-h3功能的新型治疗性抗体。


技术实现要素：

7.本公开提供了与b7-h3特异性结合的抗体。这些抗体可用于各种治疗、诊断和监测应用，本文也提供了这些应用。
8.在一些实施方案中，该抗体可以包括：(a)一种可变结构域，包含：i.重链cdr1、cdr2和cdr3区，其与选自图1的抗体的重链cdr1、cdr2和cdr3区相同；和ii.轻链cdr1、cdr2和cdr3区，其与选自图2的抗体的轻链cdr1、cdr2和cdr3区相同；或(b)一种(a)的所述可变结构域的变体，其除了在(a)的可变结构域的总体cdr区中有多达10个(例如，多达9、8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸取代之外，该变体在其它方面与所述抗体可变结构域相同。
9.在一些实施方案中，该抗体包括：一种重链可变结构域，其包含与选自图1的抗体的重链可变结构域的氨基酸序列存在至少90％(例如，至少95％)同一性的氨基酸序列；和一种轻链可变结构域，其包含与选自图2的抗体的轻链可变结构域存在至少90％(例如，至少95％)同一性的氨基酸序列。
10.其可变结构域序列如图1和图2所示的抗体基本上是由鸡制备的“人类”抗体，并且
因此可以与多种哺乳动物(例如，人类、小鼠和猴)中b7-h3的表位结合。那些表位在哺乳动物中不应该具有免疫原性(因为它们已经存在)，因此本发明的抗体被认为与一些新的表位结合。此外，由于本发明的抗体可以与来自多种哺乳动物的b7-h3结合，因此本发明的抗体可能具有有益效果，因为它们的治疗潜力可以轻易地在哺乳动物的癌症模型系统(例如，小鼠)中进行测试。
附图说明
11.图1提供了54个抗b7-h3抗体重链可变区的氨基酸序列，其中由chothia方法定义的互补决定区(cdr)用方框指示。自上而下：seq id no:1-54。
12.图2提供了54个抗b7-h3抗体轻链可变区的氨基酸序列，其中由chothia方法定义的互补决定区(cdr)用方框指示。自上而下：seq id no:55-108。
13.图3是一个树状图，其示出了基于序列比较(每100个残基的氨基酸取代)的54种抗b7-h3抗体的系统发生关系。对树状图的分析表明代表了9个谱系组。每个谱系组在100个残基上有少于10个氨基酸取代。每个谱系组中的抗体可能是通过亲和力成熟起源于共同祖先。下面提供了每个谱系组中cdr的共有序列。
14.定义
15.术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留与抗原特异性结合的抗体片段，包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体，以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以可检测地进行标记，例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。抗体还可以进一步与其它部分缀合，例如特异性结合对的成员，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。还可以将抗体结合至固相支持物上，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等。该术语还包括fab’、fv、f(ab’)2和/或保留与抗原特异性结合的其它抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价或二价的。
[0016]“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体(zapata等人,protein eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶水解抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点，还有一个剩余的“fc”片段，该命名反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
[0017]“fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和结合位点。该区域由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成，处于紧密的非共价缔合状态。正是在这种构型下，每个可变结构域的三个cdr相互作用以定义在v
h-v
l
二聚体的表面上的抗原结合位点。总体来说，六个cdr赋予了抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点的亲和力。
[0018]“fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab片段与fab'片段的区别在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。fab'-sh是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多
个)带有游离巯基fab'的命名。f(ab')2抗体片段最初是作为成对的fab'片段产生的，它们之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联物也是已知的。
[0019]
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据其恒定结构域的氨基酸序列被归入两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。免疫球蛋白主要有五类：iga、igd、ige、igg和igm，而且其中几类还可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
[0020]“单链fv”或“sfv”抗体片段包含抗体的vh和v
l
结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，fv多肽进一步包含vh和v
l
结构域之间的多肽接头，这使得sfv能够形成抗原结合的所需结构。关于sfv的综述，参见pluckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编著,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。
[0021]
术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(v
h-v
l
)中的连接至轻链可变结构域(v
l
)的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。对双抗体更全面的描述，参见例如，ep 404,097；wo 93/11161；和hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)。
[0022]
如本文所用的，术语“亲和力”指的是两种作用剂可逆性结合的平衡常数，表示为解离常数(kd)。亲和力可以比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力高出至少1倍、高出至少2倍、高出至少3倍、高出至少4倍、高出至少5倍、高出至少6倍、高出至少7倍、高出至少8倍、高出至少9倍、高出至少10倍、高出至少20倍、高出至少30倍、高出至少40倍、高出至少50倍、高出至少60倍、高出至少70倍、高出至少80倍、高出至少90倍、高出至少100倍或高出至少1000倍，或者更多倍。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nm)至约0.1nm、约100nm至约1皮摩尔(pm)，或约100nm至约1飞摩尔(fm)或更高。如本文所用的，术语“亲合力(avidity)”指的是两种或更多种作用剂的复合物稀释之后对解离的抵抗力。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中涉及抗体和/或抗原结合片段时可互换使用。
[0023]
术语“结合”指的是两个分子之间的直接缔合，例如由于共价、静电、疏水和离子和/或氢键的相互作用，包括一些相互作用例如盐桥和水桥。抗b7-h3抗体与b7-h3多肽内的表位特异性结合。非特异性结合将指的是亲和力低于约10-7
m的结合，例如亲和力为10-6
m、10-5
m、10-4
m等的结合。
[0024]
如本文所用的，术语“cdr”或“互补决定区”意指存在于重链和轻链多肽的可变区内的非连续抗原结合位点。cdr已经由下列描述过，即kabat等人,j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等人,美国卫生和公众服务部,“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；和maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或移植抗体或其变体的cdr，都意在如本文所定义和使用的术语的范围内。图1和图2中所示的cdr由chothia方法来定义。然而，如下文所示，kabat和maccallum方法也可以用来定义cdr。
[0025]
表1：cdr定义
[0026] kabat1chothia2maccallum
3vh cdr131-3526-3230-35v
h cdr250-6553-5547-58v
h cdr395-10296-10193-101v
l cdr124-3426-3230-36v
l cdr250-5650-5246-55v
l cdr389-9791-9689-96
[0027]1残基编号遵循kabat等人的命名法，见上文
[0028]2残基编号遵循chothia等人的命名法，见上文
[0029]3残基编号遵循maccallum等人的命名法，见上文
[0030]
如本文所用的，当提及抗体可变区时术语“框架”意指抗体可变区内cdr区之外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度为约100-120个氨基酸的不连续氨基酸序列，但仅意指cdr之外的那些氨基酸。如本文所用的，术语“框架区”意指由cdr分隔的框架的每个结构域。
[0031]“分离的”抗体是一种已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境中的污染物组分是会干扰抗体的诊断应用或治疗应用的物质，并且可以包括酶类、激素类以及其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至以抗体重量计大于90％、大于95％或大于98％的，如按照lowry法测定，例如以重量计大于99％，(2)至通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个n-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)达到同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。在某些情况下，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0032]
如本文所用的，术语“治疗”、“处理”等指的是获得期望的药理学和/或生理学效果。从完全或部分预防疾病或其症状的方面来看，该效果可以是预防性的，和/或从部分或完全治愈疾病和/或由该疾病所致的不良反应的方面来看，该效果可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物中(尤其是人类中)疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未被确诊为患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
[0033]
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指的是哺乳动物，包括但不限于，鼠科动物(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马科动物、牛科动物、绵羊属动物、猪科动物、山羊属动物)等。
[0034]“治疗有效量”或“有效量”指的是，当施用于哺乳动物或其它受试者用于治疗疾病时，足以实现对该疾病的这种治疗的抗b7-h3抗体的量。“治疗有效量”会根据抗b7-h3抗体、接受治疗的受试者的疾病和其严重程度以及年龄、体重等而有所不同。
