Tau疫苗的异源给予的制作方法

tau疫苗的异源给予
发明领域
1.本发明处于医学领域。本发明特别涉及使用含有tau肽的脂质体引发组合物和包含缀合至免疫原性载体的tau肽的缀合物加强组合物在患有神经变性疾病、障碍或病症的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫应答的方法。
2.背景阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)为一种进行性衰弱性神经变性疾病，估计影响到全世界4400万人(alzheimers.net)。目前临床上可用的ad疗法旨在减缓临床症状的进展，但不针对疾病潜在的致病过程。不幸的是，这些疗法仅具有最小功效，并因此存在迫切的需要去开发和测试另外的预防和治疗措施。
3.阿尔茨海默病的标志性病变为包含聚集的淀粉样β蛋白的细胞外斑块和细胞内“缠结”的积聚或过度磷酸化tau蛋白的聚集。导致这些蛋白积聚的分子事件表征不佳。对于淀粉样蛋白，据假设，淀粉样蛋白前体蛋白的异常裂解导致包含氨基酸1-42的易于聚集的片段的积聚。对于tau，据假设，激酶、磷酸酶或两者的失调导致tau异常磷酸化。一旦tau变为过度磷酸化，它就失去了有效结合和稳定微管的能力，而是积聚在受影响神经元的细胞质中。未结合的和过度磷酸化的tau似乎首先形成寡聚体，并随后形成更高程度的聚集体，其存在假定可能经对正常轴突运输的干扰，对它们形成于其中的神经元的功能产生负面影响。
4.在发达国家，诊断患有阿尔茨海默病或其他痴呆性tau病的个体通常接受胆碱酯酶抑制剂(例如aricept
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)或美金刚胺(例如namenda
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)治疗。这些药物尽管耐受性相当良好，但却具有非常一般的功效。例如，在约50%经治疗的个体中，aricept
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将症状的恶化延迟了6-12个月。其余的治疗为非药理性的，并且集中于使患者在其认知能力的下降时更有能力处理日常任务。
5.几项已发表的研究(asuni aa等人, j neurosci. 2007 aug 22; 27(34):9115-29.、theunis c等人, plos one. 2013; 8(8): e72301.、kontsekova e等人, alzheimers res ther. 2014 aug 1; 6(4):44)表明，含有tau肽的活性疫苗可在小鼠或大鼠中诱导抗tau免疫应答；减少啮齿动物脑中病理性tau聚集体的积聚；和降低阿尔茨海默病动物模型中认知下降的进展速度。针对病理性tau蛋白的活性疫苗在患有阿尔茨海默病的人类患者中显示出免疫原性(novak p等人, lancet neurology 2017, 16:123-134)。wo2010/115843和wo2019/084118描述了在tau病(包括阿尔茨海默病)治疗中用于治疗和诊断用途的模拟蛋白tau的主要病理性磷酸化表位的抗原性磷酸肽以及相关组合物。然而，目前市场上仍没有获批准的有效疫苗来预防tau介导的疾病的发作。市场上也没有有效的药物在一旦疾病开始时就阻止或减缓疾病的进程。因此，存在迫切的需要去确定可预防这些疾病的新的预防措施(例如疫苗)。
发明概要
6.在本发明中令人惊讶地发现，使用各自包含磷酸肽的脂质体组合物和缀合物组合
物的异源疫苗接种增加了tau磷酸肽特异性抗体的表位覆盖范围。另外，已发现使用脂质体引发组合物的异源疫苗接种比使用缀合物引发组合物的异源疫苗接种诱导了更强的免疫应答。
7.在一个总体的方面，本发明涉及在需要其的受试者(优选患有神经变性障碍的受试者)中用于诱导针对tau蛋白的免疫应答(优选诱导针对磷酸化的tau和富集的成对螺旋丝(ephf)中的至少一种的抗体)的方法，该方法包含：(i)给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：a. 第一tau磷酸肽；b. 辅助性t细胞表位；c. 脂质化的cpg寡核苷酸；和d. 含有toll样受体4配体的佐剂；其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且引发组合物进一步包含药学上可接受载体；和(ii)给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有式(i)的结构：或具有式(ii)的结构：其中x为0至10(优选2至6，最优选3)的整数；n为3至15(优选3至12)的整数；tau肽代表第二tau磷酸肽；和载体代表免疫原性载体，其选自钥孔
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血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素、crm197和脑膜炎奈瑟菌(n. meningitidis)的外膜蛋白混合物(omp)或其衍生物；和第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体；
其中第一tau磷酸肽和第二tau磷酸肽各自独立地包含选自seq id no: 1至seq id no: 3和seq id no: 5至seq id no: 12的氨基酸序列。
8.在某些实施方案中，所述脂质体包含：a. 第一tau磷酸肽，其具有选自seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38的氨基酸序列；b. 辅助性t细胞表位，其具有选自seq id no: 39至seq id no: 44的氨基酸序列，优选辅助性t细胞表位由选自seq id no: 13至seq id no: 17的氨基酸序列组成；c. 脂质化的cpg寡核苷酸，其具有选自seq id no: 18至seq id no: 22的核苷酸序列，其中cpg寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且cpg寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；d. 单磷酰脂质a (mpla)；和所述缀合物包含第二tau磷酸肽，其具有选自seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38的氨基酸序列，经接头缀合至crm197。
9.在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：，其中n为3至7的整数。
10.根据本发明的实施方案，在需要其的受试者中用于诱导针对磷酸化的tau和富集的成对螺旋丝(ephf)中的至少一种的抗体的方法包含：(i)给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：a. 第一tau磷酸肽，其具有选自seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38的氨基酸序列；b. 辅助性t细胞表位，其具有选自seq id no: 39至seq id no: 44的氨基酸序列，优选辅助性t细胞表位由选自seq id no: 13至seq id no: 17的氨基酸序列组成；c. 脂质化的cpg寡核苷酸，其具有选自seq id no: 18至seq id no: 22的核苷酸序列，其中cpg寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且cpg寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和d. 单磷酰脂质a (mpla)；其中第一tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且引发组合物进一步包含药学上可接受载体；和(ii)给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有以下结构：
，其中n为3至7的整数，且第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体。
11.根据本技术的另一个实施方案，在需要其的受试者中用于诱导针对磷酸化的tau和富集的成对螺旋丝(ephf)中的至少一种的抗体的方法包含：(i)给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：(1) 第一tau磷酸肽，其具有seq id no:28的氨基酸序列；(2) toll样受体4激动剂，其包含单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基；(3) 辅助性t细胞表位，其包含seq id no: 39的氨基酸序列；(4) 脂质化的cpg寡核苷酸，其包含seq id no:18的核苷酸序列；和(5) 至少一种脂质，其选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3
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rac-甘油(dmpg)和胆固醇，其中第一tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且引发组合物进一步包含药学上可接受载体；和(ii)给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有以下结构：，其中n为3至7的整数，且第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体。
12.在某些实施方案中，该方法进一步包含在首次给予第一加强组合物后，将第一加强组合物给予受试者至少一次。
13.在某些实施方案中，该方法进一步包含给予受试者包含免疫学有效量的所述脂质体和药学上可接受载体的第二加强组合物。可在首次给予第一加强组合物之前或之后给予第二加强组合物。
14.在某些实施方案中，该方法进一步包含在首次给予第二加强组合物后，将第二加强组合物给予受试者至少一次。
15.根据本技术的实施方案，在需要其的受试者中用于诱导针对磷酸化的tau和富集的成对螺旋丝(ephf)中的至少一种的抗体的方法包含：(i)给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：(1) 第一tau磷酸肽，其具有seq id no:28的氨基酸序列；
(2) toll样受体4激动剂，其包含单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基；(3) 辅助性t细胞表位，其包含seq id no: 39的氨基酸序列；(4) 脂质化的cpg寡核苷酸，其包含seq id no:18的核苷酸序列；和(5) 至少一种脂质，其选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3
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rac-甘油(dmpg)和胆固醇，其中第一tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且引发组合物进一步包含药学上可接受载体；(ii)给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有以下结构：，其中n为3至7的整数，且第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体；和(iii)给予受试者第一加强组合物或包含免疫学有效量的所述脂质体和药学上可接受载体的第二加强组合物。
16.在某些实施方案中，步骤(ii)在步骤(iii)之前实施。
17.在其他实施方案中，步骤(ii)在步骤(iii)之后实施。
18.在某些实施方案中，该方法包含给予受试者第一加强组合物至少两次以加强免疫应答。
19.在某些实施方案中，该方法包含给予受试者第二加强组合物至少一次以加强免疫应答。
20.在某些实施方案中，在给予引发组合物后约27-32天给予第一加强组合物。优选地，该方法进一步包含在首次给予引发组合物后约82-87天再给予第一加强组合物，以及任选地进一步包含在给予引发组合物后约167-172天给予第二加强组合物。
21.在某些实施方案中，在给予引发组合物后约82-87天给予第一加强组合物。优选地，该方法进一步包含在给予引发组合物后约27-32天给予第二加强组合物，以及任选地进一步包含在给予引发组合物后约167-172天再给予第一加强组合物。
22.在某些实施方案中，免疫学有效量的脂质体含有每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔的第一tau磷酸肽，如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔，优选约90纳摩尔至约715纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的第一tau磷酸肽，且第一tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。在一个实施方案中，有效量的脂质体包含第一tau磷酸肽，其量为每剂约265至约275纳摩尔，例如每剂约265、约266、约267、约268、约269、约270、约271、约272、约273、约274或约275纳摩尔，或任何介于两者之间的值，如每剂约267.3纳摩尔。在另一个实施方案中，免疫学有效量的脂质体含有第一tau磷酸肽，其量为每剂约530至约540纳摩尔，如每剂约530、约531、约532、约533、
约534、约535、约536、约537、约538、约539或约540纳摩尔，或任何介于两者之间的值，如每剂约534.6纳摩尔。在另一个实施方案中，有效量的脂质体包含第一tau磷酸肽，其量为每剂约710至约720纳摩尔，如每剂约710、约711、约712、约713、约714、约715、约716、约717、约718、约719或约720纳摩尔，或任何介于两者之间的值，如每剂约712.8纳摩尔。
23.在某些实施方案中，第一tau磷酸肽由选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列组成，优选由seq id no:28的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，免疫学有效量的脂质体含有由seq id no: 28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化的tau磷酸肽，其中四棕榈酰化的tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且以每剂约100
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g至约2500
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g(相当于每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔)的量，优选以每剂约300
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g至约2400
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g(相当于每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔)，如每剂约300
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g、约900
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g、约1800
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g或约2400
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g(相当于每剂约89.1纳摩尔、约267.3纳摩尔、约534.6纳摩尔或约712.8纳摩尔)的量被给予。
24.在某些实施方案中，免疫学有效量的脂质体包含辅助性t细胞表位，其量为每剂约2纳摩尔至约110纳摩尔，如每剂约4.02纳摩尔至约100.44纳摩尔，或每剂约4纳摩尔至约75纳摩尔，如每剂约4.02纳摩尔至约72.32纳摩尔，或每剂约10纳摩尔至约105纳摩尔，如每剂约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔，或每剂约70至约105纳摩尔，如每剂约72.32纳摩尔至约100.44纳摩尔。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含优选为由seq id no: 13的氨基酸序列组成的t50辅助性t细胞表位的辅助性t细胞表位，其量为约2纳摩尔至约110纳摩尔，如约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔。
25.本发明还涉及本发明的脂质体和缀合物的疫苗组合(例如试剂盒)，其用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫应答，或者用于在需要其的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍。
26.本发明还涉及本发明的脂质体和缀合物的疫苗组合在制造药物中的用途，所述药物用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫应答，或用于在需要其的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍。
27.在阅读以下对本发明的详细描述和权利要求后将更好地意识到本发明的其他方面、特征和优点。
28.附图简述当连同附图一起阅读时，将更好地理解前述概述以及本技术的以下优选实施方案的详细描述。然而，应当理解，本技术不限于附图所示的确切实施方案。
29.图1a-1c显示由同源a-a (图1a)或b-b (图1b)疫苗接种或者由异源a-b (图1c)疫苗接种所诱导的抗体的表位识别谱，如通过对短8聚体重叠肽的表位作图elisa所确定的，所述重叠肽覆盖磷酸肽seq id no: 2和肽seq id no: 4；图2显示在异源a-b-b疫苗接种后(第162天)诱导的抗体的表位识别谱与在异源a-b-b-a疫苗接种后(第190天)诱导的抗体的表位识别谱的比较(其中a为脂质体疫苗，其包含作为佐剂的tlr4配体和脂质化的cpg寡核苷酸、1800 ug/剂乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化tau肽(对应于seq id no: 28)和包封的t50辅助性t细胞表位，而b为缀合物疫苗，其含有15 ug/剂的经接头缀合至seq id no: 2的磷酸化tau肽的crm197，且缀合物疫苗与铝佐剂(alum)和cpg寡核苷酸共注射)，如通过对短8聚体重叠肽的表位作图elisa所确定
