具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物及其制备方法、应用与流程

1.本发明涉及生物植入材料技术领域，特别涉及一种具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.牙齿缺失已经成为影响广大患者身心健康的常见疾病，而口腔种植体作为修复口腔牙列缺损和牙列缺失的最有效方案之一，能够恢复患者口颌系统形态和功能，可以明显的改善患者的生活质量。工业纯钛因其高金属性能、高耐腐蚀性、优良的生物相容性及骨结合性能而成为人工种植体的首选材料。
3.然而，在钛植入物和骨之间通常没有直接的接触，而是形成了一层纤维组织，从而导致种植体骨结合不良而失败，因此，对钛金属表面进行表面改性是必要的。钛种植体在经过一定的表面处理之后，可以改变其表面特性，促进细胞的黏附和蛋白质的吸附，促进成骨，缩短骨结合的时间，有利于患者更早的恢复咀嚼功能。表面处理技术主要有机械处理、化学酸碱处理、微弧氧化、激光处理、羟基磷灰石涂层、离子注入和阳极氧化等，用以去除钛表面的污染，形成特定的表面形貌，从而使种植体表面具有更好的生物活性，可以促进成骨细胞的黏附和骨结合。其中阳极氧化法可以得到纳米级的tio2管状阵列，tio2纳米管与在钛表面进行的外来涂层不同，是在原有的ti基底上直接产生，排列高度规整有序，比表面积较大，吸附力较强，具有较好的生物相容性，对细胞无毒，可以促进成骨细胞的黏附增殖和分化，可以通过调节电压和时间来调控纳米管的管径和厚度。单纯的酸处理在钛表面可以形成微米级的凹坑或者凹槽，而碱处理则会产生精细的纳米凹坑。
4.骨小梁结构是一种本领域人员熟知的疏松多孔网格结构，目前大量的研究通过3d打印或者激光烧结技术构建出仿骨小梁结构，经证实其有利于骨细胞的黏附增殖和分化，但是这些结构几乎都是微米级结构，关于纳米级仿骨小梁的结构很少见文献报道。而这些方法需要比较复杂的流程和昂贵的机器操作，且难以在较小或者较薄的金属材料上操作。
5.基于上述可知，通过表面改性使得钛金属表面获得特定的物理形貌，化学组成以及生物化学修饰，从而使之具有生物功能性，提高与骨组织的骨结合性能，是国内外种植材料领域研究的热点问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物的制备方法，通过本发明的方法构建纳米级别仿骨小梁的三维多孔结构修饰的钛种植体，具有简单易行，经济高效的优点。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
8.一种具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物的制备方法，所述的方法包括：
9.在电解液存在下，将钛基体m0进行阳极氧化，得到沉积二氧化钛纳米管阵列层的钛基体m1；
10.去除所述钛基体m1上负载的二氧化钛纳米管，得到负载纳米碗结构的钛基体m2；
11.将所述钛基体m2置于碱性溶液中蚀刻处理，即得所述具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物。
12.本发明的第二方面还提供了一种基于上述方法制备得到的具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物。
13.本发明的第三方面还提供了一种上述具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物在医用植入材料中的应用。
14.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
15.1、经试验研究发现，基于本发明提供的方法制备得到的具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物可在体外促进大鼠骨髓基质干细胞的黏附、增殖和分化能力，在体内促进种植体的骨整合；
16.2、本发明提供的具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物的制备方法可在任何尺寸的钛金属表面操作，操作简单，所需设备要求不高，可操作性强，具有简单易行，经济高效的优点，构建出的纳米级别仿骨小梁的三维多孔结构修饰的钛种植体具有较高的临床应用价值。