[0035]“生物样品”包括从个体获得的各种样品类型，并且可用于诊断或监测测定。该定义包括血液和其它生物来源的液体样品、固体组织样品如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在其获取之后以任何方式操作过的样品，例如通过用试剂处理、增溶或富集某些组分，如多核苷酸。术语“生物样品”包括临床样品，还包括培养中
的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
[0036]
如本文所用的，在抗体可变结构域的变体的上下文中，术语“总体上(collectively)”表示使用所有六个cdr来计算氨基酸取代的数量，所述变体除了“在抗体可变结构域的总体cdr区中”的限定数量的氨基酸取代之外，在其它方面与该抗体可变结构域相同。举例来说，如果变体相对于抗体可变结构域有5个氨基酸取代，那么该变体的6个cdr组合起来相对于抗体可变结构域总共有5个氨基酸取代。这个短语并不意指每个cdr都具有限定数量的氨基酸取代。
[0037]
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不意在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限定。
[0038]
在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限至下限的每一个居间值，上下至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确规定)，以及该规定范围内的任何其它规定值或居间值，都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小范围内，并且也包含在本发明内，受制于所规定范围内任何明确排除的限定。在所规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除所包括的限值中任何一个或两个的范围，也包括在发明中。
[0039]
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管也可以使用与本文所述的那些类似或等同形式的任何方法或材料来实施或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法或材料。本文所提及的所有出版物都通过引用的方式并入本文，以公开和描述引用这些出版物相关的方法和/或材料。
[0040]
必须注意的是，如本文和在所附权利要求中所用的，除非上下文中另有明确规定，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述或该(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“一种抗体”包括多个这样的抗体，并且提及“抗b7-h3抗体”包括提及一种或多种抗b7-h3抗体和其本领域技术人员已知的等同形式，等等。还应当指出，权利要求的撰写可以排除任何可选要素。因此，这种陈述旨在用作使用与叙述权利要求要素相关的专有术语诸如“唯一”、“仅仅”等的引用基础，或用作使用“否定式”限定的引用基础。
[0041]
本文所论述的出版物仅仅是为了其在本技术的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于现有发明而无权在该出版物之前。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
[0042]
发明详述
[0043]
本公开提供了对人b7-h3特异性的抗体。这些抗体可用于各种治疗、诊断和监测应用，本文也提供了这些应用。
[0044]
抗体
[0045]
主题抗体特异性结合来自人类和其它哺乳动物例如猴和小鼠的b7-h3。
[0046]
主题抗体可能与来自人类和其它哺乳动物，例如猴和小鼠的b7-h3具有高亲和力结合。例如，主题抗体可以以下列亲和力与人类、猴和/或小鼠b7-h3结合，即至少约10-7
m、至少约10-8
m、至少约10-9
m、至少约10-10
m、至少约10-11
m或至少约10-12
m，或者比10-12
m更高的亲和力。主题抗体以下列亲和力与存在于人类、猴和/或小鼠b7-h3上的表位结合，即约10-7
m至约10-8
m、约10-8
m至约10-9
m、约10-9
m至约10-10
m、约10-10
m至约10-11
m或约10-11
m至约10-12
m，或
者比10-12
m更高的亲和力。
[0047]
在一些实施方案中，主题抗体可以减少b7-h3与b7-h3配体的结合。例如，在一些实施方案中，与不存在抗体时b7-h3与b7-h3配体之间的结合程度或b7-h3活性相比，主题抗体可以减少b7-h3与b7-h3配体的结合或降低b7-h3活性至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
[0048]
术语“抗体”指的是一种蛋白质，其包含一个或多个(例如，一个或两个)重链可变区(vh)和/或一个或多个(例如，一个或两个)轻链可变区(vl)，或其能够结合表位的亚片段。vh和v
l
区域可以进一步细分为高变区，称为“互补决定区(cdr)”，vh和v
l
区域中散布着更保守的区域，称为“框架区(fr)”。已经精确定义了fr和cdr的范围(参见,kabat等人.(1991)sequences of proteins of immunological interest,第5版,美国卫生和公众服务部,第91-3242号nih出版物；chothia等人.(1987)j.mol.biol.196:901-917)。vh可以包含三个cdr和四个fr，按以下顺序从n-末端到c-末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。同样，vl可以包含三个cdr和四个fr，按以下顺序从n-末端到c-末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
[0049]
抗体的vh或vl链可以进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分，从而分别形成免疫球蛋白重链或轻链。在一个实施方案中，抗体是两条重链和两条轻链的四聚体，其中重链和轻链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区由三个结构域组成，即ch1、ch2和ch3。轻链恒定区由一个结构域组成，即cl。重链和轻链的可变区包括与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织和因子的(包括免疫系统的各种细胞和补体系统的第一组分)结合。术语“抗体”包括iga、igg、ige、igd、igm型及其亚型的完整免疫球蛋白。在一些实施方案中，主题抗体是igg同种型。
[0050]
如本文所用的术语“免疫球蛋白”，指的是由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(iga1和iga2)、γ(igg1、igg2、igg3、igg4)、δ、ε和μ恒定区基因；和许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kd或214个氨基酸)由位于n-末端(约110个氨基酸)的可变区基因和位于c-末端的κ或λ恒定区编码。全长免疫球蛋白重链(约50kd或446个氨基酸)由位于n-末端(约116个氨基酸)的可变区基因和位于c-末端的其它前述恒定区基因之一例如γ(编码约330个氨基酸)编码。在一些实施方案中，主题抗体包含全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
[0051]
在一些实施方案中，主题抗体不包含全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链，而是包含全长免疫球蛋白重链和/或全长免疫球蛋白轻链的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包含在分别的多肽链上；在其它实施方案中，抗原结合片段包含在单个多肽链中。术语“抗原结合片段”指的是能够与如上文所述的b7-h3特异性结合的全长抗体的一个或多个片段。结合片段的示例包括(i)fab片段(由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段)；(ii)f(ab')2片段(一种二价片段，其包括通过铰链区处的二硫键连接的两个fab片段)；(iii)fd片段(由vh和ch1结构域组成)；(iv)fv片段(由抗体单臂的vh和vl结构域组成)；(v)dab片段(由vh结构域组成)；(vi)分离的cdr；(vii)单链fv(scfv)(由抗体单臂的vh和vl结构域组成，其使用重组手段通过合成接头进行连接，使得vh和vl结构域配对形成单价分子)；(viii)双抗体(由两个scfv组成，其中vh和vl结构域连接在一起，如此使得它们不
会配对形成单价分子；每个scfv的vh与另一个scfv的vl结构域配对以形成二价分子)；(ix)双特异性抗体(由至少两个抗原结合区组成，每个区结合不同的表位)。在一些实施方案中，主题抗体片段是一种fab片段。在一些实施方案中，主题抗体片段是一种单链抗体(scfv)。
[0052]
在一些实施方案中，主题抗体是重组或修饰抗体，例如嵌合、人源化、去免疫化或体外产生的抗体。如本文所用的术语“重组”或“经修饰的”抗体，意在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(i)使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组的组合抗体库中分离出的抗体；(iii)从人免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)中分离出的抗体；或(iv)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包括人源化、cdr移植、嵌合、去免疫化和体外产生的抗体；并且可以任选地包括来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
[0053]
在一些实施方案中，主题抗体包括：可变结构域，其包含：a)重链可变结构域，包含：i.cdr1区，其在氨基酸序列上与选自图1和2中所示抗体的抗体重链cdr1区序列相同；ii.cdr2区，其在氨基酸序列上与所选抗体的重链cdr2区序列相同；和iii.cdr3区，其在氨基酸序列上与所选抗体的重链cdr3区序列相同；和b)轻链可变结构域，包含：i.cdr1区，其在氨基酸序列上与所选抗体的轻链cdr1区序列相同；ii.cdr2区，其在氨基酸序列上与所选抗体序列的轻链cdr2区相同；和iii.cdr3区，其在氨基酸序列上与所选抗体的轻链cdr3区序列相同；其中所述抗体特异性结合人类、猴、大鼠和/或小鼠b7-h3。
[0054]
在某些实施方案中，抗体包括：(a)可变结构域，其包含：i.cdr1区，其在氨基酸序列上与选自图1和2中所示抗体的抗体重链cdr1区相同；ii.cdr2区，其在氨基酸序列上与所选抗体的重链cdr2区相同；和iii.cdr3区，其在氨基酸序列上与所选抗体的重链cdr3区相同；和轻链可变结构域，包含：i.cdr1区，其在氨基酸序列上与所选抗体的轻链cdr1区相同；ii.cdr2区，其在氨基酸序列上与所选抗体的轻链cdr2区相同；和iii.cdr3区，其在氨基酸序列上与所选抗体的轻链cdr3区相同；或(b)(a)部分的可变结构域的变体，其除了在(a)的可变结构域的总体cdr区中有多达10个(例如，多达9、8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸取代之外，该变体在其它方面与(a)部分的可变结构域相同，其中该抗体与b7-h3结合。
[0055]
在一些实施方案中，抗体可以仅包含本文所述的重链可变结构域。在这些实施方案中，抗体可以是“仅有重链”抗体。
[0056]
使用图3的树状图或谱系树确定了以下共有序列。在任何实施方案中，cdr可以属于表2的任何共有序列。例如，抗b7-h3抗体可以具有cdr，该cdr属于如下文表2中定义的第i组共有序列、第ii组共有序列、第iii组共有序列、第iv组共有序列、第v组共有序列、第vi组共有序列、第vii组共有序列、第viii组共有序列或第ix组共有序列。
[0057]
表2：
[0058]
[0059][0060]
在一些实施方案中，主题抗体(例如，特异性结合b7-h3的主题抗体)可以包括：a)轻链区，其包含：i)来自所选抗b7-h3抗体的轻链可变区序列的一个、两个或三个互补决定区(cdr)；和ii)轻链框架区，例如来自人免疫球蛋白轻链的框架区；和b)重链区，其包含：i)来自所选抗体的重链可变区序列的一个、两个或三个cdr；和ii)重链框架区，例如来自人免疫球蛋白重链的框架区。