的，所述重叠肽覆盖磷酸肽seq id no: 2和肽seq id no: 4；图3显示异源疫苗接种(a-b-b-a、a-a-b-b或b-b-a-a，其中a为脂质体疫苗，其包含作为佐剂的tlr4配体和脂质化的cpg寡核苷酸、1800 ug/剂乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化tau肽和包封的t50辅助性t细胞表位，而b为缀合物疫苗，其含有15 ug/剂的经接头缀合至seq id no: 2的磷酸化tau肽的crm197，且缀合物疫苗与铝佐剂和cpg寡核苷酸共注射)或同源疫苗接种(a-a-a-a)后在第190天时分离自阿尔茨海默病患者死后脑的富集的成对螺旋丝(ephf)的特异性igg的效价，并绘制了与a-a-a-a相比的倍数变化；图4a显示在同源(a-a-a)和异源(a-a-b和a-b-b)免疫方案后在第106天时恒河猴中具有seq id no: 2(t3.5)的序列的磷酸肽的特异性igg的效价，如通过elisa所测量的，其中数据以终点效价(ept)表示，而图4b显示在同源(a-a-a)和异源(a-a-b和a-b-b)免疫方案后在第106天时恒河猴中ephf的特异性igg的效价，以任意单位(au)/ml表示；图5显示由异源方案a-b-b-a(图5a)和a-a-b-b(图5b)诱导的ephf特异性igg抗体与由同源a-a-a-a方案诱导的抗体相比较的品质，如通过在有限包被条件中对ephf的结合所测量的，且绘制了以au/ml表达并在ephf有限包被上通过msd测量的ephf特异性igg效价；图6显示在异源疫苗接种(a-b-b-a、a-a-b-b或b-b-a-a，其中a为脂质体疫苗，其包含作为佐剂的tlr4配体和脂质化的cpg寡核苷酸、1800
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g/剂乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化tau肽和包封的t50辅助性t细胞表位，而b为缀合物疫苗，其含有15
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g/剂经接头缀合至seq id no: 2的磷酸化的tau肽的crm197并与铝佐剂和cpg寡核苷酸共注射)后在首次免疫后第183天时，恒河猴脑脊髓液(csf)中具有在n-末端生物素化的seq id no: 2的序列的磷酸肽的特异性igg的效价，并绘制了与同源疫苗接种a-a-a-a相比的倍数变化；和图7显示在同源(a-a-a-a)和异源(a-a-b-b和a-b-b-a)免疫后在首次免疫后第190天时，恒河猴中具有seq id no: 2 (t3.5)的序列的磷酸肽的特异性igg的效价与t50肽的特异性igg的效价的比率，如通过elisa所测量的。使用mann-whitney检验进行统计分析(**p《0.001)。
30.发明详述背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利，这些参考文献每份均通过参考以其全部结合至本文中。本说明书中已包括的对文件、法令、材料、装置、物品等的讨论是为了提供本发明的背景。对于所公开或要求保护的任何发明，这种讨论并非承认任何或所有这些事宜构成现有技术的一部分。
31.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。
32.必须注意的是，如本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指涉，除非上下文另外明确指出。
33.除非另外说明，否则任何数值，比如本文所述的浓度或浓度范围，在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值一般地包括所述值的
±
10%。例如，1 mg/ml的浓度包括0.9 mg/ml至1.1 mg/ml。同样地，1%至10% (w/v)的浓度范围包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。本文使用的数字范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括这种范围内的整数和该值的分数，除非上下文另外明确指明。
34.除非另外指明，否则一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同物。这种等同物预期被本发明所涵盖。
35.本文使用的术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”或其任何其他变型将理解为意指包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且预期为非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不一定仅限于那些要素，而是可包括未明确列出或这种组合物、混合物、过程、方法、物品或装置固有的其他要素。进一步地，除非明确说明相反的意思，否则“或”是指包含性的或而不是排他性的或。例如，条件1或2由以下任何一个满足：1为真(或存在)且2为假(或不存在)、1为假(或不存在)且2为真(或存在)，和1和2两者均为真(或存在)。
36.还应当理解，当指涉优选发明的组件的尺寸或特征时，本文使用的术语“大约(about)”、“大约(approximately)”、“通常(generally)”、“基本上(substantially)”以及类似术语表示所描述的尺寸/特征不是严格的界限或参数，并且不排除其在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。至少，包括数字参数的这种指涉将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)的不会改变最低有效数字的变化。
37.根据本技术的实施方案，有效量的脂质体包含tau磷酸肽，其量为每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔，如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔，优选约90纳摩尔至约715纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔，如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的包含seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列的tau磷酸肽。优选地，tau磷酸肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。更优选地，tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，有效量的脂质体包含toll样受体4激动剂和由seq id no: 28氨基酸序列组成的四棕榈酰化的tau磷酸肽，其量为每剂约100
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g至约2500
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g(优选约300
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g至约2400
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g)，相当于约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔(优选约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔)。
38.根据本技术的实施方案，有效量的脂质体包含tau磷酸肽，例如包含seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列的tau磷酸肽，优选由seq id no:27至seq id no:38之一(更优选seq id no:28)的氨基酸序列组成的tau磷酸肽，其量为每剂约100
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g至约2500
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g、约300
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g至约2400
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g、约300
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g至约1800
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g或约300
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g至约900
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g，如每剂约100
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g、约150
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g、约200
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g、约250
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g、约300
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g、约400
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g、约500
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g、约600
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g、约900
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g、约1000
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g、约1200
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g、约1300
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g、约1500
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g、约1600
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g、约2000
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g、约2100
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g、约2200
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g、约2300
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g、约2400
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g或约2500
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g，或任何介于两者之间的值。
39.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含toll样受体4激动剂，其量为每剂约30
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g至约900
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g，优选约100
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g至约585
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g。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含toll样受体激动剂单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基，其量为每剂约30
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g、约50
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g、约100
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g、约
150
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g、约200
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g、约250
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g、约300
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g、约330
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g、约360
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g、约390
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g、约420
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g、约450
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g、约480
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g、约500
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g、约520
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g、约540
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g、约560
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g、约580
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g、约600
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g、约700
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g、约800
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g或约900
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g。
40.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含脂质化的cpg寡核苷酸，其量为每剂约50
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g至约1250
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g，优选约150
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g至约800
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g。例如，有效量的脂质体可包含脂质化的cpg寡核苷酸，其量为每剂约50
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g、约100
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g、约150
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g、约200
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g或约1250
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g。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含由seq id no:18的核苷酸序列组成的cpg寡核苷酸，其量为每剂约50
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g至约1250
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g，优选约150
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g至约800
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g。
41.根据本技术的实施方案，tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。
42.本文使用的缀合物的免疫学有效量由缀合物中缀合至第二tau磷酸肽的免疫原性载体的量所定义。例如，15
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g缀合物是指含有15
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g缀合至tau磷酸肽的免疫原性载体的缀合物组合物。一个或多个tau磷酸肽可缀合至一个免疫原性载体。
43.根据本技术的实施方案，鉴于本公开，可使用本领域已知的方法(如临床实验等)确定缀合物的有效量。
44.tau磷酸肽包含seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列。优选地，存在于脂质体上的tau磷酸肽由seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38之一的氨基酸序列组成。更优选地，存在于脂质体上的tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。优选地，存在于缀合物中的tau磷酸肽由seq id no: 1-3或5-12之一(优选seq id no: 2)的氨基酸序列组成。
