以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法与流程

以5-羟基
β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新的合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺方法及其应用。


背景技术：

2.n-乙酰基-5-甲氧基色胺主要是哺乳动物松果体腺分泌的重要吲哚类神经激素，吲哚以其独特的化学结构，在化学合成医药中降压药、抗组胺药、解热镇痛剂等都有它的身影，许多生物碱、高效植物生长调节剂、染料等领域都系吲哚类衍生物。n-乙酰基-5-甲氧基色胺能够改善动物机体睡眠质量。随着动物年龄的增长，n-乙酰基-5-甲氧基色胺的分泌量逐渐下降。现在越来越多的研究表明n-乙酰基-5-甲氧基色胺除了能够治疗失眠症外，还具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗癌等多种生理功能。
3.n-乙酰基-5-甲氧基色胺系天然药物产物成分，产生的副作用甚微，与目前的广泛使用的镇静安眠药相比较，在毒副作用、剂量、成瘾截断方面优势明显。故n-乙酰基-5-甲氧基色胺的作用疗效和市场价值举足轻重、不可替代。
4.目前，n-乙酰基-5-甲氧基色胺的获得主要有生物提取和化学合成两大类。由于动植物中天然存在的n-乙酰基-5-甲氧基色胺含量很少，并且提取原料来源有限，提取成本居高不下，工业应用受到诸多限制。
5.相比化学合成，生物合成具有对环境友好，能耗低，绿色环保等优点。随着合成生物学的发展，越来越多的化合物实现了生物绿色生产。提供能够高产量生物合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的工程菌及合成方法意义重大。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题为提供n-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株、构建以及以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
8.提供一种以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法，包括以下步骤：
9.1)利用所述的合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺蛋白编码基因或能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺，所述的能够表达合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺蛋白编码基因包括5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因ddc；5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat、acs；n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt、mat；
10.2)从1)的体系中分离得到n-乙酰基-5-甲氧基色胺。
11.按上述方案，5-羟基产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat的核苷酸序列如
seq id no:2-10中任一序列所示；n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt的核苷酸序列如seq id no:12-18中任一序列所示。
12.按上述方案，5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因ddc的核苷酸序列如seq id no:1所示；
13.5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因acs的核苷酸序列如seq id no:11所示；
14.n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因mat基因核苷酸序列如seq id no：19所示。
15.优选地，所述5-羟基产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat的核苷酸序列如seq id no:2，seq id no:3，seq id no:5，seq id no:6和seq id no:10中任一序列所示；所述n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt的核苷酸序列如seq id no:13或seq id no:18所示。
16.更优选地，5-羟基产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat的核苷酸序列如seq id no:10中任一序列所示，n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt的核苷酸序列如seq id no:13所示；
17.或5-羟基产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat的核苷酸序列如seq id no:10中任一序列所示，n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt的核苷酸序列如seq id no:18所示。
18.本发明还提供一种包含所述合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因的重组载体。
19.本发明还提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为包括上述重组载体的重组基因工程菌，或为将部分酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到的重组基因工程菌。
20.按上述方案，5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因ddc基因在宿主细胞的基因组上表达，其他目的酶基因在质粒中表达后转入基因组表达了5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因ddc基因的宿主细胞中。
21.提供一种重组基因工程菌的构建方法：
22.将包括所述合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因的重组载体转入到宿主细胞中，得到重组基因工程菌；
23.或将一部分目的酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余目的酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到重组基因工程菌。
24.具体地，本发明重组基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
25.将5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat和acs放入同一质粒串连表达；n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt和mat放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至基因组上表达了ddc基因的宿主细胞中，得到重组基因工程菌。
26.进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为bl21(de3)，δtrpr(ddc)，δtnaa，δsped大肠杆菌宿主细胞；即以bl21(de3)为出发菌株，将基因组上的trpr基因替换为ddc基因，并敲除tnaa基因和sped基因。
27.本发明的有益效果：
28.本发明提供了n-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株，其用于以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺，n-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成产量高。进一步通过5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat(芳香胺-n-乙酰基转移酶)的筛选和n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt(儿茶酚-o-甲基转移酶)不同物种来源的同功酶的筛选及组合筛选，显著提升了生物合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量。