17.本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。
附图说明
18.图1示出为本发明实施例1中钛基体m0在不同处理阶段的sem图片；
19.图2示出为本发明实施例1中s-nt和p-ns样品的xps谱图；
20.图3示出为本发明实施例1中s-nt和p-ns样品的xrd谱图；
21.图4示出为本发明实施例1中s-nt和p-ns样品在形貌像和相位像的2d和3d的afm图像；
22.图5示出为本发明实施例1中s-nt和p-ns样品对rbmscs粘附和形态的影响sem图像；
23.图6示出为通过clsm进行免疫荧光检测的实施例1中s-nt和p-ns样品对rbmscs形态影响的示意图；
24.图7示出为通过活/死染色评估本发明实施例1中s-nt和p-ns样品表面rbmscs的细胞活力的示意图；
25.图8示出为第1天、第3天和第5天进行cck-8测定的结果；
26.图9示出为评估本发明实施例1中s-nt和p-ns样品的alp染色情况；
27.图10示出为评估本发明实施例1中s-nt和p-ns样品alp活性水平对比情况；
28.图11示出为本发明实施例1中s-nt和p-ns对成骨相关基因表达的影响。
具体实施方式
29.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐明本发明。
30.如前所述，本发明提供了一种具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物的制备方法，所述的方法包括：
31.在电解液存在下，将钛基体m0进行阳极氧化，得到沉积二氧化钛纳米管阵列层的钛基体m1；
32.去除所述钛基体m1上负载的二氧化钛纳米管，得到负载纳米碗结构的钛基体m2；
33.将所述钛基体m2置于碱性溶液中蚀刻处理，即得所述具有纳米仿生三维多孔钛小梁结构的钛植入物。
34.本发明提供的技术方案中，创造性的将阳极氧化和碱蚀刻处理技术结合在一起，在钛表面构建出了均一的疏松多孔纳米级仿骨小梁结构。经实验研究发现，基于本发明提供的方法制备得到的钛植入物在体外促进大鼠骨髓基质干细胞的黏附、增殖和分化能力，在体内促进种植体的骨整合。
35.根据本发明提供的方法，本发明中，阳极氧化的目的是为了在钛基体m0的表面形成二氧化钛纳米管阵列层，该阳极氧化的条件可采用本领域人员所公知的在电解液存在的条件下进行，更为具体的，本发明中，所述电解液为氟化铵的乙二醇溶液；进一步优选地，所述氟化铵的浓度优选为75-100mmol/l。更进一步优选为88mmol/l。
36.进一步的，本发明，所述阳极氧化的具体条件，例如电压、温度和阳极氧化的时间可以在较宽的范围内选择，针对本发明，所述阳极氧化的条件至少满足：电压为30-100v，温度为20-35℃，时间为2-3h；
37.进一步优选地，阳极氧化时，以石墨为阴极，将所述钛基体m0与阳极连接，在电压为60v，温度为25℃的条件下，阳极氧化处理2.5h。
38.根据本发明提供的方法，本发明中，通过去除所述钛基体m1上负载的二氧化钛纳米管，得到负载纳米碗结构的钛基体m2；
39.去除钛基体m1上负载的二氧化钛纳米管的方法具体包括，将所述钛基体m1置于含水溶液中进行超声处理。
40.本发明中，通过先去除钛基体m1上负载的二氧化钛纳米管，然后在通过碱蚀刻的技术在钛表面形成纳米级的疏松三维多孔网格结构。该多孔结构排列错落有致，极其形似“骨小梁”的结构，称之为“钛小梁”结构。而之所以要将纳米管超声震荡去除之后在进行碱蚀刻浸泡是因为光滑纯钛碱蚀刻浸泡之后也会形成孔洞，但是孔洞不连续，不能形成相互交错的三维网格结构，而纳米管直接进行碱蚀刻则会形成簇状三维不连续的结构，只有当纳米管被移除形成的纳米碗进行碱蚀刻浸泡才会形成连续的三维疏松多孔形似“骨小梁”的网格结构。
41.进一步优选地，所述的碱性溶液为碱金属或碱土金属的氢氧化物溶液；具体的，例如本领域人员所公知的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。
42.优选地，所述碱性溶液的浓度为3.5-5mol/l，进一步优选为4mol/l。
43.进一步的，所述钛金属m2置于碱性溶液中蚀刻处理的时间为1.5-3h；优选为2h。