45.本文使用的术语“tau”或“tau蛋白”，也称为微管相关蛋白tau、mapt、神经原纤维缠结蛋白、成对螺旋丝-tau、phf-tau、maptl、mtbt1，是指具有多种同工型的丰富的中枢和周围神经系统蛋白。在人类中枢神经系统(cns)中，由于可变剪接而存在6种主要的tau同工型的长度大小在352至441个氨基酸的范围内(hanger等人, trends mol med. 15:112-9, 2009)。tau的实例包括但不限于cns中的tau同工型，比如具有四个重复和两个插入的441个氨基酸的最长tau同工型(4r2n)和具有三个重复且没有插入的352个氨基酸长的最短(胎儿)同工型(3r0n)。tau的实例还包括在周围神经中表达的“大tau”同工型，其含有300个额外的残基(外显子4a)。friedhoff等人, biochimica et biophysica acta 1502 (2000) 122-132。tau的实例包括人类大tau (其为由长为6762个核苷酸的mrna转录本(nm_016835.4)编码的758个氨基酸长的蛋白)或其同工型。举例说明的人类大tau的氨基酸序列以genbank登录号np_058519.3表示。本文使用的术语“tau”包括来自除人类以外的物种比如食蟹猴(macaca fascicularis)(猕猴(cynomolgous monkey))或黑猩猩(pan troglodytes) (黑猩猩(chimpanzee))的tau的同源物。本文使用的术语“tau”包括包含突变(例如全长野生型tau的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白。术语“tau”还涵盖tau氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于磷酸化。
46.本文使用的术语“磷酸化的tau”是指含有至少一个磷酸化的残基的tau蛋白，或者其片段或肽。
47.本文使用的术语“富集的成对螺旋丝”或“ephf”是指在成对螺旋丝中富集了tau蛋
白的制备物。phf是阿尔茨海默病神经原纤维缠结的突出组分。
48.本文使用的术语“肽”或“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体和经肽键连接的其合成的非天然存在的类似物。该术语是指任何大小、结构或功能的肽。一般地，肽长至少3个氨基酸。肽可为天然存在的、重组的或合成的或其任何组合。合成肽可例如使用自动化多肽合成仪合成。tau肽的实例包括tau蛋白的任何肽，其长度为约5至约30个氨基酸，优选长度为约10至约25个氨基酸，更优选长度为约16至约21个氨基酸。在本公开中，肽使用标准的3个或1个字母的氨基酸缩写从n到c末端列出，其中磷酸化残基用“p”指示。在本发明中有用的tau肽的实例包括但不限于包含seq id no: 1-12中任何一个的氨基酸序列的tau肽，或与seq id no: 1-12中任何一个的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列的tau肽。
49.本文使用的术语“磷酸肽”或“磷酸化表位”是指在一个或多个氨基酸残基处被磷酸化的肽。tau磷酸肽的实例包括包含一个或多个磷酸化氨基酸残基的任何tau肽。在本发明中有用的tau磷酸肽的实例包括但不限于包含seq id no: 1-3或5-12中任何一个的氨基酸序列的tau磷酸肽，或与seq id no: 1-3或5-12中任何一个的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列的tau磷酸肽。
50.本发明的tau肽可通过固相肽合成或通过重组表达系统来合成。自动肽合成仪可商购自许多供应商，如applied biosystems (foster city, calif.)。重组表达系统可包括细菌(比如大肠杆菌(e. coli))、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于重组表达的程序由sambrook等人, molecular cloning: a laboratory manual (c.s.h.p. press, ny第二版, 1989)描述。
51.tau为人类的“自身”蛋白。这意味着原则上带有tau特异性受体的所有淋巴细胞在发育期间均应已被删除(中枢耐受性)或由于周围耐受性机制呈现无应答。此问题已经证实为开发针对自身或“改变的自身”蛋白(例如肿瘤抗原)的疫苗的明显障碍。
52.产生针对抗原(自身或感染性)的高品质抗体，不仅需要产生抗体的b淋巴细胞的作用，而且还需要cd4 t“辅助性”淋巴细胞的作用。cd4 t细胞为b淋巴细胞提供关键的存活和成熟信号，而cd4 t细胞缺陷型动物则受到深刻的免疫抑制。cd4 t细胞也受到耐受性机制的影响，产生强烈的抗自身(例如抗tau)抗体应答的另一障碍为tau反应性cd4 t细胞也很可能在人类/动物库中罕见至不存在。
53.尽管不希望受到理论的束缚，但据信但决不限制本发明的范围，此问题通过本发明的疫苗组合物得以规避。
54.在一个实施方案中，产生包含tau肽的脂质体，该脂质体还包含能够结合大部分或全部hla dr (人类白细胞抗原-抗原d相关)分子的t细胞表位。然后，t细胞表位能够活化cd4 t细胞，并向tau特异性b细胞提供必要的成熟和存活信号。在另一个实施方案中，产生tau肽与载体蛋白的缀合物，其产生强烈的辅助性t细胞应答。在此实施方案中，使用“非连接识别”，其中载体特异性t细胞向自身反应性b细胞提供存活和成熟信号。因此，tau特异性b细胞接收关键信号以触发亲和力成熟、免疫球蛋白类别转换并建立长期记忆池。tau脂质体和tau缀合物可用于在同源或异源免疫方案中产生针对tau抗原的高品质抗体，其中脂质体或缀合物用于引发和/或加强。
55.脂质体
在本技术中，脂质体使用于引发组合物中，以及任选地使用于加强组合物中。对本发明的方法有用的脂质体包含：tau肽，优选tau肽为tau磷酸肽；和辅助性t细胞表位，其中tau肽存在于脂质体的表面上。
56.本发明实施方案的脂质体本文也称为“改良的脂质体”、“改良的脂质体疫苗”或“本发明实施方案的脂质体疫苗”或“tau脂质体”或“第二代脂质体”的“最佳化脂质体疫苗”。
57.本文使用的术语“脂质体”通常是指由具有高脂质含量的材料例如磷脂、胆固醇制作的脂质囊泡。这些囊泡的脂质通常以脂质双层的形式组织。脂质双层通常包封一定体积，该体积散布在脂质双层的多个洋葱状壳之间，形成多层脂质囊泡(mlv)，或者包含在无定形的中央腔内。具有无定形中央腔的脂质囊泡为单层脂质囊泡，即在腔的周围具有单一周围双层的脂质囊泡。大单层囊泡(luv)的直径通常为100 nm至几微米，比如100-200 nm或更大，而小单层脂质囊泡(suv)的直径通常小于100 nm，比如20-100 nm，一般地15-30 mm。
58.根据特定的实施方案，脂质体包含一种或多种tau肽。根据特定的实施方案，脂质体中的tau肽可以相同或不同。
59.鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的tau肽均可用于本发明。根据特定的实施方案，一种或多种tau肽包含seq id no: 1-12之一的氨基酸序列。在其他实施方案中，一种或多种tau肽包含与seq id no: 1-12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中没有一个氨基酸残基被磷酸化，或者一个或多个氨基酸残基被磷酸化。
60.根据特定的实施方案，一种或多种tau肽为tau磷酸肽。根据特定的实施方案，该一种或多种tau磷酸肽包含seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列，或者与seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中一个或多个所示氨基酸残基被磷酸化。优选地，tau磷酸肽包含seq id no: 1-3之一的氨基酸序列。tau肽可具有酰胺化的c-末端。
61.根据本技术的实施方案，tau肽存在于脂质体的表面上。鉴于本公开，可使用本领域已知的方法使tau肽(优选tau磷酸肽)存在于脂质体的表面上。参见例如美国专利号8647631和9687447中的相关公开，其内容通过参考结合至本文中。根据特定的实施方案，该一种或多种tau肽(包括磷酸肽)进一步包含一种或多种修饰，比如棕榈酰化或十二烷基修饰，以允许tau肽存在于脂质体的表面上。可向tau肽添加另外的氨基酸残基，比如lys、cys或有时为ser或thr，以促进修饰。据报道，脂质锚的位置诱导肽序列的不同构象(hickman等人, j. biol. chem. vol. 286, no. 16, pp. 13966-13976, 2011年4月22日)。尽管不希望受到理论的束缚，但据信在两个末端均添加疏水部分可增加tau肽的病理性β-折叠构象。因此，该一种或多种tau肽在两个末端进一步包含疏水部分。修饰的tau肽可具有酰胺化的c-末端。优选地，存在于脂质体表面上的tau肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。更优选地，该肽为具有选自seq id no:27至seq id no:29或seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列的tau磷酸肽。
62.本文使用的术语“辅助性t细胞表位”是指包含能够被辅助性t细胞识别的表位的
多肽。辅助性t细胞表位的实例包括但不限于破伤风类毒素(例如p2和p30表位，也分别称为t2和t30)、乙型肝炎表面抗原、霍乱毒素b、类毒素、白喉类毒素、麻疹病毒f蛋白、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)环子孢子t、恶性疟原虫cs抗原、曼氏血吸虫(schistosoma mansoni)磷酸丙糖异构酶、百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌(clostridium tetani)、粗体鸡皮衣(pertusaria trachythallina)、大肠杆菌trat和流感病毒血凝素(ha)。
63.鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的辅助性t细胞表位均可用于本发明。根据特定的实施方案，辅助性t细胞表位包含选自seq id no:23至seq id no:26的至少一个氨基酸序列。优选地，辅助性t细胞表位包含经接头(如肽接头，其包含一个或多个氨基酸例如val(v)、ala (a)、arg (r)、gly (g)、ser (s)、lys (k))融合在一起的seq id no:23至seq id no:26的两个或更多个氨基酸序列。接头的长度可以变化，优选1-5个氨基酸。优选地，辅助性t细胞表位包含经选自vvr、gs、rr、rk的一个或多个接头融合在一起的seq id no:23至seq id no:26的三个或更多个氨基酸序列。辅助性t细胞表位可具有酰胺化的其c-末端。
64.根据本技术的实施方案，可将辅助性t细胞表位掺入脂质体表面，例如由共价结合的疏水部分锚定，其中所述疏水部分为烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是烷基或脂肪酸，特别是具有至少3个碳原子，特别是至少4个碳原子的，特别是至少6个碳原子的，特别是至少8个碳原子的，特别是至少12个碳原子的，特别是至少16个碳原子的碳骨架的烷基或脂肪酸。在本发明的一个实施方案中，疏水部分为棕榈酸。或者，辅助性t细胞表位可包封于脂质体中。根据特定的实施方案，辅助性t细胞表位包封于脂质体中。
65.鉴于本公开，可使用本领域已知的方法，针对其在脂质体中期望的位置修饰辅助性t细胞表位。根据特定的实施方案，对本发明有用的辅助性t细胞表位包含seq id no:39至seq id no:44之一的氨基酸序列。优选地，辅助性t细胞表位由选自seq id no:13至seq id no:17的氨基酸序列组成。
66.根据特定的实施方案，脂质体包含tau肽和辅助性t细胞表位，其重量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1或6:1。
67.在实施方案中，脂质体进一步包含含有toll样受体配体的至少一种佐剂。因此，在另一个总体的方面，本发明涉及脂质体，其包含：tau肽，优选tau磷酸肽；辅助性t细胞表位；和以下的至少一种：toll样受体9配体，和toll样受体4配体。
68.本文使用的术语“toll样受体”或“tlr”是指在先天性免疫应答中起关键作用的一类模式识别受体(prr)蛋白。tlr识别来自微生物病原体(比如细菌、真菌、寄生虫和病毒)中的可与宿主分子区分的病原体相关分子模式(pamp)。tlr为跨膜蛋白，一般作为二聚体起作用，并由参与先天性免疫应答的细胞(包括抗原呈递树突状细胞和吞噬性巨噬细胞)表达。存在至少10个人类tlr家族成员，tlr1至tlr10，以及至少12个鼠类tlr家族成员，tlr1至
tlr9和tlr11至tlr13，并且它们的区别在于它们识别的抗原类型。例如，tlr4识别脂多糖(lps) (存在于许多革兰氏阴性细菌中的成分)以及病毒蛋白、多糖和内源性蛋白(比如低密度脂蛋白、β-防御素和热休克蛋白)；而tlr9为一种核苷酸感知tlr，其被在原核基因组中丰富但在脊椎动物基因组中稀少的未甲基化的胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(cpg)单链或双链二核苷酸活化。tlr的活化导致一系列信号传导事件，导致i型干扰素(ifn)、炎性细胞因子和趋化因子的产生以及免疫应答的诱导。最终，这种炎症也会激活适应性免疫系统，其随后导致入侵的病原体和感染的细胞的清除。
69.本文使用的术语“配体”是指与生物分子(例如受体)形成复合物以服务于生物学目的的分子。根据特定的实施方案，toll样受体配体为toll样受体激动剂。
70.本文使用的术语“激动剂”是指与一种或多种tlr结合并诱导受体介导的应答的分子。例如，激动剂可诱导、刺激、增加、激活、促进、增强或上调受体的活性。这种活性被称为“激动活性”。例如，tlr4或tlr9激动剂可通过结合受体激活或增加细胞信号传导。激动剂包括但不限于核酸、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质或者与受体结合或相互作用的任何其他分子。激动剂可模拟天然受体配体的活性。激动剂在序列、构象、电荷或其他特征方面可与这些天然受体配体一致，使得它们可被受体识别。这种识别可导致细胞内的生理和/或生化变化，使得细胞以如同天然受体配体存在的相同的方式对激动剂的存在做出反应。根据特定的实施方案，toll样受体激动剂为toll样受体4激动剂和toll样受体9激动剂中的至少一种。
71.本文使用的术语“toll样受体4激动剂”是指起tlr4激动剂作用的任何化合物。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的toll样受体4激动剂均可用于本发明。对本发明有用的toll样受体4配体的实例包括tlr4激动剂，其包括但不限于单磷酰脂质a (mpla)。本文使用的术语“单磷酰脂质a”或“mpla”是指脂质a的修饰形式，脂质a为革兰氏阴性细菌脂多糖(lps)内毒素的生物活性部分。mpla的毒性低于lps，同时保持免疫刺激活性。作为疫苗佐剂，mpla刺激对疫苗抗原的细胞和体液应答两者。mpla的实例包括但不限于3-o-脱酰基-4'-单磷酰脂质a、单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基、单磷酰3-脱酰基脂质a及其结构相关的变体。对本发明有用的mpla可使用本领域已知的方法或从商业来源获得，比如来自avanti polar lipids (alabaster, alabama, usa)的3d-(6-酰基)phad
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、phad
®
、phad
®‑
504、3d-phad
®
或者来自各种商业来源的mpl
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。根据特定的实施方案，toll样受体4激动剂为mpla。
72.本文使用的术语“toll样受体9激动剂”是指起tlr9激动剂作用的任何化合物。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的toll样受体9激动剂均可用于本发明。对本发明有用的toll样受体9配体的实例包括tlr9激动剂，其包括但不限于cpg寡核苷酸。
73.本文使用的术语“cpg寡核苷酸”、“cpg寡脱氧核苷酸”或“cpg odn”是指包含至少一个cpg基序的寡核苷酸。本文使用的“寡核苷酸”、“寡脱氧核苷酸”或“odn”是指由多个连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。这种寡核苷酸可从现有的核酸来源获得或者可通过合成方法产生。本文使用的术语“cpg基序”是指核苷酸序列，其含有通过磷酸酯键或磷酸二酯骨架或其他核苷酸间键连接的未甲基化的胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(cpg)二核苷酸(即胞嘧啶(c)然后是鸟嘌呤(g))。
74.根据特定的实施方案，cpg寡核苷酸是脂质化的，即缀合(共价连接)于脂质部分。
75.本文使用的“脂质部分”是指含有亲脂结构的部分。脂质部分，比如烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是固醇(比如胆固醇)或脂肪酸，当连接于高度亲水性的分子(比如核酸)时，可显著提高血浆蛋白结合，以及因此提高亲水分子的循环半衰期。另外，与某些血浆蛋白(比如脂蛋白)的结合已经显示增加在表达相应脂蛋白受体(例如ldl受体、hdl受体或清道夫受体sr-b1)的特定组织中的摄取。特别是，缀合至磷酸肽和/或cpg寡核苷酸的脂质部分允许所述肽和/或寡核苷酸能够经疏水部分锚定到脂质体的膜中。
76.根据特定的实施方案，鉴于本公开，cpg寡核苷酸可包含任何合适的核苷酸间键。
77.本文使用的术语“核苷酸间键”是指通过核苷酸的糖连接两个核苷酸的化学键，其由相邻核苷之间的磷原子和荷电或中性基团组成。核苷酸间键的实例包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基膦酸酯(mp)和甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和甲基硫代磷酸酯为稳定核苷酸间键，而磷酸二酯为天然存在的核苷酸间键。寡核苷酸硫代磷酸酯一般合成为rp和sp硫代磷酸酯键的无规外消旋混合物。
78.鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的cpg寡核苷酸均可用于本发明。这种cpg寡核苷酸的实例包括但不限于cpg2006 (也称为cpg7909)、cpg1018、cpg2395、cpg2216、cpg1826或cpg2336。
79.鉴于本公开，可使用本领域已知的方法将cpg寡核苷酸脂质化。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸的3’末端通过磷酸酯键(任选地经peg接头)共价连接于胆固醇分子。其他亲脂部分也可共价连接于cpg寡核苷酸的3’末端。例如，cpg寡核苷酸可(任选地经peg接头)共价连接于与脂质体的磷脂长度相同的脂质锚：一个棕榈酸链(使用pal-oh或类似物，被活化用于偶联)或两个棕榈酸(例如使用1,2
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二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰基)或类似物，被活化用于偶联)。参见例如美国专利号7741297中的相关公开，其内容通过参考结合至本文中。peg的长度可例如从1至5个peg单元变化。
80.其他接头也可用于将cpg寡核苷酸共价连接于亲脂部分(比如胆固醇分子)，其实例包括但不限于具有3至12个碳的烷基间隔基。需要与寡核苷酸化学相容的短接头如氨基二醇。在一些实施方案中，没有接头用于共价键合。参见例如ries等人，“convenient synthesis and application of versatile nucleic acid lipid membrane anchors in the assembly and fusion of liposomes, org. biomol. chem., 2015, 13, 9673”，其相关公开通过参考结合至本文中。