[0061]
主题抗体可以包括重链可变区，该重链可变区包含与图1中描绘的和seq id no:1-55中所示的序列存在85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。主题抗体可以包括重链可变区，该重链可变
区包含所选抗b7-h3抗体的重链互补决定区(cdr)中的一个、两个或三个。
[0062]
主题抗体可以包括轻链可变区，该轻链可变区包含与图2中描绘的和seq id no:56-110中所示的序列存在85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。主题抗体可以包括轻链可变区，该轻链可变区包含所选抗b7-h3抗体的轻链cdr中的一个、两个或三个。
[0063]
在一些实施方案中，主题抗体包括在单个多肽链中的抗b7-h3抗体重链cdr和抗b7-h3抗体轻链cdr，例如，在一些实施方案中，主题抗体是一种scfv。在一些实施方案中，主题抗体按从n-末端到c-末端的顺序包含：长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第一氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr1；长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第二氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr2；长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第三氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr3；长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第四氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的重链cdr1；长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第五氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的重链cdr2；长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第六氨基酸序列；所选抗b7-h3抗体的重链cdr3；和长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸的第七氨基酸序列。
[0064]
在一些实施方案中，主题抗体按从n-末端到c-末端的顺序可以包含：轻链fr1区；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr1；轻链fr2区；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr2；轻链fr3区；所选抗b7-h3抗体的轻链cdr3；任选地轻链fr4区；接头区；任选地重链fr1区；所选抗b7-h3抗体的重链cdr1；重链fr2区；所选抗b7-h3抗体的重链cdr2；重链fr3区；所选抗b7-h3抗体的重链cdr3；和重链fr4区。在这些实施方案的一些中，每个fr区都是人fr区。接头区的长度可以为约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如，长度为约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约35个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸或约45个氨基酸至约50个氨基酸。
[0065]
适用于主题抗体的接头包括“柔性接头”。如果存在的话，接头分子通常具有足够的长度以允许在连接的区域之间进行一些柔性移动。接头分子一般为约6-50个原子的长度。接头分子还可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。可以根据本公开来使用能与多肽结合的其它接头分子。
[0066]
可以很容易地选择适用的接头，并且接头可以是任何合适的不同长度，例如从1个氨基酸(如，gly)至20个氨基酸、从2个氨基酸至15个氨基酸、从3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
[0067]
示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，以及其它本领域已知的柔性接头。甘氨酸聚合物和甘氨酸-丝氨酸聚合物是令人感兴趣的，因为这两种氨基酸都是相对非结构化的，并因此可以用作组分间的中性系链。甘氨酸聚合物特别令人感兴趣，因为与平坦的丙氨酸相比，甘氨酸能进入显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基受限低很多(参见scheraga,rev.computational chem.11173-142(1992))。本领域普通技术人员会认识到，与上述任何元件缀合的肽的设计可以包括全部或部分柔性的接头，从而使该接头可以包括柔性接头以及赋予不那么柔性的结构的一个或多个部分。
institutes of health,bethesda,md.,1987和1991)定义了cdr和框架区。chothia等人,j.mol.biol.196:901(1987)；nature 342:878(1989)；和j.mol.biol.186:651(1989)提出了一种备选的结构定义(总体来说被称为“chothia”)。当上文由kabat定义的框架残基构成上文由chothia定义的结构环残基时，可选择存在于小鼠抗体中的氨基酸来取代到人源化抗体中。“与cdr区相邻”的残基包括与人源化免疫球蛋白链一级序列中的一个或多个cdr紧邻的位置上的氨基酸残基，例如，与由kabat定义的cdr或由chothia定义(参见，例如chothia和lesk jmb 196:901(1987))的cdr紧邻的位置上的氨基酸残基。这些氨基酸特别可能与cdr中的氨基酸相互作用，如果从接受体中选择，则特别可能使供体cdr变形并降低亲和力。此外，相邻氨基酸可以直接与抗原相互作用(amit等人,science,233:747(1986))，并且从供体中选择这些氨基酸可能是可取的，以保持原始抗体中提供亲和力的所有抗原接触。
[0074]
在一些实施方案中，主题抗体包括scfv多聚体。例如，在一些实施方案中，主题抗体是scfv二聚体(例如，包含两个串联的scfv(scfv2))、scfv三聚体(例如，包含三个串联的scfv(scfv3))、scfv四聚体(例如，包含四个串联的scfv(scfv4))，或者是大于四个scfv的多聚体(例如，串联的)。scfv单体可以通过长度为约2个氨基酸至约10个氨基酸的接头以串联的方式连接在一起，例如接头长度为2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸。合适的接头包括例如(gly)
x
，其中x是2至10的整数。其它合适的接头是上文论述的那些接头。在一些实施方案中，主题scfv多聚体中的每个scfv单体都是人源化的，如上所述。
[0075]
在一些实施方案中，主题抗体包含免疫球蛋白的恒定区(例如，fc区)。如果存在fc区，可以是人类fc区。如果存在恒定区，该抗体可以同时包含轻链和重链恒定区。合适的重链恒定区包括ch1、铰链、ch2、ch3和ch4区。本文描述的抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，包括igm、igg、igd、iga和ige，并且包括任何同种型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。合适的重链fc区的示例是人类同种型igg1 fc。轻链恒定区可以是λ或κ型。主题抗体(例如，主题人源化抗体)可以包含来自多于一个类别或同种型的序列。抗体可以表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体，表达为分别的重链、轻链，表达为fab、fab'、f(ab')2和fv，或者表达为单链抗体，其中重链和轻链可变结构域通过间隔子连接。
[0076]
在一些实施方案中，主题抗体包含位于羧基末端的游离巯(-sh)基，其中游离巯基可用于将该抗体附着到第二多肽(例如，另一种抗体，包括主题抗体)、支架、载剂等。
[0077]
在一些实施方案中，主题抗体包含一种或多种非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含羰基、乙酰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。对于合适的非天然存在的氨基酸，参见，例如第7,632,924号美国专利。包含非天然存在的氨基酸可以提供与聚合物、第二多肽、支架等的连接。例如，通过使包含羰基的水溶性聚合物(例如，peg)与包含非天然编码的氨基酸的主题抗体反应，可以制备与水溶性聚合物连接的主题抗体，该非天然编码的氨基酸包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。作为另一示例，通过使包含含炔氨基酸的主题抗体与包含叠氮部分的水溶性聚合物(例如，peg)反应，可以制备与水溶性聚合物连接的主题抗体；在一些实施方案中，将叠氮基或炔基通过酰胺键与peg分子相连。“非天然编码的氨基酸”指的是不是20种常见氨基酸之一的氨基酸，也不是吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸。可以与术语“非天然编码的氨基酸”同义使用的其它术
语是“非天然氨基酸”、“不天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”及其各种连字符连接的和非连字符连接的形式。术语“非天然编码的氨基酸”还包括但不限于，通过对天然编码的氨基酸(包括，但不限于20种常见的氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)进行修饰(例如，翻译后修饰)而生成的氨基酸，但其本身并未通过翻译复合物天然地并入增长的多肽链。这种非天然存在的氨基酸的示例包括但不限于，n-乙酰氨基葡萄糖-l-丝氨酸、n-乙酰氨基葡萄糖-l-苏氨酸和o-磷酸化酪氨酸。
[0078]
在一些实施方案中，将主题抗体连接(例如，共价连接)至聚合物(例如，除多肽以外的聚合物)。合适的聚合物包括，例如生物相容性聚合物和水溶性生物相容性聚合物。合适的聚合物包括合成聚合物和天然存在的聚合物。合适的聚合物包括，例如，取代或未取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或者支化或无支化多糖，例如均多糖或杂多糖。合适的聚合物包括，例如乙烯-乙烯醇共聚物(通常称之为通用名evoh或商品名eval)；聚甲基丙烯酸丁酯；聚羟基戊酸酯；聚l-乳酸；聚己内酯；聚丙交酯-乙交酯共聚物；聚羟基丁酸酯；聚羟基丁酸酯-戊酸酯共聚物；聚二恶烷酮；聚原酸酯；聚酸酐；聚乙醇酸；聚d,l-乳酸；聚乙醇酸-三亚甲基碳酸酯共聚物；聚磷酸酯；聚磷酸酯氨基甲酸酯；聚氨基酸；氰基丙烯酸酯；聚三亚甲基碳酸酯；聚亚氨基碳酸酯；共聚(醚-酯)(例如，聚环氧乙烷-聚乳酸(peo/pla)共聚物)；聚亚烷基草酸酯；聚磷腈；生物分子，如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、胶原蛋白和透明质酸；聚氨基甲酸酯；聚硅酮(silicones)；聚酯；聚烯烃；聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物；丙烯酸类聚合物和共聚物；卤化乙烯类聚合物和共聚物，如聚氯乙烯；聚乙烯基醚，如聚乙烯甲基醚；聚偏二卤化乙烯，如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯基芳香族化合物，如聚苯乙烯；聚乙烯基酯，如聚醋酸乙烯酯；乙烯基单体相互之间和与烯烃之间的共聚物，如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、abs树脂和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；聚酰胺，如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚氧亚甲基类；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚氨基甲酸酯；人造丝(rayon)；三醋酸酯人造丝；纤维素；纤维素醋酸酯；纤维素丁酸酯；纤维素醋酸丁酸酯；赛璐酚(cellophane)；纤维素硝酸酯；纤维素丙酸酯；纤维素醚；无定形特氟隆；聚乙二醇；和羧甲基纤维素。