29.本发明提供并优化了n-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株的构建方法。部分目的酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，部分酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中优化构建n-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株，有助于合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺蛋白编码基因的表达，获得高产n-乙酰基-5-甲氧基色胺菌株。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1：5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺质粒图谱
32.图2：n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺质粒图谱
具体实施方式
33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
34.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
35.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
36.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
37.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
38.大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。下述以大肠杆菌出发，通过改造大肠杆菌以实现发酵法高效大规模工业
化生产n-乙酰基-5-甲氧基色胺。
39.实施例1质粒的构建
40.5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺质粒的构建
41.5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat、acs的串联表达。
42.选择不同来源的9种aanat基因，经过密码子优化人工合成得到a1-a9，分别依次如seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4，seq id no:5，seq id no:6，seq id no:7，seq id no:8，seq id no:9，seq id no:10所示。a1-a9、acs基因插入到pacycduet质粒的ncoi和aflⅱ位点之间，获得pacycduet-a1、pacycduet-a2、pacycduet-a3、pacycduet-a4、pacycduet-a5、pacycduet-a6、pacycduet-a7、pacycduet-a8、pacycduet-a9、pacycduet-acs质粒(如图1所示)。
43.以pacycduet-acs-f和pacycduet-acs-r引物，pacycduet-acs质粒为模板，克隆获得含acs基因的pacycduet质粒载体；以a1-f、a1-r，a2-f、a2-r，a3-f、a3-r，a4-f、a4-r，a5-f、a5-r，a6-f、a6-r，a7-f、a7-r，a8-f、a8-r，a9-f、a9-r引物，分别以质粒pacycduet-a1、pacycduet-a2、pacycduet-a3、pacycduet-a4、pacycduet-a5、pacycduet-a6、pacycduet-a7、pacycduet-a8、pacycduet-a9为模板克隆获得a1-a9基因片段。
44.将以上a1-a9基因片段分别与含acs基因的pacycduet质粒载体片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pacycduet-a1-acs、pacycduet-a2-acs、pacycduet-a3-acs、pacycduet-a4-acs、pacycduet-a5-acs、pacycduet-a6-acs、pacycduet-a7-acs、pacycduet-a8-acs、pacycduet-a9-acs。
45.表1引物序列1
46.47.[0048][0049]
n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺质粒的构建
[0050]
n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt、mat的串联表达。
[0051]
选择不同来源的comt基因经过密码子优化人工合成得到c1-c7，核苷酸序列分别依次如seq id no:12，seq id no:13，seq id no:14，seq id no:15，seq id no:16，seq id no:17，seq id no:18所示。c1-c7、mat基因插入到质粒petduet的ncoi和aflⅱ位点之间，获得petduet-c1、petduet-c2、petduet-c3、petduet-c4、petduet-c5、petduet-c6、petduet-c7、petduet-mat质粒。
[0052]
以petduet-mat-f、petduet-mat-r为引物，petduet-mat质粒为模板克隆获得含mat基因的petduet质粒载体；以c1-f、c1-r，c2-f、c2-r，c3-f、c3-r，c4-f、c4-r，c5-f、c5-r，c6-f、c6-r，c7-f、c7-r为引物，分别以质粒petduet-c1、petduet-c2、petduet-c3、petduet-c4、petduet-c5、petduet-c6、petduet-c7为模板克隆获得c1-c9基因片段。
[0053]
将c1-c9基因片段与含mat基因的petduet质粒载体通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒petduet-c1-mat、petduet-c2-mat、petduet-c3-mat、petduet-c4-mat、petduet-c5-mat、petduet-c6-mat、petduet-c7-mat。
[0054]
表2引物序列2
[0055]
[0056]
[0057][0058]
实施例2宿主菌的改造
[0059]
tnaa基因的敲除，5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶ddc的基因组表达，sped基因的敲除。
[0060]
分别以tnaaup-f、tnaaup-r，tnaadown-f，tnaadown-r为引物，bl21(de3)基因组为模板，获得tnaa基因上游片段和tnaa基因下游片段。将两片段以tnaaup-f、tnaadown-r为引物进行融合pcr连接，得到δtnaa片段。将此片段电转入bl21(de3)感受态中替换基因组tnaa基因，pcr筛选出阳性克隆。命名为hp114。
[0061]
ddc基因经密码子优化，序列如seq id no.1所示，插入到pet28a( )质粒的ndei和xhoi位点之间，获得pet28a-ddc质粒。
[0062]
以ddc/trpr-f，ddc/trpr-r为引物，以质粒pet28a-ddc为模板，获得带有trpr上下游同源臂的ddc基因片段。将此片段电转入hp114感受态中替换基因组trpr基因，pcr筛选出阳性克隆。命名为hp115。
[0063]
分别以spedup-f、spedup-r，speddown-f，speddown-r为引物，bl21(de3)基因组为模板，获得sped基因上游片段和sped基因下游片段。将两片段以spedup-f、speddown-r为引物进行融合pcr连接，得到δsped片段。将此片段电转入hp115感受态中替换基因组tnaa基因，pcr筛选出阳性克隆。命名为hp116。
[0064]
表3引物序列3
[0065]
[0066][0067]
实施例3产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建和筛选
[0068]