81.根据特定的实施方案，对本发明有用的的脂质化cpg寡核苷酸包含选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列，其中核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且核苷酸序列经接头共价连接于至少一个胆固醇。可使用任何合适的接头将cpg寡核苷酸共价连接于胆固醇分子。优选地，连头包含聚乙二醇(peg)。
82.根据特定的实施方案，脂质体包含：tau磷酸肽；辅助性t细胞表位；脂质化cpg寡核苷酸；和toll样受体4配体；
其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且辅助性t细胞表位包封于脂质体中。
83.根据特定的实施方案，脂质体包含：tau肽，其具有选自seq id no:27至seq id no:29或seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列；辅助性t细胞表位，其具有选自seq id no:39至seq id no:44的氨基酸序列，优选辅助性t细胞表位由选自seq id no:13至seq id no:17的氨基酸序列组成；脂质化cpg寡核苷酸，其具有选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列，其中cpg寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且cpg寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和单磷酰脂质a (mpla)。
84.根据特定的实施方案，脂质体进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3
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rac-甘油(dmpg)和胆固醇。
85.根据特定的实施方案，脂质体进一步包含缓冲剂。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的缓冲剂均可用于本发明。在一个实施方案中，脂质体包含磷酸盐缓冲盐水。根据特定的实施方案，缓冲剂包含组氨酸和蔗糖。
86.根据特定的实施方案，脂质体包含摩尔比为9:1:7:0.07:0.04的dmpc、dmpg、胆固醇、tau磷酸肽和辅助性t细胞表位。
87.鉴于本公开，本发明的脂质体可使用本领域已知的方法制作。
88.本技术示例性的脂质体包含经在tau肽每个末端处的两个棕榈酸存在于脂质体的表面上的tau四棕榈酰化磷酸肽(ptau肽t3，seq id no:28)；经共价连接的胆固醇掺入到脂质体膜中的包含脂质化cpg (佐剂cpg7909-chol)的tlr-9配体；掺入膜中的tlr-4配体(佐剂3d-(6-酰基) phad
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)；和包封的辅助性t细胞表位(pan-dr结合剂t50)。
89.缀合物缀合物在本技术加强组合物中使用。用于本发明的方法的缀合物包含tau肽(优选tau磷酸肽)和与之缀合的免疫原性载体的缀合物。
90.根据特定方面，缀合物具有以下结构：，或式(ii)的结构：
其中x为0至10的整数；n为2至15(优选3至11)的整数；载体代表免疫原性载体；和tau肽代表tau磷酸肽。
91.根据特定的实施方案，x为1至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的整数。根据特定的实施方案，x为3。
92.根据特定的实施方案，n为2至15、3至11、3至9、3至8或3至7。
93.根据特定的实施方案，缀合物包含一种或多种tau肽。根据特定的实施方案，缀合物的tau肽可以相同或不同。
94.根据特定的实施方案，鉴于本公开，任何合适的tau肽均可用于本发明。根据特定的实施方案，一种或多种tau肽包含seq id no:1-12之一的氨基酸序列，或者与seq id no:1-12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中没有一个、一个或多个氨基酸残基被磷酸化。
95.根据特定的实施方案，一种或多种tau肽为tau磷酸肽。根据特定的实施方案，该一种或多种tau磷酸肽包含seq id no:1-3或5-12之一的氨基酸序列，或者与seq id no: 1-3或5-12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中一个或多个所示氨基酸残基被磷酸化。
96.根据特定的实施方案，tau磷酸肽由seq id no:1-3之一的氨基酸序列组成。
97.本文使用的术语“免疫原性载体”是指可与tau肽偶联的免疫原性物质。与tau肽偶联的免疫原性部分可诱导免疫应答并引起可特异性结合tau肽的抗体的产生。免疫原性部分为有效部分，其包括被识别为外来物并由此引起宿主免疫应答的蛋白、多肽、糖蛋白、复合多糖、颗粒、核酸、多核苷酸等。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的免疫原性载体可用于本发明。根据特定的实施方案，免疫原性载体为钥孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素、crm197 (白喉毒素的非毒性形式)、脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(omp)或其衍生物。根据特定的实施方案，免疫原性载体为klh或crm197。
98.根据特定的实施方案，tau肽经接头与载体缀合。本文使用的术语“接头”是指将免疫原性载体连接于tau肽的化学部分。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的接头均可用于本发明。接头可为例如单共价键、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、聚乙二醇(peg)接头、肽接头、基于糖的接头或可裂解接头(如二硫键或蛋白酶切割位点)或氨基酸或其组合。接头的实例可包括聚乙二醇(peg)、3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(sbap)、间-马来酰亚胺基苯甲酰-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)或者一种或多种氨基酸
(如cys、lys或有时为ser或thr)或其组合中的一种或多种。
99.根据特定的实施方案，接头包含(c2h4o)x
ꢀ‑
半胱氨酸-乙酰氨基丙酰胺或间马来酰亚胺基苯甲酰-n-羟基琥珀酰亚胺酯-半胱氨酸-(c2h4o)x，其中x为0至10的整数，比如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
100.根据特定的实施方案，载体经接头共价连接于tau肽的n-末端。
101.根据其他特定的实施方案，载体经接头共价连接于tau肽的c-末端。
102.根据特定的实施方案，缀合物具有以下结构：，其中n为2至15(优选3至11，更优选3至7)的整数。
103.鉴于本公开，可通过本领域已知的方法制作本发明的缀合物。例如，以上缀合物可通过使3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(sbap)：与crm197的氨基反应形成酰胺键而形成。此crm197前体可随后与tau肽(例如seq id no:2的磷酸化tau肽)反应以形成tau磷酸肽缀合物，所述tau肽在其n-末端或在其c-末端与带有游离亲核硫醇基的peg-半胱氨酸接头缀合。
104.根据本技术实施方案的示例性缀合物包含共价连接于载体蛋白crm197的多个tau磷酸肽(ptau肽t3.76)。
105.药用组合物脂质体和缀合物在药用组合物中给予受试者。药用组合物为包含治疗有效量的脂质体的组合物或包含治疗有效量的本发明的缀合物的组合物，所述脂质体和缀合物各自均与药学上可接受载体一起。药学上可接受载体包括本领域已知的赋形剂和/或载体(参见remington’s pharmaceutical science (第15版), mack publishing company, easton, pa., 1980)。药用组合物的优选制剂取决于预期的给予模式和治疗应用。组合物可包含药学上可接受的非毒性载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类给予的药用物组合物的媒介物。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例为蒸馏水、生理性磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。另外，药用组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的给予途径，例如肌肉内、皮下、经口、皮内、经皮、粘膜内(如肠)、鼻内或腹膜内途径。优选地，药用组合物所包括的药学上可接受载体适合于肌肉内给予。
106.根据本领域周知的方法，药用组合物可被配制作为疫苗(也称为“免疫原性组合物”)，例如引发组合物或加强组合物。
107.药用组合物可含有相同免疫原性tau肽的混合物。或者，药用组合物可含有本发明的不同免疫原性tau肽的混合物。
108.与针对神经元疾病的疫苗相关的另一个问题是，可能需要特别高的抗体效价以确保功效。这是因为疫苗的靶抗原位于脑中。脑通过称为血脑屏障(bbb)的特化细胞结构与循环分开。bbb限制物质从循环进入脑。这防止毒素、微生物等进入中枢神经系统。bbb还具有防止免疫介质(比如抗体)有效进入脑周围的间质和脑脊髓液的潜在较不期望的效果。
109.体循环中存在的约0.1%抗体穿过bbb并进入脑。这意味着由靶向cns抗原的疫苗诱导的全身效价必须为脑中有效的最小有效效价的至少1000倍。
110.因此，根据特定的实施方案，本发明的药用组合物进一步包含一种或多种合适的佐剂。因此，存在于脂质体或缀合物中的本发明的tau肽可与合适的佐剂组合给予以在受试者中获得期望的免疫应答。合适的佐剂可在本发明脂质体或缀合物的给予之前、之后或同时给予。优选的佐剂增强对免疫原的内在应答而不会引起影响应答的定性形式的免疫原的构象变化。佐剂的实例为铝盐(铝佐剂)，比如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。佐剂的其他实例包括cpg，例如cpg2006 (也称为cpg7909)、cpg1018、cpg2395、cpg2216、cpg1826或cpg2336。这种佐剂可与或不与其他特异性免疫刺激剂，诸如mpla类(3去-o-酰化单磷酰脂质a (mpl
™
)、单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基合成物(3d-(6-酰基) phad
®
)、phad
™
、phad
®‑
504、3d-phad
®
)脂质a)、聚合或单体氨基酸(如聚谷氨酸或聚赖氨酸)等一起使用。这种佐剂可与或不与其他特异性免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(例如n-乙酰胞壁酰-l-苏氨酰-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰-去甲胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)、n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺基-l-丙氨酸-2-(1
’‑2’‑
二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(mtp-pe)、n-乙酰葡糖胺基-n-乙酰胞壁酰-l-al-d-isoglu-l-ala-二棕榈酰氧基丙酰胺(dtp-dpp) theramide
™
)或其他细菌细胞壁成分等一起使用。水包油乳液包括mf59 (参见wo 90/14837)，其含有5%角鲨烯、0.5% tween 80和0.5% span 85 (任选地含有各种量的mtp-pe)，使用微流化器配制为亚微米颗粒；saf，其含有10%角鲨烯、0.4% tween 80、5%普朗尼克嵌段的聚合物l121和thr-mdp，微流化为亚微米乳液或涡旋产生较大粒度的乳液；以及ribi
™
佐剂系统(ras) (ribi immunochem, hamilton, mont.) 0.2% tween 80和一种或多种选自单磷酰脂质a (mpl
™
)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)(优选mpl
™
cws (detox
™
))的细菌细胞壁成分。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(cfa)和细胞因子，比如白细胞介素(il-1、il-2和il-12)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)和肿瘤坏死因子(tnf)。
111.本文使用的术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或医学反应的活性成分或组分的量。关于所述目的，可凭经验并以常规方式确定治疗有效量。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。本领域技术人员可基于对一些因素的考虑来确定特定有效剂量的选择(例如经临床试验)，所述因素包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态和技术人员已知的其他因素。制剂中采用的精确剂量还取决于给予途径和疾病的严重程度，并且应根据从业人员的判断和每位患者的状况来决定。可从由体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线外推有效剂量。
112.在某些实施方案中，“治疗有效量”为“免疫学有效量”，其意为足以在需要其的受
试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答的组合物的量。在一个实施方案中，免疫原性有效量意为足以在需要其的受试者中诱导免疫应答的量。在另一个实施方案中，免疫原性有效量意为足以在需要其的受试者中产生免疫(例如提供针对神经变性疾病、障碍或病症的治疗效果)的量。免疫原性有效量可取决于各种因素而变化，所述因素诸如受试者的身体状况、年龄、体重、健康等。鉴于本公开，本领域普通技术人员可容易地确定免疫原性有效量。
113.在一个实施方案中，免疫原性组合物为用于引发免疫应答的引发组合物，其将在给予加强组合物前被给予。根据本发明的实施方案，引发组合物包含免疫学有效量的本文所述的脂质体。根据本发明的实施方案，免疫原性组合物为用于加强免疫应答的加强组合物，其将在给予加强组合物后被给予。根据本发明的实施方案，加强组合物包含免疫学有效量的本文所述的缀合物。根据本技术的实施方案，包含免疫学有效量的本文所述的脂质体的免疫原性组合物可被用作用于引发免疫应答的引发组合物和用于加强免疫应答的加强组合物两者。引发组合物可与一种或多种加强组合物组合使用。加强组合物可被给予多于一次。
114.本文使用的术语“组合”在给予受试者两种或更多种疗法的上下文中是指使用多于一种疗法。术语“组合”的使用不限制其中给予受试者疗法的顺序。例如，第一疗法(例如本文所述的脂质体组合物)可在给予受试者第二疗法(例如本文所述的缀合物组合物)之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周或更久之前)、同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周或更久之后)给予。
115.本发明的药用组合物可根据本领域众所周知的方法来配制。鉴于本公开，组合物中每种组分的最佳比率可通过本领域技术人员众所周知的技术来确定。
116.在某些实施方案中，药用组合物包含本文所述的脂质体和包含一种或多种氨基酸(例如组氨酸或甘氨酸)和/或一种或多种碳水化合物(例如葡萄糖或蔗糖)的缓冲剂。
117.在其他实施方案中，药用组合物包含本文所述的缀合物和包含一种或多种氨基酸(例如组氨酸或甘氨酸)、一种或多种碳水化合物(例如葡萄糖或蔗糖)和/或表面活性剂(例如聚山梨酯80、聚山梨酯20等等)的缓冲剂。
118.使用方法本发明提供使用含有tau肽的脂质体疫苗和包含缀合至免疫原性载体的tau肽的缀合物疫苗在患有神经变性障碍的受试者中引发和加强针对tau蛋白的免疫应答的方法。
119.在一个总体的方面，在患有神经变性障碍的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫应答的方法包含：给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：第一tau磷酸肽；辅助性t细胞表位；脂质化的cpg寡核苷酸；和含有toll样受体4配体的佐剂；其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，且引发组合物进一步包含药学上可接受载体；和
给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有式(i)的结构：或具有式(ii)的结构：其中x为0至10(优选2至6，最优选3)的整数；n为3至15(优选3至12)的整数；载体代表免疫原性载体，其选自钥孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素、crm197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(omp)或其衍生物；和tau肽代表第二tau磷酸肽，和第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体其中第一tau磷酸肽和第二tau磷酸肽各自独立地具有选自seq id no: 1至seq id no: 3和seq id no: 5至seq id no: 12的氨基酸序列。
120.在某些实施方案中，免疫学有效量的缀合物与一种或多种佐剂(例如本文所述的那些)一起共同给予。在一个实施方案中，免疫学有效量的缀合物与一种或多种铝盐(铝佐剂)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)和/或一种或多种cpg(例如cpg2006(也称为cpg7909)、cpg1018、cpg2395、cpg2216、cpg1826或cpg2336)一起给予。
121.在某些实施方案中，第一tau磷酸肽和第二tau磷酸肽是相同的。在其他实施方案中，第一tau磷酸肽和第二tau磷酸肽是不同的，优选它们共享至少一个共同表位。
122.在某些实施方案中，该方法进一步包含给予受试者包含免疫原性有效量的所述脂质体的第二加强组合物。
123.根据特定方面，免疫应答为诱导的针对磷酸化的tau蛋白(优选ephf)的抗体。
124.在某些实施方案中，在给予引发组合物后约27-32天(例如约27、28、29、30、21或32天)给予第一加强组合物。在某些实施方案中，在给予引发组合物后约82-87天(例如约82、
83、84、85、86或87天)再给予第一加强组合物。在某些实施方案中，在给予引发组合物后约167-172天(例如约167、168、169、170、171或172天)给予包含免疫原性有效量的所述脂质体的第二加强组合物。