[0079]
合适的合成聚合物包括未取代和取代的直链或支链聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇及其衍生物，例如取代的聚乙二醇，如甲氧基聚乙二醇及其衍生物。合适的天然存在的聚合物包括，例如白蛋白、直链淀粉、葡聚糖、糖原及其衍生物。
[0080]
合适的聚合物可以具有500da至50000da范围内的平均分子量，例如5000da至40000da或25000da至40000da。例如，在一些实施方案中，当主题抗体包含聚乙二醇(peg)或甲氧基聚乙二醇聚合物时，peg或甲氧基聚乙二醇聚合物可以具有下列范围内的分子量，即约0.5千道尔顿(kda)至1kda、约1kda至5kda、5kda至10kda、10kda至25kda、25kda至40kda或40kda至60kda。
[0081]
如上所述，在一些实施方案中，将主题抗体共价连接至peg聚合物。在一些实施方案中，将主题scfv多聚体共价连接至peg聚合物。参见，例如albrecht等人.(2006)j.immunol.methods 310:100。适用于对蛋白质进行peg化的方法和试剂在本领域中是众所周知的，并且可以见于第5,849,860号美国专利。适于与蛋白质缀合的peg通常在室温可溶于水，并且具有通式r(o-ch
2-ch2)no-r，其中r是氢或保护基团，如烷基或烷醇基团，并且其
中n是1至1000的整数。当r是保护基团时，它通常具有1至8个碳。
[0082]
与主题抗体缀合的peg可以是线性的。与主题蛋白缀合的peg也可以是支链的。支链peg衍生物，例如在第5,643,575号美国专利中描述的那些，“星形peg”和多臂peg例如在shearwater polymers,inc.目录“聚乙二醇衍生物1997-1998”中描述的那些。现有技术中描述了星形peg，包括例如在第6,046,305号美国专利中。
[0083]
可以对主题抗体进行糖基化，例如包含共价连接的碳水化合物或多糖部分。抗体的糖基化通常是n-连接或o-连接。n-连接指的是碳水化合物部分附着在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸，其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸，这些序列是碳水化合物部分酶促附着到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列中的任何一种都会产生潜在的糖基化位点。o-连接糖基化指的是将糖类n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附着到羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0084]
通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列(用于n-连接的糖基化位点)，可以方便地将糖基化位点添加到抗体中。这种改变也可以通过向原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(用于o-连接的糖基化位点)。同样，去除糖基化位点可以通过抗体的天然糖基化位点内的氨基酸改变来完成。
[0085]
在一些实施方案中，主题抗体会包含“不透辐射”的标签，例如可使用例如x射线容易地可视化的标签。不透辐射的物质是本领域技术人员所熟知的。最常见的不透辐射物质包括碘化物、溴化物或钡盐。其它不透辐射的物质也是已知的，包括但不限于有机铋衍生物(参见，例如第5,939,045号美国专利)、不透辐射的多尿烷(multiurethanes)(参见第5,346,981号美国专利)、有机铋复合物(参见，例如第5,256,334号美国专利)、不透辐射的钡多聚体复合物(参见，例如第4,866,132号美国专利)等。
[0086]
可以使用例如戊二醛、同型双功能交联剂或异型双功能交联剂将主题抗体共价连接至第二部分(例如，脂质、除主题抗体以外的多肽、合成聚合物、碳水化合物等)。戊二醛将多肽经由其氨基部分交联。同型双功能交联剂(例如，同型双功能酰亚胺酯(imidoester)、同型双功能n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯或同型双功能巯基反应性交联剂)含有两个或更多个相同的反应部分，并且可用于一步反应过程，其中将该交联剂加入含有待连接多肽混合物的溶液中。同型双功能nhs酯和酰亚胺酯交联含胺多肽。在温和的碱性ph值下，酰亚胺酯仅与伯胺反应形成亚酰胺基酰胺(imidoamides)，并且交联多肽的总电荷不受影响。同型双功能巯基反应性交联剂包括双马来酰亚胺己烷(bmh)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(dfdnb)和1,4-双(3',2'-吡啶二硫代)丙酰胺丁烷(dpdpb)。
[0087]
异型双功能交联剂具有两个或更多个不同的反应部分(例如，胺反应性部分和巯基反应性部分)，并通过胺或巯基反应性部分与一种多肽交联，然后通过未反应部分与另一种多肽反应。多种异型双功能卤代乙酰基交联剂可供选择，吡啶基二硫化物交联剂也是如此。碳二亚胺是异型双功能交联剂的一个典型示例，用于将羧基与胺偶联，从而形成酰胺键。
[0088]
可以将主题抗体固定在固相支持物上。合适的支持物在本领域中是众所周知的，尤其包括市售的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁性珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝化纤维素条、尼龙膜、片材、耐压硅胶(duracytes)、反应盘(例如，多孔板)的孔、塑
料管等。固相支持物可以包含多种物质中的任何一种，包括，例如玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。将主题抗体固定到固相支持物上的合适方法是众所周知的，包括，但不限于离子、疏水、共价相互作用等。固相支持物可以是可溶的或不溶的，例如在水溶液中。在一些实施方案中，合适的固相支持物通常不溶于水溶液。
[0089]
在一些实施方案中，主题抗体会包含可检测标签。合适的可检测标签包括通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组成。合适的标签包括，但不限于，磁性珠(例如，dynabeads
tm
)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、放射性同位素标签(例如，3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p)、酶类(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和其它通常用于酶联免疫吸附测定法(elisa)的酶)、和比色标签例如胶体金或有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
[0090]
在一些实施方案中，主题抗体包含造影剂或放射性同位素，其中造影剂或放射性同位素适用于成像，例如，对人类进行的成像过程。标签的非限制性示例包括放射性同位素，例如
1231
i(碘)、
18
f(氟)、
99
tc(锝)、
111
in(铟)和
67
ga(镓)，以及造影剂，例如钆(gd)、镝和铁。放射性gd同位素(
153
gd)也是可用的，并适用于非人类哺乳动物的成像过程。可以使用标准技术对主题抗体进行标记。例如，可以使用氯胺t或1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲对主题抗体进行碘化。对于氟化，在合成过程中通过氟离子取代反应将氟添加到主题抗体中。关于合成具有这种放射性同位素的蛋白质的综述，参见muller-gartner,h.,tib tech.,16:122-130(1998)和saji,h.,crit.rev.ther.drug carrier syst.,16(2):209-244(1999)。还可以通过标准技术用造影剂对主题抗体进行标记。例如，通过将低分子gd螯合物，如gd-二乙烯三胺五醋酸(gddtpa)或gd-四氮杂环十二烷四乙酸(gddota)缀合到抗体上，可以用gd对主题抗体进行标记。参见，caravan等人,chem.rev.99:2293-2352(1999)和lauffer等人,j.magn.reson.imaging,3:11-16(1985)。例如，通过将多聚赖氨酸-gd螯合物缀合到抗体上，可以用gd对主题抗体进行标记。参见，例如curtet等人,invest.radiol.,33(10):752-761(1998)。备选地，通过将含有gd脂质螯合剂的顺磁性多聚脂质体与亲和素和生物素化抗体一起孵育，可以用gd对主题抗体进行标记。参见，例如sipkins等人,nature med.,4:623-626(1998)。
[0091]
可与主题抗体连接的合适荧光蛋白包括，但不限于来自维多利亚多管水母(aequoria victoria)的绿色荧光蛋白或者其突变体或衍生物，例如，如描述于第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号美国专利；例如，增强型gfp，许多此类gfp可在市场上获得，如从clontech,inc.获得；红色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；来自珊瑚虫(anthozoan)物种的多种荧光和有色蛋白中的任何一种，如描述于，例如matz等人.(1999)nature biotechnol.17:969-973；等等。
[0092]
在一些实施方案中，会将主题抗体连接至(例如，共价或非共价连接)融合伴侣，例如配体；表位标签；肽；抗体以外的蛋白质；等等。合适的融合伴侣包括肽和多肽，它们赋予增强的体内稳定性(例如，延长血清半衰期)；提供纯化的便利，例如(his)n，如6his等；提供从细胞分泌融合蛋白；提供表位标签，例如gst、血凝素、flag、c-myc等；提供可检测信号，例
如，产生可检测产物的酶(如β-半乳糖苷酶、荧光素酶)，或者自身可检测的蛋白质，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等；提供多聚功能，例如多聚化结构域，如免疫球蛋白的fc部分；等等。
[0093]
融合还可以包括亲和结构域，其包括能够与结合伴侣(例如固定在固相支持物上的结合伴侣)相互作用的肽序列，用于鉴定或纯化。当与蛋白质融合时，连续的单个氨基酸(例如组氨酸)可以通过与树脂柱，例如镍-琼脂糖凝胶的高亲和力结合，用于融合蛋白的一步纯化。示例性的亲和结构域包括his5、hisx6、c-myc、flag、streptag、血凝素、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、硫氧还蛋白、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、s肽、t7肽、sh2结构域、c端rna标签、金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合结构域，例如那些来自钙结合蛋白的结构域，所述钙结合蛋白如钙调蛋白、肌钙蛋白c、钙调磷酸酶b、肌球蛋白轻链、恢复蛋白(recoverin)、s-调节蛋白(s-modulin)、视锥蛋白、vilip、神经钙蛋白、海马钙结合蛋白、频蛋白(frequenin)、钙牵蛋白、钙蛋白酶大亚基、s100蛋白、小清蛋白、钙结合蛋白d9k、钙结合蛋白d28k和钙视网膜蛋白、内含肽、生物素、链霉亲和素、myod、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白。
[0094]
在一些实施方案中，主题抗体会与结合内源性血脑屏障(bbb)受体的多肽融合。将主题抗体与结合内源性bbb受体的多肽连接起来有助于穿过bbb，例如在涉及将主题抗体施用于有此需要的个体的主题治疗方法中(见下文)。结合内源性bbb的合适多肽包括特异性结合内源性bbb受体的抗体，例如单克隆抗体或其抗原结合片段。合适的内源性bbb受体包括，但不限于胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦素受体、脂蛋白受体和胰岛素样生长因子受体。参见，例如公布号为2009/0156498的美国专利申请。