44.进一步的，将所述钛基体m2置于碱性溶液中蚀刻处理后，在去离子水中浸泡处理，然后超声清洗、干燥，即得所述具有纳米仿生三维多孔小梁结构的钛植入物；具体的，在去离子水中的浸泡处理的时间为2h，然后超声清洗15min后干燥即可。
45.根据本发明提供的方法，本发明中，为了防止钛基体m0表面附着的油污、脏污对钛
植入物的制备产生影响，所述的方法还包括对所述钛基体m0进行表面预处理，所述表面预处理包括，用砂纸将钛基体m0表面抛光，然后分别用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗后干燥。具体的，采用800#到7000#的金相砂纸对钛基体m0表面进行逐步打磨，然后分别用丙酮、乙醇和去离子水进行超声处理。
46.以下通过具体的实施例对本发明提供的制备方法做出进一步的说明。
47.实施例1
48.本实施例提供了一种钛植入物的制备方法，包括以下步骤：
49.s1：钛基体m0预处理：
50.将0.2mm厚度的高纯钛片(钛基体m0)切割成直径为12mm的钛圆片，用800#到7000#的金相砂纸逐级抛光，然后依次在丙醇、乙醇和去离子水中超声清洗后干燥；
51.s2：阳极氧化处理
52.将预处理后的钛圆片放入88mol/l氟化铵的乙二醇电解液中，以石墨为阴极，钛圆片与阳极相连，将电压调整至60v，在25℃条件下进行阳极氧化处理2.5h，得到钛基体m1，为方便描述，将该钛基体m1称为s-nt；
53.将钛基体m1置于去离子水中超声震荡去除表面的二氧化钛纳米管阵列层，得到钛基体m2；
54.s3：制备三维多孔纳米结构
55.将钛基体m2在4mol/l的koh溶液中蚀刻处理2h，取出后在去离子水中浸泡处理2h，超声清洗15min后干燥，即得所述钛植入物，为方便描述，将该钛植入物称为p-ns。
56.相关测试如下：
57.1、表面微观结构和理化特性分析：
58.1.1、表面微观结构以及元素分析
59.在s-nt和p-ns中随机选取样品，用场发射扫描电子显微镜(sem)观察样品表面微观形貌，x射线能量色散谱(eds)分析样品表面元素组成。
60.如图1所示为本发明实施例1中钛基体m0在不同处理阶段的sem图片；其中，图1(i)为纯钛表面的状态，在纯钛表面可以看到一些划痕；
61.图1(ii)为经过阳极氧化处理后的纯钛，在纯钛表面形成了孔径约为50-100nm，厚度约为7-8μm的tio2纳米管阵列；
62.图1(iii)所示的状态为经过超声振动去除tio2纳米管阵列后，在纯钛表面留下了多边形蜂窝状均匀排列的碗型结构。
63.图1(iv)所示状态为经过碱蚀刻处理，将表面具有碗型结构的钛片浸泡在koh溶液2h后，在钛表面形成纳米级疏松三维多孔网格结构，并随机排列，与“骨小梁”结构非常相似，即本发明所称的“钛小梁”结构。
64.1.2、表面元素及化学状态
65.用x射线光电子能谱仪(xps)和x射线能量色散谱(eds)观察样品表面元素及化学状态。
66.结果：图2(a)给出了s-nt和p-ns样品的ti2p峰位附近的xps谱对比图。两个样品的ti均存在ti 2p3/2和ti 2p1/2两个峰。s-nt样品的ti 2p
3/2
和2p
1/2
结合能峰位分别是458.6ev和464.4ev，属于典型的ti
4
离子的特征峰。经过koh处理后，p-ns样品的ti 2p
3/2
和
2p
1/2
结合能峰位发生了移动，往高能移动了0.68ev分别变成了459.28ev和465.08ev，说明p-ns样品表面的ti价态不是 4价。图2(b)给出了s-nt和p-ns样品的o1s峰位附近的xps谱对比图。如图所示，与ti 3p电子一样，o1s的结合能峰位发生了往高能方向的移动，移动了1.05ev，从529.88ev移动到了约531ev的位置，应该来源于吸附的氧。这些结果说明了，s-nt样品表面的ti-o层被koh处理腐蚀了。
67.如图3给出了s-nt和p-ns样品的xrd谱图，两者的主相均可与纯ti的峰位对应。s-nt样品表层有无定形的非晶tio2，因而在xrd没有显示出对应的tio2峰位，并导致ti基底的衍射强度有所降低。koh溶液处理后，p-ns样品的衍射强度得到增大。
68.1.3、表面三维形貌和表面粗糙度
69.用原子力显微镜(afm)观察样品表面形貌和测定表面平均粗糙度值(ra和rq)。