125.在某些实施方案中，在给予引发组合物后约82-87天(例如约82、83、84、85、86或87天)给予第一加强组合物。在某些实施方案中，在给予引发组合物后约27-32天(例如约27、28、29、30、21或32天)给予第二加强组合物。在某些实施方案中，在给予引发组合物后约167-172天(例如约167、168、169、170、171或172天)再给予第一加强组合物。
126.本领域普通技术人员将能基于本文的教导和临床经验而改变引发和加强组合物的确切时机、其给予频率、其剂量等。
127.本文所述的任何引发和加强组合物可被用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫应答的方法。可被用于本发明的方法中的引发组合物；加强组合物；脂质体；和/或缀合物等的实施方案在上文中和下文的说明性实施例中进行了详细讨论。
128.本文使用的术语“诱导”和“刺激”及其变体是指细胞活性的任何可测量的增加。免疫应答的诱导可包括例如免疫细胞群的活化、增殖或成熟，增加细胞因子的产生和/或增加免疫功能的另一指标。在某些实施方案中，免疫应答的诱导可包括增加b细胞的增殖、产生抗原特异性抗体、增加抗原特异性t细胞的增殖、改善树突状细胞的抗原呈递和/或增加某些细胞因子、趋化因子和共刺激标志物的表达。
129.在动物或人类有机体中给予后诱导或刺激抗tau免疫应答的能力可使用本领域中标准的多种测定进行体外或体内评估。对于可用于评估免疫应答的发生和活化的技术的一般描述，参见例如coligan等人(1992年和1994年, current protocols in immunology; ed. j wiley & sons inc, national institute of health)。细胞免疫的测量可通过本领域易于得知的方法来进行，例如通过测量由激活的效应细胞(包括衍生自cd4 和cd8 t细胞的那些)分泌的细胞因子谱(例如通过elispot量化il-4或ifnγ产生细胞)；通过确定免疫效应细胞的活化状态(例如通过经典的[3h]胸苷摄取进行的t细胞增殖测定)；通过测定敏化受试者中的抗原特异性t淋巴细胞(例如细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)。
[0130]
刺激细胞和/或体液应答的能力可通过测试来自受试者的生物样品(例如血液、血浆、血清、pbmc、尿液、唾液、粪便、csf或淋巴液)中针对以药用组合物给予的免疫原性tau肽的抗体的存在来确定(参见例如harlow, 1989, antibodies, cold spring harbor press)。例如，应答于给予提供免疫原的组合物而产生的抗体的效价可通过酶联免疫吸附测定(elisa)、meso scale discovery (msd)、斑点印迹、sds-page凝胶、elispot或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定来测量。
[0131]
本发明提供使用含有tau肽的脂质体疫苗和包含缀合至免疫原性载体的tau肽的缀合物疫苗在需要其的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍的方法。
[0132]
本领域普通技术人员将能基于本文的教导和临床经验而改变加强组合物、引发和加强组合物的确切时机、其给予频率、其剂量等。
[0133]
本文所述的任何引发和加强组合物可被用于在需要其的受试者中用于治疗或预防神经变性疾病或障碍的方法中。可被用于本发明的方法中的引发组合物；加强组合物；脂质体；和/或缀合物等的实施方案在上文中和下文的说明性实施例中进行了详细讨论。
[0134]
本文使用的术语“受试者”指动物。根据特定的实施方案，受试者为哺乳动物，其包
disease)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆(tangle only dementia)、脑炎后帕金森综合征(postencephalitic parkinsonism)、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(cte)、大脑血管病(cerebral angiopathy)或路易体痴呆(lewy body dementia，lbd)。根据特定的实施方案，神经变性疾病、障碍或病症为阿尔茨海默病或另一种tau病。
[0138]
阿尔茨海默病的临床进程可被分为几个阶段，具有进行性模式的认知和功能缺损。该阶段可使用本领域已知的分级量表包括例如nia-aa研究框架(nia-aa research framework)而定义。参见例如dubois等人, alzheimer’s & dementia 12 (2016) 292-323、dubois等人, lancet neurol 2014; 13: 614
–
29、jack等人, alzheimer’s & dementia 14 (2018) 535-562，各内容通过参考以其全部结合至本文中。
[0139]
根据优选的实施方案，神经变性疾病、障碍或病症为早期阿尔茨海默病、阿尔茨海默病引起的轻度认知缺损(mci)、轻度阿尔茨海默病或轻度至中度阿尔茨海默病。
[0140]
在一些实施方案中，需要治疗的受试者脑中淀粉样蛋白呈阳性，但尚未显示显著的认知缺损。可使用本领域已知的方法检测在脑中的淀粉样蛋白沉积，所述方法例如pet扫描、免疫沉淀质谱法或其他方法。
[0141]
本发明还提供一种用于促进tau聚集体从受试者的脑中清除的方法，所述方法包括在有效促进tau聚集体从受试者的脑中清除的条件下给予受试者本发明实施方案的药用组合物。根据特定的实施方案，tau聚集体为神经原纤维缠结或其病理性tau前体。
[0142]
本发明还提供一种用于减缓受试者中tau-病理学相关行为表型的进展的方法，所述方法包括在有效减缓受试者中tau-病理学相关行为表型的进展的条件下给予受试者本发明实施方案的药用组合物。
[0143]
在本发明的优选实施方案中，经给予本发明实施方案的药用组合物给予tau肽，在受试者中诱导针对tau肽和针对tau的病理形式的活性免疫应答，从而促进相关tau聚集体的清除，减缓tau-病理学相关行为的进展和/或治疗潜在的tau病。根据本发明的这个方面，免疫应答涉及针对tau肽的有益体液(抗体介导的)应答和针对t细胞表位或免疫原性载体的细胞(由抗原特异性t细胞或其分泌产物介导的)反应的发展。
[0144]
本文使用的tau-病理学相关行为表型非限制性地包括认知缺损、早期人格改变和抑制解除、冷漠、意志缺乏、缄默、失用症、持续动作、刻板性运动/行为、口欲过剩(hyperorality)、混乱、无法计划或组织依序的任务、自私/无情、反社会特质、缺乏同理心、蹒跚的(halting)、伴随经常性错语但相对保留理解力的语法失能、理解功能受损和词汇搜索困难、缓慢进行性步态不稳、后退步态、僵硬、频繁跌倒、非左旋多巴反应性轴向刚度、核上性凝视麻痹、方波急跳、垂直扫视运动缓慢、假性延髓麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。
[0145]
在实施本发明的方法时，优选的是在给予本发明的免疫原性肽或抗体之前选择患有阿尔茨海默病或其他tau病或处于其风险下的受试者、脑中具有tau聚集体的受试者或表现出缠结相关行为表型的受试者。适合于治疗的受试者包括处于疾病风险下但未表现出症状的个体，以及目前表现出症状的患者。就阿尔茨海默病而言，几乎任何人均处于患有阿尔茨海默病的风险下。因此，本方法可预防性地给予普通人群而无需对受试患者的风险进行任何评估。本方法对具有已知的阿尔茨海默病遗传风险的个体尤其有用。这种个体包括具
有经历过该疾病的亲戚的那些个体，以及通过分析遗传或生化标志物而确定其风险的那些个体。
[0146]
在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如10、20、30岁)开始。然而，通常直到患者达到40、50、60或70岁时才需要开始治疗。该治疗一般在一段时间内需要多个剂量。治疗可通过测定抗体或活化的t细胞或b细胞对治疗剂随着时间推移的应答进行监测。如果应答降低，则指示加强剂量。
[0147]
在预防性应用中，将含有tau肽的药用组合物以足以消除或降低疾病的风险、减轻其严重程度或延迟其发作的量给予易患阿尔茨海默病或其他tau病或者除此之外处于其风险下的患者，所述疾病包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，其并发症以及在疾病发展期间出现的中间病理表型。在治疗应用中，将含有tau肽的药用组合物以足以治愈或至少部分地抑制疾病症状(生化、组织学和/或行为，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表型)的量给予怀疑患有或已经患有这种疾病的患者。
[0148]
用于预防和/或治疗神经变性疾病、障碍或病症的本发明药用组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予模式、靶位点、患者的生理状态、所给予的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性的。药用组合物的量取决于是否还给予佐剂，在没有佐剂的情况下需要更高的剂量。在根据本发明的方法中，受试者被给予引发组合物至少一次以及加强组合物至少一次。无论采用多少加强组合物，在分别的引发和加强组合物中的抗原不必相同，但应共享抗原决定簇或彼此基本相似。
[0149]
本领域的技术人员易于意识到，可基于给予之后测得的免疫应答来调整引发和加强给予的方案。例如，加强组合物通常在给予引发组合物之后数周或数月给予，例如给予引发组合物之后约2周，或约3周或约4周，或约8周，或约12周，或约16周，或约20周，或约24周，或约26周，或约28周，或约30周，或约32周，或约36周或约1至2年。
[0150]
药用组合物可通过胃肠外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、皮内、鼻内或肌肉内方式给予，用于预防性和/或治疗性治疗。免疫原性物质的最典型给予途径为皮下或肌肉内注射。该后一种类型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中进行。
[0151]
如果需要，组合物可存在于试剂盒、包装或分配器中，其可含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。试剂盒例如可包括金属或塑料箔，比如泡罩包装。试剂盒、包装或分配器可随附给予说明。
[0152]
根据特定的实施方案，试剂盒含有包含根据本发明实施方案的脂质体的药用组合物和包含根据本发明实施方案的缀合物的药用组合物。
[0153]
实施方案本发明还提供以下非限制性实施方案。
[0154]
实施方案1为在患有神经变性障碍的受试者中用于诱导针对tau蛋白的免疫应答(优选诱导针对tau磷酸肽和/或ephf的抗体)方法，该方法包含：给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：a.第一tau肽；和b.辅助性t细胞表位；其中tau肽存在于脂质体的表面上，和药学上可接受载体；和
给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有式(i)的结构：或具有式(ii)的结构：其中x为0至10(优选2至6，最优选3)的整数；和n为3至15(优选3至12)的整数；载体代表免疫原性载体；优选地，免疫原性载体选自钥孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素、crm197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(omp)或其衍生物；和tau肽代表第二tau磷酸肽；且第一加强组合物进一步包含药学上可接受载体。
[0155]
实施方案2为实施方案1的方法，其中脂质体的tau肽为tau磷酸肽。
[0156]
实施方案3为实施方案1或2的方法，其中脂质体进一步包含toll样受体配体。
[0157]
实施方案4为实施方案3的方法，其中toll样受体配体包含toll样受体4配体和toll样受体9配体中的至少一种。
[0158]
实施方案5为实施方案3或4的方法，其中toll样受体配体为toll样受体4配体。
[0159]
实施方案6为实施方案5的方法，其中toll样受体4配体包含单磷酰脂质a (mpla)。
[0160]
实施方案7为实施方案3或4的方法，其中toll样受体配体为toll样受体9配体。
[0161]
实施方案8为实施方案7的方法，其中toll样受体9配体包含脂质化cpg寡核苷酸。
[0162]
实施方案9为实施方案1的方法，其中引发组合物包含免疫学有效量的脂质体，其包含：a. tau肽；b. 辅助性t细胞表位；和c. 以下的至少一种
i. toll样受体9配体，和ii. toll样受体4配体。
[0163]
实施方案10为实施方案9的方法，其中tau肽为tau磷酸肽。
[0164]
实施方案11为实施方案9或10的方法，其中toll样受体9配体为脂质化cpg寡核苷酸。
[0165]
实施方案12为实施方案9至11中任何一项的方法，其中脂质体包含toll样受体4配体和toll样受体9配体。
[0166]
实施方案13为实施方案12的方法，其中toll样受体4配体包含单磷酰脂质a (mpla)。
[0167]
实施方案14为实施方案1的方法，其中引发组合物包含免疫学有效量的脂质体，其包含：tau磷酸肽；辅助性t细胞表位；脂质化的cpg寡核苷酸；和含有toll样受体4配体的佐剂；其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。
[0168]
实施方案15为实施方案14的方法，其中toll样受体4配体包含单磷酰脂质a (mpla)。
[0169]
实施方案16为实施方案1至15中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位包封于脂质体中。
[0170]
实施方案16a为实施方案1至15中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位掺入脂质体的膜中。
[0171]
实施方案16b为实施方案1至15中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位存在于脂质体的表面上。
[0172]
实施方案17为实施方案1至16b的方法，其中引发组合物包含免疫学有效量的脂质体组合物，其包含：tau磷酸肽；辅助性t细胞表位；脂质化的cpg寡核苷酸；和单磷酰脂质a (mpla)；其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，和t细胞表位包封于脂质体中。
[0173]
实施方案17a为实施方案17的方法，其中mpla为3-o-脱酰基-4'-单磷酰脂质a，优选mpl
™
。
[0174]
实施方案17b为实施方案17的方法，其中mpla为单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基，优选3d-(6-酰基) phad
®
。
[0175]
实施方案17c为实施方案17的方法，其中mpla为单磷酰3-脱酰基脂质a，优选3d-phad
®
。
[0176]
实施方案18为实施方案1至17c中任何一项的方法，其中引发组合物的脂质体组合
物进一步包含一种或多种脂质，其选自：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3
’‑
rac-甘油(dmpg)和胆固醇。
[0177]
实施方案19为实施方案1至18中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽具有选自seq id no:1至seq id no:12或与选自seq id no:1至seq id no:12的氨基酸序列具有至少85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
[0178]
实施方案19-1为实施方案19的方法，其中脂质体的tau肽为磷酸肽，其包含选自seq id no:1-3和5-12的氨基酸序列。
[0179]
实施方案19-2为实施方案19-1的方法，其中脂质体的tau磷酸肽包含seq id no:1的氨基酸序列。
[0180]
实施方案19-3为实施方案19-1的方法，其中脂质体的tau磷酸肽包含seq id no:2的氨基酸序列。
[0181]
实施方案19-4为实施方案19-1的方法，其中脂质体的tau磷酸肽包含seq id no:3的氨基酸序列。
[0182]
实施方案19a为实施方案19、19-1、19-2、19-3和19-4中任何一项的方法，其中氨基酸序列进一步包含一种或多种修饰以允许tau肽存在于脂质体的表面上。
[0183]
实施方案19b为实施方案19a的方法，其中所述一种或多种修饰包含棕榈酰化和十二烷基修饰中的至少一种。
[0184]
实施方案19c为实施方案19a或19b的方法，其中脂质体的tau肽在其n-末端被所述一种或多种修饰所修饰。
[0185]
实施方案19d为实施方案19a至19c中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽在其c-末端被所述一种或多种修饰所修饰。
[0186]
实施方案19e为实施方案19d的方法，其中脂质体的tau肽在其n-末端和c-末端两者均被棕榈酰化。
[0187]
实施方案19f为实施方案19a至19e中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽进一步包含一个或多个另外的氨基酸以促进所述一种或多种修饰。
[0188]
实施方案19g为实施方案19f的方法，其中所述一个或多个另外的氨基酸选自lys、cys、ser和thr。
[0189]
实施方案19h为实施方案19至19g中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽在其c-末端被酰胺化。
[0190]
实施方案19i为实施方案19至19h中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽由选自seq id no:27至seq id no:38的氨基酸序列组成。
[0191]
实施方案19j为实施方案19至19i中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽由seq id no:27的氨基酸序列组成。
[0192]
实施方案19k为实施方案19至19i中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。
[0193]
实施方案19l为实施方案19至19i中任何一项的方法，其中脂质体的tau肽由seq id no:29的氨基酸序列组成。
[0194]
实施方案20为实施方案1至19l中任何一项的方法，其中脂质体的辅助性t细胞表位包含至少一个选自以下的氨基酸序列：seq id no:23至seq id no:26。
[0195]
实施方案20a为实施方案20的方法，其中辅助性t细胞表位包含至少两个选自以下的氨基酸序列：seq id no:23至seq id no:26。
[0196]
实施方案20b为实施方案20的方法，其中辅助性t细胞表位包含至少三个选自以下的氨基酸序列：seq id no:23至seq id no:26。
[0197]
实施方案20c为实施方案20的方法，其中辅助性t细胞表位包含四个以下的氨基酸序列：seq id no:23至seq id no:26。
[0198]
实施方案20d为实施方案20a至20c中任何一项的方法，其中选自seq id no:23至seq id no:26的两个或更多个氨基酸序列通过接头共价连接。
[0199]
实施方案20e为实施方案20d的方法，其中接头包含一个或多个选自val (v)、ala (a)、arg (r)、gly (g)、ser (s)、lys (k)的氨基酸。
[0200]