[0095]
在一些实施方案中，主题抗体包含多胺修饰。主题抗体的多胺修饰增强了修饰抗体在bbb处的通透性。可以用天然存在的或合成的多胺修饰主题抗体。参见，例如第5,670,477号美国专利。有用的天然存在的多胺包括腐胺、亚精胺、精胺、1,3-二氨基丙烷、去亚精胺、顺式高亚精胺、热胺(thermine)、热精胺(thermospermine)、嗜热性五胺(caldopentamine)、均嗜热性五胺(homocaldopentamine)和刀豆四胺(canavalmine)。腐胺、亚精胺和精胺特别有用。合成多胺由经验通式c
xhy
nz组成，可以是3-12个碳原子的环状或非环状、支链或无支链烃链，其进一步包括1-6个nr或n(r)2部分，其中r是h、(c
1-c4)烷基、苯基或苄基。可以使用任何标准交联方法将多胺连接到抗体上。
[0096]
在一些实施方案中，对主题抗体进行修饰以包括碳水化合物部分，其中碳水化合物部分可与抗体共价连接。在一些实施方案中，对主题抗体进行修饰以包括脂质部分，其中脂质部分可与抗体共价连接。合适的脂质部分包括，例如，n-脂肪酰基，如n-月桂酰基、n-油酰基等；脂肪胺，如十二烷基胺、油酰胺等；c3-c16长链脂肪族脂质；等等。参见，例如第6,638,513号美国专利。在一些实施方案中，将主题抗体并入脂质体中。
[0097]
产生主题抗体的方法
[0098]
主题抗体可以通过任何已知的方法产生，例如用于蛋白质合成的常规合成方法；重组dna方法；等等。
[0099]
当主题抗体是单链多肽时，其可以使用标准的化学肽合成技术来合成。如果多肽是化学合成的，则可通过液相或固相进行合成。固相多肽合成(spps)是用于化学合成主题抗体的合适方法的一个示例，在固相多肽合成中，将序列的c-末端氨基酸附着到不溶性支
持物上，随后序贯添加序列中剩余的氨基酸。各种形式的spps，如fmoc和boc，可用于合成主题抗体。用于固相合成的技术由下列描述过，即barany和merrifield,solid-phase peptide synthesis；the peptides:analysis,synthesis,biology中第3-284页.第2卷:special methods in peptide synthesis,a部分；merrifield等人.j.am.chem.soc.,85:2149-2156(1963)；stewart等人,solid phase peptide synthesis,第2版.pierce chem.co.,rockford,ill.(1984)；和ganesan a.2006mini rev.med chem.6:3-10以及camarero ja等人.2005protein pept lett.12:723-8。简言之，用功能单元处理小的不溶性多孔珠，而肽链就构建在这些功能单元上。在偶联/脱保护的重复循环之后，将固相附接的游离n-末端胺偶联至单个n-保护的氨基酸单元上。然后将该单元脱保护，露出一个新的n-末端胺，其可以再附接一个氨基酸。肽仍然固定在固相上，并且在被切割下来之前经历过滤过程。
[0100]
标准重组方法可用于产生主题抗体。例如，将编码轻链和重链可变区的核酸插入表达载体，该可变区任选地与恒定区相连。轻链和重链可以在相同或不同的表达载体中克隆。将编码免疫球蛋白链的dna片段可操作地连接到表达载体(一种或多种)中的调控序列，以确保免疫球蛋白多肽的表达。表达调控序列包括，但不限于启动子(例如，天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。表达调控序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞(例如，cos或cho细胞)的载体中的真核启动子系统。一旦载体被导入到合适的宿主中，就将宿主维持在适于核苷酸序列高水平表达的条件下，并且进行抗体收集和纯化。
[0101]
由于密码的简并性，多种核酸序列可以编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。所需核酸序列可通过从头固相dna合成或者通过对早期制备的所需多核苷酸的变体进行聚合酶链式反应(pcr)诱变来产生。寡核苷酸介导的诱变是制备靶多肽dna的取代、缺失和插入变体的合适方法的一个示例。参见adelman等人,dna 2:183(1983)。简言之，通过将编码所需突变的寡核苷酸与单链dna模板进行杂交来改变靶多肽dna。杂交之后，使用dna聚合酶合成模板的整个第二条互补链，该链整合了寡核苷酸引物，并编码靶多肽dna中的选定改变。
[0102]
合适的表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体dna的组成部分在宿主生物体中进行复制。通常，表达载体包含选择标志物(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)，以允许检测用所需dna序列转化的那些细胞。
[0103]
大肠杆菌是原核宿主细胞的一个示例，其可用于克隆编码主题抗体的多核苷酸。其它适合使用的微生物宿主包括芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，以及其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌、沙雷氏菌(serratia)和各种假单胞菌(pseudomonas)菌种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达调控序列(例如，复制起点)。此外，还会存在任何数量的各种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常会调控表达，任选地带有操纵子序列，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
[0104]
其它微生物如酵母也可用于表达。酵母菌属(saccharomyces)(例如，酿酒酵母)和毕赤酵母属(pichia)是合适的酵母宿主细胞的示例，其合适的载体根据需要具有表达调控序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它
糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素c(isocytochrome c)和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
[0105]
除了微生物体之外，哺乳动物细胞(例如，在体外细胞培养中生长的哺乳动物细胞)也可用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见，winnacker,from genes to clones,vch publishers,n.y.,n.y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括cho细胞系、各种cos细胞系、hela细胞、骨髓瘤细胞系和转化的b细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可以包括表达调控序列，例如复制起点、启动子和增强子(queen等人,immunol.rev.89:49(1986))，以及必要的信息加工位点，如核糖体结合位点、rna剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。合适的表达调控序列的示例是来源于免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见，co等人,j.immunol.148:1149(1992)。
[0106]
一旦合成(化学方式或重组方式)，完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链或主题抗体的其它形式(如，scfv等)可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等(一般参见，scopes,protein purification(springer-verlag,n.y.,(1982))。主题抗体可以是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯、至少约85％至90％纯、至少约90％至95％纯、或98％至99％纯，或者更纯，例如不含污染物，例如细胞碎片、除主题抗体之外的大分子等。
[0107]
组合物
[0108]
本公开提供了一种包含主题抗体的组合物。除了主题抗体之外，主题抗体组合物还可以包括以下一种或多种：盐，例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4等；缓冲剂，例如tris缓冲液、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉)丙磺酸(mops)、n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等；增溶剂；去污剂，例如非离子型去污剂如吐温-20等；蛋白酶抑制剂；甘油；等等。
[0109]
核酸
[0110]
本公开提供了包含编码主题抗体的核苷酸序列的核酸。可以将编码主题抗体的核苷酸序列可操作地连接到一个或多个调控元件，例如启动子和增强子，其允许该核苷酸序列在意图的靶细胞(例如，经遗传修饰以合成编码抗体的细胞)中表达。
[0111]
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中的表达，合适的启动子包括，但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。为了在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于，轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。
[0112]
在一些实施方案中，例如，对于在酵母细胞中的表达，合适的启动子是组成型启动子，如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等；或者可调控启动子，如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、pho5启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子和aox1启动子(例如用于毕赤酵母属)。选择合适的载体和启动子完全在本领域普通技术水平之内。
10:641 648,1999；ali等人,hum mol genet 5:591 594,1996；由srivastava在wo 93/09239中公开；samulski等人,j.vir.(1989)63:3822-3828；mendelson等人,virol.(1988)166:154-165和flotte等人,pnas(1993)90:10613-10617)；sv40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如miyoshi等人,pnas 94:10319 23,1997；takahashi等人,j virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自逆转录病毒的载体，如源自劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、髓系增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。
[0117]
如上所述，主题核酸包含编码主题抗体的核苷酸序列。主题核酸可以包含编码重链和轻链cdr的核苷酸序列。在一些实施方案中，主题核酸包含编码重链和轻链cdr的核苷酸序列，其中，编码cdr的序列散布有编码fr的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码fr的核苷酸序列是编码人类fr的核苷酸序列。
[0118]
细胞
[0119]
本公开提供了分离的经遗传修饰的宿主细胞(例如，体外细胞)，其经过主题核酸遗传修饰。在一些实施方案中，主题分离的经遗传修饰的宿主细胞可以产生主题抗体。
[0120]
合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如细菌细胞。例如，通过磷酸钙沉淀、deae葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知方法，可以实现将主题核酸导入宿主细胞。
[0121]