70.结果：图4是s-nt和p-ns样品在形貌像和相位像的2d和3d的afm图像，ra是指算术平均粗糙度，是常用的粗糙度的参数，rq则是均方根粗糙度，是对应于ra的均方根的参数。本发明实施例1提供的s-nt和p-ns样品中，s-nt组的ra值是(26.82
±
1.32)nm，rq值是(34.68
±
0.70)nm；p-ns组的ra值是(43.80
±
2.78)nm，rq值是(59.29
±
4.80)nm。p-ns组的粗糙度大于s-nt组，这与sem的结果相一致。
71.2、体外生物相容性实验
72.通过sem观察大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)在s-nt和p-ns上的早期粘附(24h)和形态；激光共聚焦显微镜(clsm)观察粘附1天的细胞骨架和细胞核，以及1、4和7天的细胞活力情况；细胞计数试剂盒-8(cck-8)检测培养1、3和5天的rbmscs；碱性磷酸酶显色试剂盒和分析试剂盒评估培养4天和7天的rbmscs的alp活性；实时定量pcr(qrt-pcr)分析培养7和14天的rbmscs成骨基因(col1、alp、bmp2、runx2)的表达水平。
73.结论：
74.(1)s-nt和p-ns对rbmscs粘附和形态的影响
75.如图5所示，sem图像显示rbmscs样品在p-ns表面突出大量细长的丝状伪足，用白色箭头标记。值得注意的是，一些丝状伪足甚至长达20μm以上。我们观察到假足的末端几乎都突出到钛小梁的多孔网格结构中。然而，s-nt样品表面上rbmscs的丝状伪足明显减少和缩短，伪足末端平展在tio2纳米管口附近。
76.为了进一步评估s-nt和p-ns表面rbmscs的形态，通过clsm(图6)观察到p-ns样品表面的细胞数量略有增加，排列更紧密，具有广泛的拉伸形态。这些结果表明，与s-nt组相比，p-ns有效地促进了rbmscs的早期粘附和扩散形态，这归因于其独特的3d多孔小梁纳米结构。
77.(2)s-nt和p-ns对细胞活力和增殖的影响
78.如图7所示，绿色染色(图7中两侧live和merge所在列)的活rbmscs表现出正常的形态，并粘附在所有样本的表面，其中发现少量红色染色(图7中中间dead所在列)的死细胞。随着培养时间的延长，s-nt和p-ns表面的rbmscs数量增加。图8结果表明，p-ns表面的细胞数量逐渐增加，与s-nt相比无明显的细胞毒性。尽管在第1天和第3天，s-nt和p-ns样品之间的增殖率没有显著差异，但在第5天，p-ns表面的细胞增殖率高于s-nt(p《0.05)。这些结果表明，rbmscs在p-ns表面表现出良好的细胞活力和增殖性能。
79.(3)s-nt和p-ns对alp活性的影响
80.如图9所示，在p-ns样品上培养7天后，rbmscs显示出比s-nt样品更明显的alp染色。在第4天，s-nt和p-ns样本之间未观察到显著差异。定量分析表明，在第4天，s-nt组和p-ns组之间的alp活性没有显著差异。然而在第7天，p-ns的活性水平显著高于s-nt(图10，p《0.05)。综上所述，这些数据表明，与s-nt相比，p-ns通过上调alp活性表现出增强的成骨能力。
81.(4)s-nt和p-ns对成骨相关基因表达的影响
82.如图11所述，p-ns样品在第7天增强了col1、alp和bmp2的表达(col1和alp的p《0.05，bmp2的p《0.01)，在第14天增强了col1、alp、bmp2、runx2的表达(runx2的p《0.05，col1、alp和bmp2的p《0.01)，此时p-ns组col1、alp、bmp2和runx2的表达明显高于s-nt组。总的来说，这些结果表明p-ns在转录水平上促进成骨分化。
83.本发明采用阳极氧化与碱蚀刻处理相结合的方法，构建了纳米级疏松三维多孔网格结构。具有这种钛小梁结构的钛表面在体外可促进rbmscs的粘附、增殖和分化，在体内可促进种植体的骨整合。考虑到电化学阳极氧化法和碱蚀法简单、经济、高效的制备方法，纳米级骨小梁结构的三维多孔网格结构修饰的钛种植体具有较高的临床应用价值。
84.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的特点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。