实施方案20f为实施方案20e的方法，其中接头包含选自vvr、gs、rr和rk的氨基酸序列。
[0201]
实施方案20g为实施方案20至20f中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位在其c-末端被酰胺化。
[0202]
实施方案20h为实施方案20至20g中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位被修饰以插入到脂质体的膜中、存在于脂质体的表面上或包封于脂质体中(取决于辅助性t细胞表位的预期位置)。
[0203]
实施方案20i为实施方案20至20h中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位由选自seq id no:13至seq id no:17的氨基酸序列组成。
[0204]
实施方案20j为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为6:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0205]
实施方案20k为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为5:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0206]
实施方案20l为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为4:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0207]
实施方案20m为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为3:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0208]
实施方案20n为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为2:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0209]
实施方案20o为实施方案1至20i中任何一项的方法，其中脂质体以重量比为1:1包含tau肽和辅助性t细胞表位。
[0210]
实施方案21为实施方案1至20o中任何一项的方法，其中脂质化cpg寡核苷酸包含选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列。
[0211]
实施方案21a为实施方案21的方法，其中cpg寡核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
[0212]
实施方案21b为实施方案21a的方法，其中cpg寡核苷酸具有全部均为硫代磷酸酯的核苷酸间键。
[0213]
实施方案21c为实施方案21至21b中任何一项的方法，其中脂质化cpg寡核苷酸包含经接头共价连接于至少一个亲脂基团的cpg寡核苷酸。
[0214]
实施方案21d为实施方案21c的方法，其中接头包含(c2h4o)n，其中n为0至10的整数。
[0215]
实施方案21e为实施方案21c的方法，其中接头包含具有3至12个碳的烷基间隔基。
[0216]
实施方案21f为实施方案21至21e中任何一项的方法，其中至少一个亲脂基团为胆固醇。
[0217]
实施方案21g为实施方案21至21f中任何一项的方法，其中脂质化cpg寡核苷酸包含经包含(c2h4o)n的接头共价连接于胆固醇分子的seq id no:18或seq id no:19的核苷酸序列，其中n为3至5的整数。
[0218]
实施方案22为在患有神经变性障碍的受试者中用于诱导针对tau蛋白的免疫应答的方法，该方法包含：给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：第一tau磷酸肽，其具有选自seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38的氨基酸序列；辅助性t细胞表位，其具有选自seq id no:39至seq id no:44的氨基酸序列，优选辅助性t细胞表位由选自seq id no:13至seq id no:17的氨基酸序列组成；脂质化的cpg寡核苷酸，其具有选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列，其中cpg寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且cpg寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和单磷酰脂质a (mpla)，和药学上可接受载体；和给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含第二tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有式(i)的结构：或具有式(ii)的结构：
其中x为0至10(优选2至6，最优选3)的整数；和n为3至15(优选3至12)的整数；载体代表免疫原性载体；tau肽代表第二tau磷酸肽；和药学上可接受载体。
[0219]
实施方案22a为实施方案22的方法，其中脂质体包含：a. 第一tau磷酸肽，其由seq id no:27、seq id no:28或seq id no:29的氨基酸序列组成；b. 辅助性t细胞表位，其由seq id no:13的氨基酸序列组成c. 脂质化的cpg寡核苷酸，其由经包含(c2h4o)n的接头共价连接于胆固醇的seq id no: 18或seq id no:19的核苷酸序列组成，其中n为3至7的整数；和d. 单磷酰脂质a (mpla)。
[0220]
实施方案22b为实施方案22或22a的方法，其中mpla为3-o-脱酰基-4
′‑
单磷酰脂质a，优选mpl
™
。
[0221]
实施方案22c为实施方案22或22a的方法，其中mpla为单磷酰六-酰基脂质a，3-脱酰基，优选3d-(6-酰基) phad
®
。
[0222]
实施方案22d为实施方案22或22a的方法，其中mpla为单磷酰3-脱酰基脂质a，优选3d-phad
®
。
[0223]
实施方案23为实施方案22至22d中任何一项的方法，其中辅助性t细胞表位被包封在脂质体中。
[0224]
实施方案24为实施方案1至23中任何一项的方法，其中x为2至6的整数。
[0225]
实施方案25为实施方案1至24中任何一项的方法，其中x为3。
[0226]
实施方案26为实施方案1至25中任何一项的方法，其中n为3至7。
[0227]
实施方案27为实施方案1至26中任何一项的方法，其中载体为免疫原性载体，其选自钥孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素、crm197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(omp)或其衍生物。
[0228]
实施方案28为实施方案1至27中任何一项的方法，其中缀合物的第二tau磷酸肽由选自seq id no: 1至seq id no: 3和seq id no: 5至seq id no: 12的氨基酸序列组成。
[0229]
实施方案28a为实施方案28的方法，其中脂质体的第一tau磷酸肽和缀合物的第二tau磷酸肽是相同的。
[0230]
实施方案28b为实施方案28的方法，其中脂质体的第一tau磷酸肽和缀合物的第二tau磷酸肽是不同的。
[0231]
实施方案28c为实施方案28b的方法，其中脂质体第一tau磷酸肽和缀合物的第二tau磷酸肽共享至少一个共同表位。
[0232]
实施方案29为实施方案28-28c中任何一项的方法，其中第二tau磷酸肽由seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列组成。
[0233]
实施方案30为实施方案1至29中任何一项的方法，其中载体为crm197。
[0234]
实施方案31为实施方案1-30中任何一项的方法，其中缀合物具有以下结构：
，其中n为3-7。
[0235]
实施方案32为实施方案1-29中任何一项的缀合物，其中缀合物具有以下结构：其中tau肽由seq id no:1、seq id no: 2或seq id no:3组成；x为0至10的整数；n为2至15的整数；tau肽代表tau磷酸肽；和klh代表钥孔
䗩
血蓝蛋白。
[0236]
实施方案33为实施方案1至32任何一项的方法，进一步包含给予受试者包含免疫原性有效量的所述脂质体的第二加强组合物。
[0237]
实施方案33a为实施方案33的方法，其中引发组合物、第一加强组合物和/或第二加强组合物进一步包含佐剂。
[0238]
实施方案33b为实施方案33a的方法，其中佐剂包含tlr-4配体和tlr-9配体中的至少一种。
[0239]
实施方案34为实施方案1至33b中任何一项的方法，其中在首次给予引发组合物约27-32天(优选在约29天)后给予第一加强组合物。
[0240]
实施方案35为实施方案34的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约82-87天(优选在约85天)后再给予第一加强组合物。
[0241]
实施方案36为实施方案35的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约167-172天(优选在约169天)后给予第二加强组合物。
[0242]
实施方案37为实施方案1至33b中任何一项的方法，其中在首次给予引发组合物约82-87天(优选在约85天)后给予第一加强组合物。
[0243]
实施方案38为实施方案37的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约27-32天
(优选在约29天)后给予第二加强组合物。
[0244]
实施方案39为实施方案35的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约167-172天(优选在约169天)后再给予第一加强组合物。
[0245]
实施方案40为在需要其的受试者中用于治疗或预防神经变性疾病或障碍的方法，其包含：给予受试者包含免疫学有效量的脂质体的引发组合物，所述脂质体包含：第一tau磷酸肽，其具有选自seq id no: 27至seq id no: 29和seq id no: 31至seq id no: 38的氨基酸序列；辅助性t细胞表位，其具有选自seq id no: 39至seq id no: 44的氨基酸序列，优选辅助性t细胞表位由选自seq id no: 13至seq id no: 17的氨基酸序列组成；脂质化的cpg寡核苷酸，其具有选自seq id no: 18至seq id no: 22的核苷酸序列，其中cpg寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且cpg寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和单磷酰脂质a (mpla)；其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，和药学上可接受载体；和给予受试者包含免疫学有效量的缀合物的第一加强组合物，所述缀合物包含tau磷酸肽和经接头与其缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有以下结构：，其中n为3至7的整数，和药学上可接受载体。
[0246]
实施方案41为实施方案40的方法，其中在首次给予引发组合物约27-32天(优选在约29天)后给予第一加强组合物。
[0247]
实施方案42为实施方案41的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约82-87天(优选在约85天)后再给予第一加强组合物。
[0248]
实施方案43为实施方案42的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约167-172天(优选在约169天)后给予包含免疫原性有效量的所述脂质体的第二加强组合物。
[0249]
实施方案44为实施方案40的方法，其中在首次给予引发组合物约82-87天(优选在约85天)后给予第一加强组合物。
[0250]
实施方案45为实施方案44的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约27-32天(优选在约29天)后给予包含免疫原性有效量的所述脂质体的第二加强组合物。
[0251]
实施方案46为实施方案45的方法，进一步包含在首次给予引发组合物约167-172天(优选在约169天)后再给予第一加强组合物。
[0252]
实施方案46a为实施方案1至46中任何一项的方法，其中免疫学有效量的缀合物与
一种或多种佐剂一起共同给予。
[0253]
实施方案46b为实施方案46a的方法，其中佐剂包含铝盐，例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。
[0254]
实施方案46c为实施方案46a或46b的方法，其中佐剂包含cpg，例如cpg2006 (也称为cpg7909)、cpg1018、cpg2395、cpg2216、cpg1826或cpg2336。
[0255]
实施方案46d为实施方案46c的方法，其中免疫学有效量的缀合物与铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)和cpg(例如cpg2006 (也称为cpg7909)、cpg1018、cpg2395、cpg2216、cpg1826或cpg2336)一起共同给予。
[0256]
实施方案46e为实施方案46d的方法，其中免疫学有效量的缀合物与磷酸铝和cpg1018一起共同给予。
[0257]
实施方案46f为实施方案46d的方法，其中免疫学有效量的缀合物与氢氧化铝和cpg7909一起共同给予。
[0258]
实施方案46g为实施方案46d的方法，其中免疫学有效量的缀合物与硫酸铝和cpg2395一起共同给予。
[0259]
实施方案46h为实施方案46d的方法，其中免疫学有效量的缀合物与氢氧化铝和cpg1826一起共同给予。
[0260]
实施方案47为实施方案1至46h中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍由神经原纤维损伤的形成引起或与之相关。
[0261]
实施方案48为实施方案1至47中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、克-雅氏病、拳击手痴呆症、唐氏综合征、格斯特曼病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、关岛帕金森-痴呆综合征、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、额颞叶痴呆优选与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(ftdp-17)、额颞叶痴呆、哈-斯二氏病、多系统萎缩、c型尼曼匹克氏病、匹克氏病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、脑炎后帕金森综合征、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(cte)、大脑血管病或路易体痴呆(lbd)。
[0262]
实施方案49为实施方案1至48中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、唐氏综合征、进行性核上性麻痹(psp)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(ftdp-17)、匹克氏病和part(原发性年龄相关性tau病，primary age
ꢀ‑ꢀ
related tauopathy)、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(cte)、大脑血管病或路易体痴呆(lbd)。
[0263]
实施方案50为实施方案1至49中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹(psp)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(ftdp-17)或匹克氏病和part (原发性年龄相关性tau病)。
[0264]
实施方案51为实施方案1至50中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、唐氏综合征、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(ftdp-17)、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(cte)、大脑血管病或路易体痴呆(lbd)。
[0265]
实施方案51a为实施方案1至51中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为早期阿尔茨海默病、阿尔茨海默病引起的轻度认知缺损(mci)、轻度阿尔茨海默病或轻度至中度阿尔茨海默病。
[0266]
实施方案52为组合（如试剂盒），其包含在实施方案1-51a中任何一项中使用的引发组合物和第一加强组合物。
[0267]
实施方案53为实施方案1至51a中任何一项的方法，或实施方案52的组合，其中免疫学有效量的脂质体含有每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔，优选每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔，例如每剂约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔、约125纳摩尔、约150纳摩尔、约175纳摩尔、约200纳摩尔、约225纳摩尔、约250纳摩尔、约275纳摩尔、约300纳摩尔、约325纳摩尔、约350纳摩尔、约375纳摩尔、约400纳摩尔、约425纳摩尔、约450纳摩尔、约475纳摩尔、约500纳摩尔、约525纳摩尔、约550纳摩尔、约575纳摩尔、约600纳摩尔、约625纳摩尔、约650纳摩尔、约675纳摩尔、约700纳摩尔、约725纳摩尔、约750纳摩尔或任何介于两者之间的值的第一tau磷酸肽。
[0268]
实施方案53a为实施方案1至51a中任何一项的方法，或实施方案52的组合，其中免疫学有效量的脂质体含有每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔，例如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔，优选每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔，例如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔，例如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约268纳摩尔，例如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的第一tau磷酸肽。
[0269]
实施方案53b为实施方案53或53a的方法或组合，其中免疫学有效量的脂质体含有每剂约100
ꢀµ
g至约2500
ꢀµ
g，优选约300
ꢀµ
g至约2400
ꢀµ
g，例如约100
ꢀµ
g、约150
ꢀµ
g、约200
ꢀµ
