一种创制大豆细胞核雄性不育系的基因编辑序列及方法与流程

一种创制大豆细胞核雄性不育系的基因编辑序列及方法
1.本技术主张2021年4月20日申请的申请号为202110426981.6的“一种大豆细胞核雄性不育indel标记及创制雄性不育系的方法”的优先权，原受理机构为中国。
技术领域
2.本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用crispr/cas9基因编辑技术对靶基因进行编辑以及利用该基因编辑序列创制大豆细胞核雄性不育系的方法。
技术背景
3.大豆是世界上最主要经济作物之一，营养丰富，蛋白质含量40％左右，明显超出其他主要作物的水平，油份含量能达20％左右。大豆中还含有大豆异黄酮、膳食纤维等多种人体必需的营养物质。但是目前来说，中国大豆单产低仍然是目前大豆产业急需突破的问题。我国大豆年需求量超过1亿吨，而本国产量仅能满足10％左右。因此，提高产量是目前大豆研究的首要任务。
4.杂种优势对作物产量的提高有明显的促进作用，多数作物的杂交种比常规种增产能达到20％左右。大豆雄性不育正是其杂交育种中利用的最重要的农艺性状，也是目前生产上杂交育种利用最多性状。与此同时，大豆雄性不育系的利用前景广泛，有效的解决大豆杂交困难，增加了天然异交率。因此对大豆雄性不育性状的研究、不育基因的克隆和不育分子机制的解析以及不育系的创制是大豆杂交应用、新一代杂交技术的利用以及提高大豆产量的工作基础。
5.crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/cas系统是近年来最为流行，应用最广泛的基因编辑工具中文翻译为“成簇排列的有规律间隔的短回文重复序列”，crispr/cas系统作为细菌的获得性免疫，用于抵御噬菌体入侵。cas9就像其他普通的限制性核酸内切酶一样，具有切割dna的能力，不同的是，绝大多数限制性核酸内切酶识别固定的dna序列，而cas9对dna的识别需要一个sgrna与靶dna特异配对，将cas9带到靶位点，cas9对靶位点的切割需要识别靶dna上的pam序列。
6.目前仍未有建立有效的利用基因编辑技术对某个基因靶点进行编辑，产生大豆雄性不育系的方法。而现有技术中，虽然存在对大豆植株其它性状进行分子筛选及基因编辑的方法，但是多数存在技术不稳定、时间长、技术繁琐等问题，亟需解决。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种利用基因编辑技术crispr/cas9创制大豆植株细胞核雄性不育系的基因编辑序列，该基因编辑序列是大豆植株细胞核雄性不育基因靶点的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列为seq id no.1。
8.本发明的目的之二在于提供一种利用上述基因编辑序列创制大豆植株细胞核雄性不育系的方法，该方法包括以下步骤：
9.s1.将seq id no.1所述的基因编辑序列构建在敲除表达载体pmdc123上，将敲除
后的载体命名为vector-gmnack2；
10.s2.编辑vector-gmnack2导入感受态菌株，利用感受态菌株介导大豆子叶节转化的方法进行直接器官再生的大豆遗传转化，获得转基因大豆阳性植株；
11.s3.突变体测序结果检测，对转化vector-gmnack2的转基因阳性植株进行突变体验证，先进行pcr测序，若该基因在sgrna处出现套峰，初步判定其为突变体；对初步判定为突变体的植株再进行单克隆测序，根据测序结果做最终判断；所述pcr测序和单克隆测序使用的引物对相同，该引物对正向序列如seq id no.2所示，反向序列如seq id no.3所示。
12.优选的，所述感受态菌株为农杆菌gv3101。
13.本发明的有益效果在于：
14.1.本发明利用crispr-cas9基因编辑技术通过特定靶点对gmnack2进行编辑，创制细胞核雄性不育系，有效解决了大豆杂交困难，增加天然异交率等育种遇到重大难题。
15.2.本发明利用基因编辑crispr-cas9技术对gmnack2特定靶点进行编辑，产生细胞核雄性不育系的方法，为培育大豆新品种提供了方法基础，为了提高大豆产量，在大豆遗传改良中具有重要的作用。
附图说明
16.图1为实施例1中大豆天然雄性不育株与可育株的对比，其中图1a为不育和可育植株株型及结荚情况对比，不育植株显示豆荚败育，可育植株正常结荚，图1a左侧为不育株结荚部位放大图；图1b为不育和可育植株花粉散粉特性对比，不育植株显示花粉败育，无法散粉，而可育植株花粉正常散粉；图1c是体式镜下可育和不育花药形态对比，不育植株光滑，无花粉产生，而可育植株有花粉产生。
17.图2为获得的转基因大豆阳性植株验证，图中wt代表野生型植株，可以看出，与野生型wt相比，基因编辑后的大豆柱头ms1-cas9与突变体ms1无花药产生。
18.图3为本发明中对转化vector-gmnack2的转基因阳性植株(ms1-cas9)进行突变体验证的结果，从图上可以看出该基因发生了编辑效应。
具体实施方式