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于，hela细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(atcc)编号ccl-2)、cho细胞(例如，atcc编号crl9618、ccl61、crl9096)、293细胞(例如，atcc编号crl-1573)、vero细胞、nih 3t3细胞(例如，atcc编号crl-1658)、huh-7细胞、bhk细胞(例如，atcc编号ccl10)、pc12细胞(atcc编号crl1721)、cos细胞、cos-7细胞(atcc编号crl1651)、rat1细胞、小鼠l细胞(atcc编号ccli.3)、人胚胎肾(hek)细胞(atcc编号crl1573)、hlhepg2细胞等等。
[0122]
合适的酵母细胞包括，但不限于毕赤酵母(pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(pichia thermotolerans)、柳毕赤氏酵母(pichia salictaria)、松栎毕赤酵母(pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母(pichia pijperi)、树干毕赤酵母(pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、毕赤酵母属中的某个种(pichia sp.)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、酵母菌属中的某个种(saccharomyces sp.)、多型汉逊酵母(hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属中的某个种(kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母菌(candida albicans)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、里氏木霉(trichoderma reesei)、拉氏金孢子菌(chrysosporium lucknowense)、镰孢霉属中的某个种(fusarium sp.)、禾谷镰孢霉(fusarium gramineum)、枯萎镰孢霉(fusarium venenatum)、粗壮脉纹孢菌(neurospora crassa)、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)等等。
[0123]
合适的原核细胞包括，但不限于大肠杆菌、乳酸杆菌属(lactobacillus)菌种、沙
门氏菌属(salmonella)菌种、志贺菌属(shigella)菌种等各种实验室菌株中的任何一种。参见，例如carrier等人.(1992)j.immunol.148:1176-1181；第6,447,784号美国专利；和sizemore等人.(1995)science 270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌属菌株的示例包括但不限于，伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)。合适的志贺菌属菌株包括，但不限于弗氏志贺菌(shigella flexneri)、索氏志贺菌(shigella sonnei)和痢疾志贺菌(shigella disenteriae)。通常，实验室菌株为非致病性菌株。其它合适细菌的非限制性示例包括但不限于，枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌(seudomonas pudita)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(pseudomonas mevalonii)、类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(rhodobacter capsulatus)、深红红螺菌(rhodospirillum rubrum)、红球菌属(rhodococcus)菌种等。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。
[0124]
制剂和药物组合物
[0125]
本公开提供了包含主题抗体的组合物，包括药物组合物。通常，制剂包含有效量的主题抗体。“有效量”意思是足以产生期望结果例如肿瘤大小缩小或症状改善的剂量。通常，期望结果至少是与对照相比癌症症状的减轻。主题抗体可以以避开血脑屏障的方式递送，如下文更详细地描述的。如有必要，可对主题抗体进行配制和/或修饰以使该抗体能够穿过血脑屏障。治疗包括对已经患有疾病的患者实施治疗，从而产生治疗上的有益效果，例如改善现有症状、改善症状的潜在代谢原因、推迟或防止病症的进一步发展、和/或减轻将要或预期形成的症状的严重程度。
[0126]
制剂
[0127]
在本发明的方法中，可以使用能够产生期望治疗效果或诊断效果的任何便利的手段将主题抗体施用于宿主。因此，可以将该药剂并入多种制剂中用于治疗性施用。更具体而言，通过与适当的药学上可接受的载剂或稀释剂组合，可以将主题抗体配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
[0128]
在药物剂型中，可以将主题抗体以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独使用或以适当结合使用，以及与其它药用活性化合物联合使用。以下方法和辅料只是示例性的，而绝不是限制性的。
[0129]
对于口服制剂，主题抗体可单独使用或与适当的添加剂联合使用，以制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂一起使用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂一起使用，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂一起使用，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂一起使用，如滑石粉或硬脂酸镁；并且如期望，还可以添加稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂。
[0130]
通过将主题抗体溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂中，如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，可将主题抗体配制成注射用制剂；并且如期望，还可以添加常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
[0131]
通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合来制备包含主题抗体的药物组合物。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬
酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其它碳水化合物；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如edta；糖类，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡萄糖胺、n-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、brij pluronics、triton-x或聚乙二醇(peg)。
[0132]
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中冻干制备物要在施用之前用无菌溶液重构。用于重构冻干组合物的标准流程是重新添加一定体积的纯水(通常相当于冻干过程中去除的体积)；然而，包含抗菌剂的溶液可用于生产胃肠外施用的药物组合物；另见chen(1992)drug dev ind pharm 18,1311-54。
[0133]
主题药物组合物中的示例性抗体浓度可以是下列范围，即约1mg/ml至约200mg/ml或约50mg/ml至约200mg/ml，或约150mg/ml至约200mg/ml。
[0134]
抗体的水性制剂可在ph缓冲溶液中制备，例如ph范围为约4.0至约7.0或约5.0至约6.0，或者备选地约5.5。适用于该范围内ph值的缓冲液的示例包括磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐缓冲液和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mm至约100mm或约5mm至约50mm，这取决于例如制剂的缓冲液和所需张力。
[0135]
抗体制剂中可以包含张度剂，以调节制剂的张力。示例性张度剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖类组的任何组分以及其组合。在一些实施方案中，水性制剂是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能也是合适的。术语“等渗的”表示一种溶液，其和与之比较的一些其它溶液例如生理盐溶液或血清具有相同的张力。张度剂的用量可以为约5mm至约350mm，例如用量为100mm至350nm。
[0136]
还可以在抗体制剂中添加表面活性剂以减少配制的抗体的聚集和/或尽量减少制剂中微粒的形成和/或降低吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(poloxamer，pluronic)和十二烷基硫酸钠(sds)。合适的聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的示例是聚山梨醇酯20(以商标tween 20
tm
出售)和聚山梨醇酯80(以商标tween 80
tm
出售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的示例是以f68或poloxamer 188
tm
为名称销售的那些共聚物。合适的聚氧乙烯烷基醚的示例是那些以商标brij
tm
出售的聚氧乙烯烷基醚。表面活性剂的示例性浓度的范围为约0.001％至约1％w/v。
[0137]
还可以加入冻干保护剂，以保护不稳定活性成分(例如蛋白质)在冻干过程中不受去稳定化条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包括糖类(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以以约10mm至500nm的量包含冻干保护剂。
[0138]
在一些实施方案中，主题制剂包括主题抗体和一种或多种上文确定的试剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张度剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂，例如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵及其组合。在其它实施方案中，制剂中包含防腐剂，例如浓度范围为约0.001至约2％(w/v)。
[0139]
例如，主题制剂可以是适于胃肠外施用的液体或冻干制剂，并且可以包含：约1mg/ml至约200mg/ml的主题抗体；约0.001％至约1％的至少一种表面活性剂；约1mm至约100mm的缓冲剂；任选地约10mm至约500mm的稳定剂；和约5mm至约305mm的张度剂；以及具有约4.0至约7.0的ph值。
[0140]
作为另一个示例，主题胃肠外制剂是液体或冻干制剂，包括：约1mg/ml至约200mg/ml的主题抗体；0.04％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm蔗糖；以及具有5.5的ph值。
[0141]