(1)5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺的工程菌的构建和关键基因aanat的筛选：将质粒pacycduet-a1-acs、pacycduet-a2-acs、pacycduet-a3-acs、pacycduet-a4-acs、pacycduet-a5-acs、pacycduet-a6-acs、pacycduet-a7-acs、pacycduet-a8-acs、pacycduet-a9-acs电转化入菌株hp116感受态中，得到工程菌hp116-a1、hp116-a2、hp116-a3、hp116-a4、hp116-a5、hp116-a6、hp116-a7、hp116-a8、hp116-a9。将工程菌hp116-a1、hp116-a2、hp116-a3、hp116-a4、hp116-a5、hp116-a6、hp116-a7、hp116-a8、hp116-a9分别在含有34μg/ml氯霉素抗生素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的od
600
＝5，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；将2％的上述种子液接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4·
3h2o的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；发酵培养2h后，加入1mm iptg进行诱导表达，诱导表达的温度为30℃，诱导表达10h后停止发酵，加入终浓度为6g/l的5-羟色胺，转化10h，利用高效液相色谱检测n-乙酰-5-羟色胺的产量。
[0069]
结果如表4所示，其中：工程菌hp116-a1、hp116-a2、hp116-a4、hp116-a5、hp116-a9产n-乙酰-5-羟-色胺的能力高于其他菌株，即编号为a1、a2、a4、a5、a9的基因产n-乙酰-5-羟-色胺的能力较高。
[0070]
表4：5-羟色胺产n-乙酰-5-羟-色胺不同aanat菌株产量比较
[0071][0072]
(2)n-乙酰-5-羟-色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺的工程菌的构建和关键基因comt的筛选：将质粒petduet-c1-mat、petduet-c2-mat、petduet-c3-mat、petduet-c4-mat、petduet-c5-mat、petduet-c6-mat、petduet-c7-mat电转化入菌株hp116感受态中，得到工程菌hp116-c1、hp116-c2、hp116-c3、hp116-c4、hp116-c5、hp116-c6、hp116-c7。将上述工程菌分别在含有100μg/ml氨苄青霉素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的od
600
＝5，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；将2％的上述种子液接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4·
3h2o的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；发酵培养2h后，加入1mm iptg进行诱导表达，诱导表达的温度为30℃，诱导表达10h后停止发酵，加入终浓度为6g/l的n-乙酰-5-羟-色胺，同时补加蛋氨酸，使蛋氨酸的浓度始终在0.5g/l左右，转化10h，利用高效液相色谱检测n-乙酰基-5-甲氧基色胺。
[0073]
结果如表5所示，其中：工程菌hp116-c2、hp116-c7产n-乙酰-5-羟色胺的能力高于其他菌株，即编号为c2、c7的基因产n-乙酰基-5-甲氧基色胺的能力较高。
[0074]
表5：n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺不同comt菌株产量比较
[0075][0076]
(3)5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺的工程菌的构建和筛选
[0077]
进一步将上述优异的5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺关键基因aanat和n-乙酰-5-羟-色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺关键酶基因comt组合，评价筛选这些不同基因组合的工程菌合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的效果，典型地，
[0078]
将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产n-乙酰-5-羟色胺的质粒pacycduet-a1-acs、pacycduet-a2-acs、pacycduet-a4-acs、pacycduet-a5-acs，pacycduet-a9-acs，与5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺质粒按表4组合电转化入菌株hp116感受态中，得到工程菌hp116-a1c2、hp116-a2c2、hp116-a4c2、hp116-a5c2、hp116-a9c2、hp116-a1c7、hp116-a2c7、hp116-a4c7、hp116-a5c7、hp116-a9c7。将上述工程菌分别在含有34μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄霉素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的od600＝5，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；将2％的上述种子液接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％kh2po4和1.64％k2hpo4
·
3h2o的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；发酵培养2h后，加入1mm iptg进行诱导表达，诱导表达的温度为30℃，诱导表达16h后停止发酵，加入终浓度为6g/l的5-羟基β-吲哚基丙氨酸，转化10h，利用高效液相色谱检测n-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量。
[0079]
结果如表6所示，不同基因组合提供的工程菌合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量为2.41(g/l)以上，最优的，为菌株hp116-a9c2，产量最高，达4.5g/l,即编号为a9的aanat和编号为c2的comt合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的效果最佳。
[0080]
表6：5-羟基β-吲哚基丙氨酸产n-乙酰基-5-甲氧基色胺不同组合菌株产量比较
[0081][0082]
本发明通过5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因ddc；5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat、acs；n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt、mat的配合、构建获得了以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的工程菌株，用于以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺，合成途径为：5-羟β-吲哚基丙氨酸
→
5-羟色胺
→
n-乙酰-5-羟色胺
→
n-乙酰基-5-甲氧基色胺。
[0083]
进一步通过5-羟色胺产n-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因aanat的筛选和n-乙酰-5-羟色胺产n-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因comt的筛选及组合筛选，显著提升了生物合成n-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量。为高效大规模工业化生产n-乙酰基-5-甲氧基色胺提供了条件。