19.为了便于理解，下面结合附图对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
20.如图1所示，利用前期在田间发现的1株大豆天然雄性不育株，于2013年利用其与其他大豆品种进行杂交，进而构建不育群体。2014年种植收获杂交种。随后将收获的f1代的种子种植于试验基地获得f2群体。随后2016-2019年将该群体连续繁殖，种植于安徽农业大学高新技术产业园。
21.本实施例中，对上述f2群体进行遗传学分析，在f2不育群体内892株大豆植株进行形状调查和统计，发现不育株共694株，可育株198，用spss12.0软件对得到的数据进行卡方检测分离比符合3：1的比例，如表1所示，χ
23:1
《χ
20.05
＝3.841,表明该群体的不育性状是由一个单隐性核基因控制的；田间性状调查结果显示，回交后代中性状分离比为1:1。综合上述调查的田间群体分离情况的数据来看，说明该雄性不育突变体育性受1对隐性核基因控制。
22.表1f2群体遗传学分析
[0023][0024]
对不育个体和可育个体进行重测序分析，结果显示，不育个体在13号染色体存在一个结构变异，该变异导致13号染色体38.7kb(22776268-22815034)的染色体片段缺失，其中包括glyma.13g114200基因，该基因与花粉形成相关，依据该基因设计大豆植株细胞核雄性不育基因靶点的sgrna序列，该靶点位于glyma.13g114200第一外显子75-97bp处，序列如序列表seq id no.1所示。
[0025]
利用crispr/cas9基因编辑技术以上述引物序列为基因编辑序列创制大豆细胞核雄性不育系，步骤如下：
[0026]
s1.将seq id no.1所述的基因编辑序列构建在敲除表达载体pmdc123上，将敲除后的载体命名为vector-gmnack2；
[0027]
s2.编辑vector-gmnack2导入感受态菌株，利用感受态菌株介导大豆子叶节转化的方法进行直接器官再生的大豆遗传转化，获得转基因大豆阳性植株；
[0028]
本技术感受态菌株使用农杆菌gv3101，子叶节转化为现有技术中的转化方法，具体步骤如下：
[0029]
s11.农杆菌检测：农杆菌划抗性yep平板，检测农杆菌活力、抗性、是否污染及载体抗性，并挑选成功表达的菌落进行pcr鉴定，检测无误后保存-80℃冰箱。
[0030]
s12.农杆菌活化培养：-80℃冰箱中取需要的菌种(含抗除草剂植物表达载体vector1)，接种环挑菌划在yep平板上，平板倒置，28℃黑暗培养2天；挑取培养好的单菌落2-4个接种在10ml yep液体培养基中，培养基中添加适当抗生素，在28℃，250rpm振荡培养过夜16h；取一次活化的菌液以1：1000添加新鲜yep液体培养基，继续28℃，250rpm振荡培养16h，检测培养基中菌浓度至od＝1.0-1.2。
[0031]
s13.大豆外植体制备：选取无病、无裂纹，饱满的大豆在实验室中进行湿热灭菌处理并接种于发芽培养基中放在26℃，暗处发芽1-5天。
[0032]
s14.外植体农杆菌侵染与共培养：切大豆子叶节外植体后放入含农杆菌重悬液的培养基中浸染；侵染后，外植体接种于表面铺有滤纸的共培养培养基中暗培养3-5d。
[0033]
s15.恢复培养：共培养后，将子叶插入恢复培养基中恢复5-10天。
[0034]
s16.芽诱导培养：恢复培养后，转接至芽诱导固体培养基中，根据外植体长势，将外植体切口朝上接于培养基上培养7-10天，继代一次转入含有6-8mg/l草丁膦中芽诱导培养基中，培养3周。
[0035]
s17.芽伸长培养：芽诱导完成后，留下丛生芽，接到芽伸长培养基中，培养3周继代一次。
[0036]
s18.生根培养：待丛生芽抽出3-4cm幼茎时，贴近幼茎基部将其剪下接到生根培养基中光照培养3周继代一次。
[0037]
s19.炼苗及移栽：待外植体长出根后将其移栽到营养土的塑料盆中，浇透水后用透明塑料袋遮盖保湿，一周后再生植株叶片没有雾滴撤袋后移入温室管理；炼苗后的大豆
株系即可采集叶片进行分子检测。
[0038]
s3.突变体测序结果检测：对转化vector-gmnack2的转基因阳性植株(ms1-cas9)进行突变体验证，先进行pcr测序，再进行单克隆测序。如图2所示，测序结果显示基因编辑发生在pam靶点上游1bp以及4bp，分别增加g单个碱基、缺失tc 2个碱基，测序峰图在该靶点附近显示不同的高度的套峰，表明突变体该基因发生了编辑效应。
[0039]
上述pcr测序和单克隆测序的检测引物如下：
[0040]
正向序列：tcggaagaacatggcttagctatta
[0041]
反向序列：accgaaggtgtatggtgttgta
[0042]
如图3所示，与野生型wt相比，经基因编辑后的大豆柱头ms1-cas9与突变体ms1无花药产生，证明本技术提供的基因编辑序列能够发挥基因编辑效应，因此该基因编辑靶点可以有效创制大豆雄性不育系。
[0043]
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
[0044]