作为另一个示例，主题胃肠外制剂包含冻干制剂，其包括：1)15mg/ml的主题抗体；0.04％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或2)75mg/ml的主题抗体；0.04％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或3)75mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或4)75mg/ml的主题抗体；0.04％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm海藻糖；并具有5.5的ph值；或6)75mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm海藻糖；并具有5.5的ph值。
[0142]
作为另一个示例，主题胃肠外制剂是液体制剂，包括：1)7.5mg/ml的主题抗体；0.022％吐温20w/v；120mm l-组氨酸；和250 125mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或2)37.5mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；10mm l-组氨酸；和125mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或3)37.5mg/ml的主题抗体；0.01％吐温20w/v；10mm l-组氨酸；和125mm蔗糖；并具有5.5的ph值；或4)37.5mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；10mm l-组氨酸；和125mm海藻糖；并具有5.5的ph值；或5)37.5mg/ml的主题抗体；0.01％吐温20w/v；10mm l-组氨酸；和125mm海藻糖；并具有5.5的ph值；或6)5mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm海藻糖；并具有5.5的ph值；或7)75mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm甘露醇；并具有5.5的ph值；或8)75mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和140mm氯化钠；并具有5.5的ph值；或9)150mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm海藻糖；并具有5.5的ph值；或10)150mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和250mm甘露醇；并具有5.5的ph值；或11)150mg/ml的主题抗体；0.02％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和140mm氯化钠；并具有5.5的ph值；或12)10mg/ml的主题抗体；0.01％吐温20w/v；20mm l-组氨酸；和40mm氯化钠；并具有5.5的ph值。
[0143]
主题抗体可用于要经由吸入施用的气雾剂中。可以将主题抗体配制进入加压可接受的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
[0144]
此外，通过与多种基质例如乳化基质或水溶性基质混合，可以将主题抗体制成栓剂。主题抗体可以通过栓剂进行直肠施用。栓剂可以包括媒介物，如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，其在体温熔化而在室温固化。
[0145]
可以提供经口或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂都包含预定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。同样，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以包含组合物中的主题抗体，该组合物作为溶于灭菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载剂中的溶液。
[0146]
如本文所用的术语“单位剂型”，指的是适合用于作为人类和动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位，每个单位都含有预定量的本发明的化合物，其量计算为足以与药学上可接受的稀释剂、载剂或媒介物一起产生预期效果。主题抗体的规格可能取决于所用
的特定抗体和要达到的效果，以及在宿主中与每种抗体相关的药效动力学。
[0147]
其它施用方式也可用于本发明。例如，可以将主题抗体配制成栓剂，并且在某些情况下，配制成气雾剂和鼻内组合物。对于栓剂，媒介物组合物将包括传统的粘合剂和载剂，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。这种栓剂可以由含有活性成分的混合物形成，该活性成分的范围为约0.5％至约10％(w/w)，例如约1％至约2％。
[0148]
鼻内制剂会通常包括既不会对鼻粘膜造成刺激也不会明显干扰纤毛功能的媒介物。可以将稀释剂如水、盐水或其它已知物质用于本发明。鼻腔制剂也可以含有防腐剂，例如但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可以存在表面活性剂以促进鼻粘膜对主题蛋白的吸收。
[0149]
可以将主题抗体以注射制剂的形式施用。通常，将注射用组合物制备成液体溶液或混悬液；也可以制备成适于在注射之前溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。还可以对制剂进行乳化，或者将抗体封装在脂质体媒介物中。
[0150]
合适的赋形剂媒介物是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如期望地，媒介物可以含有少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。制备此类剂型的实际方法对本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。参见，例如remington's pharmaceutical sciences,mack publishing company,easton,pennsylvania,第17版,1985年。在任何情况下，待施用的组合物或制剂将包含足以在接受治疗的受试者中达到期望状态的主题抗体的量。
[0151]
药学上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载剂或稀释剂，都是公众可以轻易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等，都是公众可以轻易获得的。
[0152]
在一些实施方案中，将主题抗体配制成受控释放型制剂。可以使用本领域中众所周知的方法来制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中的基质为成型制品的形式，如薄膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚酯、l-谷氨酸和乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、水凝胶、聚丙交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。通过使用适当的添加剂、控制水分含量和开发特定的聚合物基质组成，可以防止缓释制剂中包含的抗体的生物活性的可能丧失和免疫原性的可能变化。
[0153]
本发明范围内的受控释放可以理解为指多种延长释放剂型中的任何一种。就本发明而言，以下术语可被视为实质上等同于受控释放：连续释放、控制释放、延迟释放、贮库、逐步释放、长期释放、程序化释放、持久释放、按比例释放、拖延释放、储存库、延缓、缓慢释放、间隔释放、持续释放、时间包衣、定时释放、延迟作用、延长作用、分层时间作用、长效、持久作用、重复作用、缓慢作用、持续作用、持续作用的药物和延长释放。对这些术语的进一步论述可以见于lesczek krowczynski,extended-release dosage forms,1987(crc press,inc.)。
[0154]
各种受控释放技术涵盖了非常广泛的药物剂型。受控释放技术包括，但不限于物理系统和化学系统。
[0155]
物理系统包括，但不限于带有速率控制膜的储库式系统，例如微胶囊化、大胶囊化和膜系统；不带速率控制膜的储库式系统，例如中空纤维、超微孔纤维素三醋酸酯以及多孔聚合物基材和泡沫；单块式系统(monolithic system)，包括物理溶解在无孔、聚合或弹性
体基质(例如，不易溶蚀的、易受溶蚀的、环境剂侵入和可降解)中的那些系统，和物理分散在无孔、聚合或弹性体基质(例如，不易溶蚀的、易受溶蚀的、环境剂侵入和可降解的)中的材料；层状结构，包括化学性质与外部控制层相似或不同的储层；和其它物理方法，如渗透泵或吸附到离子交换树脂上。
[0156]
化学系统包括，但不限于聚合物基质的化学溶蚀(例如，异质或均质溶蚀)，或聚合物基质的生物溶蚀(例如，异质或均质)。关于控释系统类别的其它论述可以见于agis f.kydonieus,controlled release technologies:methods,theory and applications,1980(crc press,inc.)。
[0157]
有许多为经口施用而开发的控释药物制剂。这些包括，但不限于渗透压控制的胃肠道递送系统；流体压控制的胃肠道递送系统；膜渗透控制的胃肠道递送系统，其中包括微孔膜渗透控制的胃肠道递送装置；耐胃液肠道靶向性控释胃肠道递送装置；凝胶扩散控制的胃肠道递送系统；和离子交换控制的胃肠道递送系统，其中包括阳离子和阴离子药物。有关控释药物递送系统的其它信息可见于yie w.chien,novel drug delivery systems,1992(marcel dekker,inc.)。本文论述了这些制剂中的一些。
[0158]
剂量
[0159]
主治医师或其他合格的医务人员可以根据各种临床因素确定合适的剂量。正如医学领域中众所周知的那样，对于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、患者性别、施用时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其它药物。主题抗体的施用量可以为每剂量1ng/kg体重至20mg/kg体重，例如0.1mg/kg体重至10mg/kg体重，例如0.5mg/kg体重至5mg/kg体重；然而，低于或高于该示例性范围的剂量是涵盖的，特别是考虑到上述因素。如果方案是连续输注，剂量也可以在每分钟每千克体重1μg至10mg的范围内。
[0160]
本领域技术人员会很容易理解到，剂量水平可以根据特定抗体、症状的严重程度和受试者对副作用的易感性而变化。本领域技术人员可以通过多种方式很容易地确定给定化合物的优选剂量。
[0161]
施用途径
[0162]
使用任何适用于药物递送的现有方法和途径，包括体内和离体方法，以及全身和局部施用途径，将主题抗体施用于个体。
[0163]
在一些实施方案中，可以将抗体在10-60分钟(例如，30分钟)内，每2-4周(例如，3周)1次，在药学上可接受的载剂(例如pbs)中以静脉内输注(200mg或2mg/kg，多达200mg)的方式施用于患者。
[0164]
常规的和药学上可接受的施用途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、真皮内、局部应用、静脉内、动脉内、经直肠、经鼻腔、经口和其它肠内和胃肠外施用途径。如有期望，可以组合施用途径，或者根据抗体和/或预期效果进行调整。主题抗体组合物可以以单剂量或多剂量施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物经口施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物经由吸入途径施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物鼻内施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物局部施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物颅内施用。在一些实施方案中，将主题抗体组合物静脉内施用。
[0165]
可以使用任何现有的适合于常规药物递送的常规方法和途径，包括全身或局部途
径，将药剂施用于宿主。一般而言，本发明涵盖的施用途径包括但不一定限于肠内、胃肠外或吸入途径。
[0166]
除吸入施用以外的胃肠外施用途径包括但不一定限于，局部、经皮、皮下、肌内、眶内、囊内、椎管内、胸骨内和静脉内途径，即除通过消化道以外的任何施用途径。可以进行胃肠外施用以实现主题抗体的全身或局部递送。在需要全身递送的情况下，施用通常涉及药物制备物的侵入性或全身吸收的局部或粘膜施用。