g、约250
ꢀµ
g、约300
ꢀµ
g、约400
ꢀµ
g、约500
ꢀµ
g、约600
ꢀµ
g、约700
ꢀµ
g、约800
ꢀµ
g、约900
ꢀµ
g、约1000
ꢀµ
g、约1100
ꢀµ
g、约1200
ꢀµ
g、约1300
ꢀµ
g、约1400
ꢀµ
g、约1500
ꢀµ
g、约1600
ꢀµ
g、约1700
ꢀµ
g、约1800
ꢀµ
g、约1900
ꢀµ
g、约2000
ꢀµ
g、约2100
ꢀµ
g、约2200
ꢀµ
g、约2300
ꢀµ
g、约2400
ꢀµ
g、约2500
ꢀµ
g或任何介于两者之间的值的第一tau磷酸肽。
[0270]
实施方案53c为实施方案53至53b中任何一项的方法或组合，其中第一tau磷酸肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。
[0271]
实施方案53d为实施方案53c的方法或组合，其中第一tau磷酸肽由seq id no: 28的氨基酸序列组成。
[0272]
实施方案54为实施方案53至53d中任何一项的方法或组合，其中第二tau磷酸肽由seq id no: 1-3或5-12的氨基酸序列组成。
[0273]
实施方案54a为实施方案54的方法或组合，其中第二tau磷酸肽由seq id no: 1、2或3的氨基酸序列组成。
实施例
[0274]
实施例1制备脂质体疫苗制备对照脂质体疫苗(乙醇注射技术)
μg/ml api和100 μg/ml t50)，并在渗滤期间用pbs ph 7.4进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的api的所得脂质体经由通过0.2 μm聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
[0281]
通过乙醇注射制备脂质体z 疫苗脂质体z 疫苗使用基于乙醇注射的过程来产生。首先，将dmpc (lipoid gmbh, ludwigshafen, germany)、dmpg (lipoid gmbh, ludwigshafen, germany)、胆固醇(dishman, netherlands)和3d-(6-酰基) phad
®ꢀ
(avanti polar lipids, al, usa)以约9:1:7:0.04的摩尔比在60℃下溶解于etoh中。将t50肽(bachem ag, switzerland)溶解于10 mm his/270 mm蔗糖(ph 5.8-6.0)中。然后，将脂质乙醇溶液注入到含有t50肽的溶液中，并轻轻搅拌15分钟，形成多层囊泡(mlv)。使mlv接受均质化(对于脂质体z 为6次)，然后通过0.08 μm孔径的聚碳酸酯膜(whatman, uk)依序挤出(对于脂质体z 为5次通过)。对于脂质体z ，均质化和挤出两个步骤均在emulsiflex-c5 (avestin, canada)中完成。挤出的脂质体通过超滤进行浓缩，并通过渗滤将缓冲液与20 mm his/145 mm nacl ph 7.4进行交换。将含有包封的t50肽的所得脂质体稀释于20 mm his/145 mm nacl ph 7.4中并加热至60℃以获得脂质体溶液，然后添加api和佐剂。
[0282]
将cpg2006-chol (对于脂质体z 为microsynth, switzerland)以1 mg/ml溶解于20 mm his/145 mm nacl ph 7.4中，并注入到脂质体溶液中，然后在api插入前孵育15分钟。
[0283]
将api (bachem ag, switzerland)以1 mg/ml的浓度溶解于含有1%辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷(sigma-aldrich, usa)的碳酸盐缓冲液ph 10.2中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体z 溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。使用t-line mixing将肽溶液在60℃下混合到脂质体z 溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤完成浓缩以获得目标值(对于脂质体z 为1200
ꢀµ
g/ml api和1200
ꢀµ
g/ml t50)，并在渗滤期间用10 mm his/270 mm蔗糖ph 6.5进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的api的所得z 脂质体经由通过0.2 μm聚碳酸酯注射器式/囊式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
[0284]
实施例2制备缀合物疫苗肽和佐剂此研究中使用的磷酸化的tau肽(seq id no: 2)为在合成期间添加磷酸化残基而合成产生的(pepscan, nl)。包含具有seq id no: 2的氨基酸序列的经接头共价连接于crm载体的磷酸化tau肽的缀合物在本文中称为缀合物x。
[0285]
疫苗肽经聚乙二醇(peg)-半胱氨酸-乙酰氨基丙酰胺接头缀合至载体蛋白crm197。具有seq id no: 2的氨基酸序列的磷酸化的tau肽为在合成期间添加磷酸化残基和peg3间隔基而合成产生的(polypeptide laboratories sas)。通过将载体蛋白crm197经3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(sbap)接头缀合至在肽n-末端上的半胱氨酸而制造缀合物x。经nhs酯反应化学将sbap连接于crm197蛋白伯胺(-nh2)。使用超滤和渗滤(uf/df)去除过量的sbap接头。将crm197-sbap中间体缀合至磷酸化的tau肽，并且一旦反应完成，则通过添加过量l-胱氨酸以猝灭反应来终止缀合反应。将粗品crm197-肽缀合产物使用capto q impres (ge healthcare)色谱柱进行纯化并使用盐等度法进行洗脱。然后，使用uf/df将纯
化的crm197-肽产物配制至含有tris和蔗糖(如20 mm tris，250 mm蔗糖)，ph 8.1的缓冲液中。通过添加聚山梨酯80 (ps80)储备缓冲液(例如10% ps80储备缓冲液)以达到0.01% ps80的最终浓度来产生crm197-tau肽原料药(drug substance，ds)储备溶液。在过滤前，溶液被充分混合。在注射前，用pbs和cpg/alum稀释储备溶液例如至0.8 mg/ml crm197-tau肽的第一浓度，并且随后进一步用pbs和cpg/铝佐剂稀释至30 ug/ml crm197-tau肽的最终浓度用于注射。对于实施例3至7，crm197-tau肽储备溶液在10 mm pbs (ph 7.3)中保持3.1 mg/ml的浓度，且进一步在pbs中稀释以达到期望的工作浓度。然后添加cpg寡核苷酸、铝佐剂和pbs以达到基于crm197-tau肽的30 ug/ml的最终浓度，且最终制剂在注射前被充分混合。
[0286]
用活性疫苗靶向cns抗原的一个担忧是非特异性或脱靶炎症可能引起不想要的神经病理性改变。为了调查此事，来自用缀合物组合物免疫的小鼠的全脑被收集和染色，以使血管周围或其他细胞的浸润物可视化。没有一个免疫的动物具有任何神经炎症、细胞浸润或其他不期望的神经病理性改变的迹象(数据未显示)。这表明疫苗诱导的抗体，和对疫苗接种的先天性免疫应答，在小鼠中没有引起神经病理性改变。
[0287]
以下的实施例显示不同疫苗方案所诱导的免疫应答的不同方面。
[0288]
实施例3在恒河猴中异源疫苗接种增加tau磷酸肽特异性抗体的表位覆盖范围所有动物实验均已批准，并根据有关动物实验的当地法规进行。恒河猴(猕猴，macaca mulatta)获得自中国昆明科灵生物科技有限公司(kunming biomed international ltd, china)、中国云南英茂生物技术有限公司(yunnan yinmore bio-tech co. ltd, china)和中国云南灵长类实验动物有限公司(yunnan laboratory primates inc., china)。免疫开始时动物为2至5岁龄，并且其最小体重为2.5 kg。在治疗开始之前和在其之后每周进行详细的临床检查。此外，每天两次观察猕猴，并记录临床体征。
[0289]
脂质体疫苗，例如脂质体z或脂质体z (两者都含有四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽、3d-(6-酰基) phad
®
、脂质化的cpg寡核苷酸cpg2006和t细胞肽t50)，在本技术中通篇被称为“a”，而缀合物疫苗，例如缀合物x(连接于crm197的seq id no: 2的磷酸化的tau肽)，在本技术中通篇被称为“b”。
[0290]
恒河猴组(每组n=3只雄性和3只雌性)在第1天和29天使用以下进行皮下免疫：i)1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-a方案)；ii)15 ug/剂缀合物x疫苗(b-b方案)；或iii)在第1天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗，随后在第29天为15 ug/剂缀合物x疫苗(a-b方案)。抗体的表位识别谱在第二免疫后三周(第50天)使用n-末端生物素化的8聚体肽文库通过表位作图elisa确定，所述8聚体肽文库移位一个氨基酸并覆盖seq id no: 2的磷酸化tau肽完整序列以及seq id no: 4 (vykspvvsgdtsprhl，非磷酸化的seq id no: 2的肽)的序列。
[0291]
图1a至1c显示用脂质体疫苗(脂质体z)免疫的猴产生了主要结合至肽的n-末端部分的igg抗体(a-a方案，图1a)，然而用缀合物疫苗(缀合物x)免疫的猴产生了主要结合至肽的c-末端部分的igg抗体(b-b方案，图1b)，尽管脂质体疫苗和缀合物疫苗含有相同的seq id no: 2的磷酸化的tau肽。异源方案诱导的抗体结合至肽的n-和c-末端部分两者(a-b方
案，图1c)，因此增加诱导的抗体的表位覆盖范围。此外，在用脂质体疫苗(脂质体z)免疫的猴中诱导的igg抗体并未结合至非磷酸化的文库，然而在用缀合物疫苗(缀合物x)免疫的猴中诱导的igg抗体还识别非磷酸化的8聚体肽。在用异源方案(a-b)免疫的猴中诱导的igg抗体显示了与非磷酸化文库的中间程度的结合。
[0292]
实施例4在恒河猴中用脂质体疫苗的加强诱导了向“脂质体样”表位谱的转变(a-b-b-a方案)恒河猴组(每组n=3只雄性和3只雌性)用以下进行皮下免疫：在第1天用1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗，在第29天和第85天用15 ug/剂缀合物x疫苗，以及在第169天再次用1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-b-b-a方案)。如实施例6中所描述的，所诱导抗体的表位识别谱在用脂质体疫苗的最后加强之前一周(第162天，a-b-b方案)和之后三周(第190天，a-b-b-a方案)通过表位作图elisa确定。图2显示用脂质体的引发和用缀合物疫苗的加强诱导了n-和c-末端igg抗体的组合(a-b-b方案)，而用脂质体疫苗的最后加强在恒河猴中导致了向“脂质体样”表位谱的转变(a-b-b-a方案)。该数据显示在使用本文所述的新抗tau疫苗的异源疫苗接种策略的抗tau抗体应答的诱导中高度的可变性。
[0293]
总而言之，在恒河猴中的研究显示了以使用疫苗(脂质体z和缀合物x)的依序免疫时间表进行的异源疫苗接种不仅诱导针对从ad患者的脑中提取的ptau和病理性tau的抗体效价，而且还增加在两种第二代疫苗中使用的抗原性序列中所诱导抗体的表位覆盖范围。
[0294]
实施例5用脂质体和缀合物疫苗的异源疫苗接种诱导了血清中的ephf特异性igg效价和恒河猴脑脊髓液(csf)中的对tau磷酸肽特异的igg抗体成年恒河猴(每组n=3只雄性和3只雌性)使用以下进行皮下或肌肉内免疫：i)在第1、29、85和169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-a-a-a方案)；ii)在第1、29、85和169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗(a-a-a-a方案)；iii)在第1天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗，在第29和85天为与铝佐剂和cpg寡核苷酸cpg2006共注射的15 ug/剂缀合物x疫苗，以及在第169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-b-b-a方案)；iv)在第1和29天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗，以及在第85和169天为15 ug/剂缀合物x疫苗(a-a-b-b方案)；或v)在第1和29天为15 ug/剂缀合物x疫苗，以及在第89和169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗(b-b-a-a方案)。在第190天进行抽血，并且分离血清。
[0295]
使用greenberg和davies的改良方法(greenberg和davies, 1991, proc natl acad sci u s a, 87(15):5827-31)，富集的成对螺旋丝(ephf)的制备物从组织学证实的ad受试者的死后脑组织通过不溶性tau的肌氨酰提取而获得。使用mesoscale discovery (msd)平台以及作为包被抗原的ephf评估对ephf特异的抗体效价。将来自已免疫的猴的血清在测定缓冲液(pbs，0.05% tween20，1%脱脂奶)中连续稀释，并施于96孔msd板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板在pbst (pbs，0.05% tween20)中清洗。将抗体使用sulfotag
标记的抗人类/猴igg抗体进行检测，随后为以1%低聚甲醛(pfa)的固定步骤，然后加入读取缓冲液t (read buffer t)。使用sector imager (msd)对平板进行分析。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。对每只猴个体计算以任意单位(au)每ml表达的抗体效价。与用a-a-a-a获得的效价的几何平均值相比较的倍数变化(分别对于各脂质体组合物)以每只猴以及每组的几何平均值表示。
[0296]
使用msd平台评估对seq id no: 2的磷酸化的tau肽特异的抗体效价。将以含1% blocker a的pbs预先饱和的金小斑点链霉亲和素(gold small spot streptavidin)96孔板(msd)用在序列的n-末端生物素化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽包被。将来自已免疫的猴的csf在测定缓冲液(pbs，0.05% tween 20，1% blocker a)中连续稀释，并施于96孔msd平板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板用pbst (pbs，0.05% tween 20)清洗。将抗体使用sulfotag标记的抗人类/猴igg抗体进行检测，然后加入读取缓冲液t。使用sector imager (msd)对平板进行分析。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。对每只猴个体计算以au/ml表达的抗体效价。与用a-a-a-a获得的效价的几何平均值相比较的倍数变化(分别对于各脂质体组合物)以每只猴以及每组的几何平均值表示。将红血球计数高的样品从分析中去除，以避免血液污染导致的抗体效价的任何偏差。
[0297]
如图3所示，给予异源方案a-b-b-a和a-a-b-b (其中a为具有包封的t50、tlr4配体和脂质化的cpg寡核苷酸的脂质体疫苗(具有乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽)，且b为与铝佐剂和cpg寡核苷酸共注射的缀合物疫苗(连接于crm197的磷酸肽seq id no: 2))的猴在第190天(第四次注射后三周)显示了ephf特异性效价，其与给予同源治疗(a-a-a-a)的猴的ephf特异性效价相似或比其更高(倍数变化≥1)。
[0298]
然而，用异源方案b-b-a-a注射的所有猴显示比给予同源治疗(a-a-a-a)的猴的ephf特异性效价更低的ephf特异性效价(倍数变化≤1)。
[0299]
图6显示当在第183天(第四次注射后两周)在这些猴的脑脊髓液中监测igg抗体应答时可得出类似的结论。给予异源方案a-b-b-a和a-a-b-b(其中a为脂质体疫苗(具有乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽、包封的t50 (tlr4配体)和脂质化的cpg寡核苷酸)，且b为与铝佐剂和cpg寡核苷酸共注射的缀合物疫苗(连接于crm197的磷酸肽seq id no: 2))的猴显示了对seq id no: 2的磷酸化的tau肽特异的igg效价，其总体上比给予同源治疗(a-a-a-a)的猴的igg效价更高(倍数变化≥1)。然而，用异源方案b-b-a-a注射的所有猴均显示了比给予同源治疗(a-a-a-a)的猴的igg效价更低的对seq id no: 2的磷酸化的tau肽特异的igg效价(倍数变化≤1)。
[0300]
总体而言，此研究的结果表示，对于全身以及局部(在csf中)抗体应答，相较于使用作为引发组合物的缀合物疫苗的方案，使用作为引发组合物的脂质体疫苗的异源方案诱导了更高的ptau特异性igg效价。
[0301]
实施例6在恒河猴中使用引发脂质体疫苗的异源疫苗接种比同源方案诱导了更高的对tau磷酸肽和ephf特异的igg效价成年恒河猴(每组n=3只雄性和3只雌性)使用以下进行皮下或肌肉内免疫：i)在第1、29和85天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗
(a-a-a方案)；ii) 1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗(a-a-a方案)；iii)在第1天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗，以及在第29和85天为15 ug/剂缀合物x疫苗(a-b-b方案)；或iv)在第1和29天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗，以及在第85天为15 ug/剂缀合物x疫苗(a-a-b方案)。在第106天进行抽血，并且分离血清。
[0302]
使用seq id no: 2的磷酸化的tau肽作为包被抗原，通过elisa确定磷酸化tau肽特异性igg抗体效价。将来自已免疫的猴的血清在测定缓冲液(pbs，0.05% tween 20，1% bsa)中连续稀释，并施于预先用相关肽包被的96孔板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板在pbst (pbs，0.05% tween 20)中清洗。将抗体进行检测，所述检测使用hrp缀合的抗猴igg随后是abts底物(roche)。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。数据以个体终点效价(诱导阳性应答的最后血清稀释度)与每组几何平均值一起共同表达。使用单因素方差分析检验和tukey多重比较用于统计分析。
[0303]