[0167]
还可以将主题抗体通过肠内施用递送至受试者。肠内施用途径包括，但不一定限于经口和直肠(例如，使用栓剂)递送。
[0168]
所谓治疗，意指至少改善与折磨宿主的病理状况相关的症状，其中改善在广义上用来指至少降低与接受治疗的病理状况(例如癌症和与其相关的疼痛)相关参数(例如症状)的幅度。因此，治疗还包括病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如防止发生)或停止(例如终止)的情况，如此使得宿主不再遭受病理状况或至少体现该病理状况的症状的困扰。
[0169]
在一些实施方案中，通过注射和/或递送来施用主题抗体，例如施用至脑动脉中的某个部位或直接施用至脑组织内。还可以将主题抗体直接施用到靶部位，例如通过生物弹击法递送至靶部位。
[0170]
多种宿主(其中术语“宿主”在本文中可与术语“受试者”、“个体”和“患者”互换使用)可根据主题方法进行治疗。通常此类宿主是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语被广泛用于描述哺乳动物纲中的生物体，包括食肉目动物(例如狗和猫)、啮齿目动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目动物(例如人类、黑猩猩和猴)。在一些实施方案中，宿主会是人类。
[0171]
本文提供了具有单位剂量(例如以口服或注射剂量)的主题抗体的试剂盒。在这样的试剂盒中，除了包含单位剂量的容器之外，还会有信息包装插页，其描述了抗体在治疗感兴趣的病理状况中的用途和伴随的益处。优选化合物和单位剂量为上文所述的化合物和单位剂量。
[0172]
治疗方法
[0173]
本公开提供了治疗癌症的方法，该方法通常涉及单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种其它治疗剂联合(例如，在联合疗法中)向有此需要的个体(例如，患有癌症的个体)施用有效量的主题抗体。
[0174]
在一些实施方案中，主题抗体的有效量是这样的量，即当以一个或多个剂量单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种其它治疗剂联合(例如，在联合疗法中)施用时，与不存在用该抗体治疗时的不良症状的严重程度相比，能有效地将癌症的不良症状减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
[0175]
在一些实施方案中，主题抗体的有效量是这样的量，即当以一个或多个剂量单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种其它治疗剂联合(例如，在联合疗法中)施用时，能有效缩小接受治疗个体中的肿瘤大小。例如，与不存在用该抗体治疗时的肿瘤大小相比，有效量的主题抗体可将个体中的肿瘤大小缩小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多。
[0176]
联合疗法
[0177]
在一些实施方案中，主题治疗方法涉及施用主题抗体和一种或多种其它治疗剂。合适的其它治疗剂包括，但不限于免疫检查点抑制剂，例如抗ctla-4抗体、抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗tim-3抗体、抗vista抗体、抗lag-3抗体、抗ido抗体或抗kir抗体，尽管其它抗体也是已知的。在一些实施方案中，治疗还可以包括共刺激抗体，例如针对cd40、gitr、ox40、cd137或icos的抗体。在一些实施方案中，抗体可以是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体或抗ctla-4抗体。此类抗体的示例包括，但不限于：伊匹单抗(ctla-4)、纳武单抗(pd-1)、帕博利珠单抗(pd-1)、阿特珠单抗(pd-l1)、阿维鲁单抗(pd-l1)和德瓦鲁单抗(pd-l1)。这些疗法可以相互联合和/或与其它疗法联合。在一些实施方案中，根据患者的体重，施用的剂量可以在1mg/kg至10mg/kg的范围内，或者每几周(例如，每3周)在50mg至1.5g的范围内。在某些实施方案中，患者将在不知道肿瘤的pd1、pd-l1、ctla-4、tim-3、vista、lag-3、ido或kir状态的情况下，使用一种或多种抗体治疗。
[0178]
适合治疗的受试者
[0179]
多种受试者适合采用主题方法进行治疗。合适的受试者包括任何个体例如人，其患有癌症、已被确诊患有癌症、有发生癌症的风险、已患有癌症并且有癌症复发的风险或者正在从癌症中康复。在一些实施方案中，患者可能患有肺癌、乳腺癌、脑癌、肾癌和前列腺癌。在这些实施方案中，b7-h3抗体可能具有fc依赖性免疫效应机制，如补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。在这些实施方案中，抗体可以与杀伤与其结合的细胞的部分偶联。
[0180]
在其它实施方案中，该抗体可以用作免疫检查点抑制剂，其可能与另一种免疫检查点抑制剂联合起来，以治疗患有例如皮肤黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤的患者，所有这些都可以通过免疫阻断来治疗。
实施例
[0181]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且并不意在限制本发明人视为其发明的范围，也不意在表示以下实验是实施的所有或唯一实验。已经努力确保所用数字方面的准确性(例如，量、温度等)，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度单位是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
[0182]
实施例1
[0183]
抗b7-h3拮抗性抗体的产生和表征
[0184]
产生抗b7-h3人单克隆抗体，其使用在表达鸡的重链恒定区的同时，表达人抗体基因：人轻链(vlcl或vkck)和人vh的转基因鸡(omnichicken
tm
)(ching等人2018mabs.2018 10:71
–
80)。
[0185]
用200ug的fc标记的人b7-h3(acro biosystems货号cd8-h5253)免疫三只转基因鸡，然后每14天用100ug的抗原加强免疫三次。通过在人和鼠his标记的b7-h3(acro biosystems货号分别为b73-h52e2和b73-m52h4)上的elisa，来监测血清免疫应答。
[0186]
将脾细胞分离出来，并使用gem测定法进行测试，如下列中所述，即(mettler izquierdo等人2016microscopy(oxf).2016 65:341
–
352)。简言之，用his标记的人b7-h3(life technologies货号a37296)包被大珠(life technologies货号a37306)，并用his标记的小鼠b7-h3包被小珠(life technologies货号a37296)，包被时间过夜。在室温下，将珠在含有3％乳的dpbs中封闭1小时，然后在dpbs中洗涤三次。将珠以5:1的比例(小珠多于大珠)与1
×
107个原代脾细胞和用于检测的alexa fluor 594缀合的山羊抗鸡igy(thermo fisher scientific货号a-11042)混合。将混合物铺板，并使用cy3滤光片在显微镜下检测阳性克隆。筛选出分泌与珠结合的igy的细胞。
[0187]
将阳性克隆转移到含有pcr混合物的96孔板中，该混合物由dntp、引物和酶混合物组成。
[0188]
将重链和轻链的可变区进行克隆并组装到单链fv-fc(scfv-fc)哺乳动物表达载体中。由genewiz进行sanger测序，并且使用dnastar lasergene 15对序列进行评估。使用expifectamine转染试剂和补充剂(life technologies,货号a14524)转染之后，独特的scfv-fc在生长于expi293表达培养基(life technologies,货号a1435101)中的expi293细胞(life technologies,货号a14527)中瞬时表达。将细胞在5％co2的湿化培养箱中于37℃摇晃培养3-5天。收集上清液，使用blitz仪器(pall fortebio)进行定量，并通过elisa在板上测试结合活性，该板包被有不同物种(人类、小鼠和食蟹猴(acro biosystems货号分别是cd8-h5224、cd8-m5223和cd8-c5223))的his标记的b7-h3蛋白或兔抗人fc(rockland货号609-4103,阳性对照)或不相关的his标记的蛋白(阴性对照)。
[0189]
通过流式细胞术评估抗b7-h3抗体与细胞系的结合。简言之，将大约1.5e5个表达b7-h3的cho细胞(genescript)或亲本cho细胞(atcc)重新悬浮在含有10ug/ml的抗b7-h3抗体的facs缓冲液(pbs/1％bsa/0.01％nan3)中，并在冰上孵育60分钟。将细胞洗涤两次，并重新悬浮在含有alexafluor 647缀合的驴抗人fc(jackson immunoresearch laboratories货号709-605-098)的facs缓冲液中，在冰上放置60分钟。然后，将细胞洗涤两次，重新悬浮在facs缓冲液中，并在attune流式细胞仪(life technologies)上读取结果。数据以平均荧光强度(mfi)表示。共有54种抗体显示出与细胞的明显结合。其中2种在elisa中没有显示出明显结合，因此无法确定物种交叉反应性。在剩下的52种中，全部结合了食蟹猴b7-h3，并且只有1种没有结合鼠b7-h3。
[0190]
在carterra lsa仪器上，通过表面等离子共振(spr)测量了抗b7-h3抗体与b7-h3的结合亲和力。将山羊抗人fc抗体与hc30m芯片进行了胺偶联。用hbste将scfv-fc上清液稀释30倍，并通过抗人fc偶联的hc30m芯片进行捕获。从400nm开始，将1:2稀释系列的his标记的b7-h3注射到芯片上进行结合。使用carterra tm动力学软件对数据进行分析。
[0191]
对于表位分仓(epitope binning)，将含有scfv-fc(称为配体scfv-fc)的上清液稀释50倍，并通过磺基-nhs/edc偶联化学与hc2000m芯片偶联，然后用乙醇胺封闭。在分仓实验的每个循环中，将100nm his标记的人b7-h3注射到整个阵列中，然后将在hbste bsa中稀释40倍的单个scfv-fc上清液(称为分析物scfv-fc)注射到整个阵列中，以将结合到配体scfv-fc上的抗原夹在中间。在每个循环结束时，用ph值为2的10mm甘氨酸再生芯片，以去除结合的抗原和分析物scfv-fc。对所有分析物上清液重复该程序。用carterra表位软件进行表位分仓分析。在该抗体队列中鉴定了五种表位仓(epitope bin)。
[0192]
使用表达人fcγriiia v158(高亲和力)的报告细胞作为效应细胞(promega货号g7010)进行adcc报告测定。靶细胞为a498细胞(atcc编号htb-44,肾癌细胞)或稳定转染了b7-h3的cho-k1细胞(genscript货号m00536)。将纯化的抗b7-h3抗体(上述scfv-fc被转化为igg，表达并纯化)以10μg/ml的最高浓度加入到靶细胞中，然后进行7个点的系列对数稀释，还有未处理的样品对照。加入效应细胞，在37℃、5％co2条件下，将板孵育6小时。一式三份对样品进行操作。加入bio-glo荧光素酶底物并孵育10分钟，然后用perkinelmer 2300enspire平板读数仪进行化学发光测量。将数据绘制成图表，并通过使用graphpad prism的曲线拟合来确定每种抗体的ec
50
。测试的54种抗体中有37种在a498靶细胞上表现出adcc活性，并且54种抗体中有52种在cho-k1/b7-h3靶细胞上表现出adcc活性。
[0193]
这些测定的结果如下表3-5所示：
[0194]
表3：elisa和mfi数据
[0195]
[0196]
[0197][0198]
表4：分仓和carterra lsa动力学数据
[0199]
[0200][0201]
表5：ec
50
值
[0202]
[0203]
[0204][0205]
虽然已经参照本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以作出各种改变和等同替换。此外，可以进行许多修改以使具体的情况、材料、物质组成、工艺、单个工艺步骤或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都在所附权利要求的范围内。