使用msd平台评估了对ephf特异的抗体效价。将以含1% bsa的pbs预先饱和的金小斑点链霉亲和素96孔板(msd)用生物素化的抗tau捕获抗体(ht7-生物素，thermoscientific)包被，然后与分离自阿尔茨海默病患者脑的ephf一起孵育。在孵育一小时后，将平板用pbst清洗，且添加连续稀释的血清并孵育两小时。将结合的抗体使用sulfotag标记的抗人类/猴igg抗体进行检测，随后为以1% pfa的固定步骤，然后加入读取缓冲液t。使用sector imager (msd)对平板进行分析。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。结果以每只猴个体的au/ml以及每组几何平均值一起共同表达。表示了在第106天时的对ephf特异的抗体效价。使用单因素方差分析检验和tukey多重比较用于统计分析。
[0304]
图4a显示在恒河猴中异源方案a-a-b和a-b-b比同源方案a-a-a诱导了统计学显著更高水平的对磷酸化tau肽特异的igg抗体。
[0305]
图4b显示在恒河猴中异源方案a-a-b比同源方案a-a-a诱导了统计学显著更高水平的ephf特异性igg抗体，而在恒河猴中a-b-b显示了朝向比同源方案a-a-a更高水平的ephf特异性igg效价的趋势。
[0306]
总体而言，该数据显示使用脂质体疫苗(a)作为引发组合物的异源免疫方案比同源方案a-a-a诱导了更高的针对seq id no: 2的磷酸化的tau肽和ephf的抗体效价。
[0307]
实施例7在恒河猴中异源方案所诱导的ephf特异性igg抗体的品质与同源方案所诱导的抗体的品质相似或比它更好成年恒河猴(每组n=3只雄性和3只雌性)用以下进行皮下免疫：i)在第1、29、85和169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-a-a-a方案)，或ii)在第1天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗，在第29和85天为15 ug/剂缀合物x疫苗，以及在第169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z疫苗(a-b-b-a方案)；或者用以下进行肌肉内免疫：iii)在第1、29、85和169天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗(a-a-a-a方案)，或iv)在第1和29天为1800 ug乙酸四棕榈酰化的seq id no: 2的磷酸化的tau肽/剂脂质体z 疫苗，以及在第85和169天为15 ug/剂缀合
物x疫苗(a-a-b-b方案)。在第190天进行抽血，并分离血清。
[0308]
使用msd平台，将对富集的成对螺旋丝(ephf)特异的抗体的品质评估为与ephf低包被浓度(在本文中也称为在有限的包被条件下)的结合。将来自已免疫的猴的血清在测定缓冲液(pbs，0.05% tween20，1%脱脂奶)中连续稀释，并施于96孔msd平板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板在pbst (pbs，0.05% tween20)中清洗。将抗体使用sulfotag标记的抗人类/猴igg抗体进行检测，随后为以1% pfa的固定步骤，然后加入读取缓冲液t。使用sector imager (msd)对平板进行分析。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。对每只猴个体计算以au/ml表达的抗体效价。
[0309]
使用seq id no: 2的磷酸化的tau肽作为包被抗原，通过elisa确定磷酸化tau肽特异性igg抗体效价。将来自已免疫的猴的血清在测定缓冲液(pbs，0.05% tween 20，1% bsa)中连续稀释，并施于预先用相关肽包被的96孔板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板在pbst (pbs，0.05% tween 20)中清洗。将抗体使用hrp缀合的抗猴igg随后是abts底物(roche)进行检测。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。数据以个体终点效价(诱导阳性应答的最后血清稀释度)与每组几何平均值一起共同表达。
[0310]
使用t50肽作为包被抗原，通过elisa确定通用t细胞表位(t50)特异性igg抗体效价。将来自已免疫的猴的血清在测定缓冲液(pbs，0.05% tween 20，1%脱脂奶)中连续稀释，并施于预先用相关肽包被的96孔板。在孵育两小时后，将样品去除，且将平板在pbst (pbs，0.05% tween 20)中清洗。将抗体使用hrp缀合的抗猴igg随后是abts底物(roche)进行检测。所有样品均以八次两倍连续稀释运行，且在各平板上均包含阳性和阴性对照样品。数据以个体终点效价(诱导阳性应答的最后血清稀释度)与每组几何平均值一起共同表达。
[0311]
对每只猴以及每组的几何平均值表示磷酸化tau肽特异性igg抗体效价和通用t细胞表位(t50)特异性igg抗体效价之间的倍数变化。使用了mann-whitney检验用于统计分析。
[0312]
图5a和5b显示在有限包被条件下ephf特异性igg效价，反映了具有高结合能力的抗体。图5a显示a-b-b-a方案比a-a-a-a方案诱导了稍高的抗体效价，而a-a-b-b诱导了相似的igg效价。此外，如图3中所显示的，相较于仅用脂质体疫苗的同源方案(a-a-a-a方案)，异源方案a-b-b-a以及a-a-b-b诱导了总体相似或更高的ephf特异性抗体效价(倍数变化≥1)。总体而言，该数据表明在恒河猴中异源疫苗接种所诱导的ephf特异性抗体的品质相似于或好于同源a-a-a-a疫苗接种方案所诱导的抗体的品质。
[0313]
尽管不希望受到理论的束缚，但据信根据本技术的异源方案使cd4 t细胞应答多样化。由于生发中心内空间有限，若保持用相同cd4辅助性表位/蛋白(例如破伤风)进行免疫，那么破伤风特异性b和t细胞会将tau特异性b细胞从生发中心中挤出去。在另一方面，如果使cd4刺激交替，那么tau特异性b细胞(其也受到破伤风或白喉特异性t细胞的帮助)将更好地接近它们。在本发明中观察到，当使用a-a-a-a方案时，对t50辅助性肽的抗体的效价极大地增加了。当使用a和b的异源方案时，对t50辅助性肽的抗体的效价则低得多。图7显示，在异源方案(a-b-b-a和a-a-b-b)中针对seq id no: 2的磷酸化的tau肽的igg抗体效价和针对t50肽的igg抗体效价之间的比值相较于它们各自的同源方案(a-a-a-a)更高。那是cd4 t细胞应答多样性的反映，且还证实t50特异性b细胞应答并不完全支配抗ptau应答。
[0314]
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且可在不离开其广泛的发明构思的情况下对上述实施方案进行改变。因此应当理解，此发明并不限制于所公开的特定的实施方案，而是预期涵盖在如所附权利要求定义的本发明的精神和范围中的修饰。
[0315]
序列表seq id no: 1
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽(7.1)gdrsgys[ps]pg[ps]pg[pt]pgsrsrtseq id no: 2
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽(t3.5)vyk[ps]pvvsgdt[ps]prhlseq id no: 3
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽(22.1)sstgsidmvd[ps]pqla[pt]laseq id no: 4
ꢀ‑ꢀ
tau肽vykspvvsgdtsprhlseq id no: 5
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽renakaktdhgaeivyk[ps]pvvsgdt[ps]prhlseq id no: 6
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽rqefevmedhagt[py]glseq id no: 7
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽pgsrsr[pt]p[ps]lptpptrseq id no: 8
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽gysspg[ps]pg[pt]pgsrsrseq id no: 9
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽gdt[ps]prhl[ps]nvsstgsidseq id no: 10
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽pg[ps]pg[pt]pgsrsr[pt]p[ps]lpseq id no: 11
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽hl[ps]nvsstgsidseq id no: 12
ꢀ‑ꢀ
磷酸化tau肽vsgdt[ps]prhlseq id no: 13
ꢀ‑ꢀ
t50 t细胞表位akfvaawtlkaaavvrqyikanskfigitelvvrfnnftvsfwlrvpkvsashle-nh2seq id no: 14
ꢀ‑ꢀ
t46 t细胞表位akfvaawtlkaaagsqyikanskfigitelgsfnnftvsfwlrvpkvsashlek(pal)k(pal)-nh2seq id no: 15
ꢀ‑ꢀ
t48辅助性t细胞表位akfvaawtlkaaagsqyikanskfigitelgsfnnftvsfwlrvpkvsashlegslinstkiysyfpsviskvnq-nh2seq id no: 16
ꢀ‑ꢀ
t51辅助性t细胞表位akfvaawtlkaaarrqyikanskfigitelrrfnnftvsfwlrvpkvsashle-nh2seq id no: 17
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t52辅助性t细胞表位
akfvaawtlkaaarkqyikanskfigitelrkfnnftvsfwlrvpkvsashle-nh2seq id no: 18
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cpg2006 (也称为cpg7909)5
’‑
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’其中小写字母表示硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键seq id no: 19
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cpg10185
’‑
tgactgtgaacgttcgagatga-3’其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键seq id no: 20
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cpg23955
’‑
tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键seq id no: 21
ꢀ–ꢀ
cpg22165
’‑
gggggacgatcgtcgggggg-3’其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键且大写字母表示磷酸二酯(po)键seq id no:22
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cpg23365
’‑ꢀ
ggggacgacgtcgtggggggg
ꢀ‑3’
，其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键且大写字母表示磷酸二酯键seq id no:23
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pan dr表位(padre)肽akfvaawtlkaaaseq id no:24
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p2qyikanskfigitelseq id no:25
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p30fnnftvsfwlrvpkvsashleseq id no: 26
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tt586
–
605linstkiysyfpsviskvnqseq id no: 27
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棕榈酰化的磷酸化tau肽(棕榈酰化的7.1)k(pal)k(pal)gdrsgys[ps]pg[ps]pg[pt]pgsrsrtk(pal)k(pal)seq id no: 28
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棕榈酰化的磷酸化tau肽(t3，棕榈酰化的t3.5，棕榈酰化的seq id no:2)k(pal)k(pal)vyk[ps]pvvsgdt[ps]prhlk(pal)k(pal)seq id no: 29
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棕榈酰化的磷酸化tau肽(棕榈酰化的22.1)k(pal)k(pal)sstgsidmvd[ps]pqla[pt]lak(pal)k(pal)seq id no: 30
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棕榈酰化的tau肽k(pal)k(pal)vykspvvsgdtsprhlk(pal)k(pal)seq id no: 31
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)renakaktdhgaeivyk[ps]pvvsgdt[ps]prhlk(pal)k(pal)seq id no: 32
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)rqefevmedhagt[py]glk(pal)k(pal)seq id no: 33
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)pgsrsr[pt]p[ps]lptpptrk(pal)k(pal)
seq id no: 34
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)gysspg[ps]pg[pt]pgsrsrk(pal)k(pal)seq id no: 35
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)gdt[ps]prhl[ps]nvsstgsidk(pal)k(pal)seq id no: 36
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)pg[ps]pg[pt]pgsrsr[pt]p[ps]lpk(pal)k(pal)seq id no: 37
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)hl[ps]nvsstgsidk(pal)k(pal)seq id no: 38
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棕榈酰化的磷酸化tau肽k(pal)k(pal)vsgdt[ps]prhlk(pal)k(pal)seq id no:39
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没有c-末端酰胺的t50akfvaawtlkaaavvrqyikanskfigitelvvrfnnftvsfwlrvpkvsashleseq id no: 40
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在c-末端没有-lys(pal)-lys(pal)-nh2的t46akfvaawtlkaaagsqyikanskfigitelgsfnnftvsfwlrvpkvsashleseq id no: 41
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没有c-末端酰胺的t48akfvaawtlkaaagsqyikanskfigitelgsfnnftvsfwlrvpkvsashlegslinstkiysyfpsviskvnqseq id no: 42
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没有c-末端酰胺的t51akfvaawtlkaaarrqyikanskfigitelrrfnnftvsfwlrvpkvsashleseq id no: 43
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没有c-末端酰胺的t52akfvaawtlkaaarkqyikanskfigitelrkfnnftvsfwlrvpkvsashleseq id no: 44
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t57 (56，57)akfvaawtlkaaavvrqyikanskfigitelvvrfnnftvsfwlrvpkvsashle-k(pal)k(pal)-nh2参考文献asuni aa等人,. j neurosci. 2007 aug 22；27(34):9115-29bentebibel等人, 2013, sci transl med., 5(176):176ra32crotty, 2011, annual reviews of immunology. vol 29:p621-663friedhoff等人, biochimica et biophysica acta 1502 (2000) 122-132greenberg和davies, 1991, proc natl acad sci u s a, 87(15):5827-31hanger等人, trends mol med. 15:112-9, 2009hickman等人, j. biol. chem. vol. 286, no. 16, pp. 13966
–
13976, april 22, 2011kontsekova e等人, alzheimers res ther. 2014 aug 1；6(4):44novak p等人, lancet neurology 2017, 16:123-134peeraer等人, 2015, neurobiol dis., 73:83-95ries等人, 2015, org. biomol. chem., 13:9673spensieri等人, 2013, proc natl acad sci u s a., 110(35):14330-5theunis c等人, plos one. 2013； 8(8): e72301
us7,741,297us8,647,631us9,687,447wo90/14837wo2010/115843。