调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学材料、组织工程与医学领域，具体涉及一种调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.关节软骨是骨骼系统中的一种结缔组织，软骨无血管，成熟软骨的生物活性和新陈代谢有限，再生修复能力有限，当关节软骨缺损不及时得到治疗，会恶化导致关节炎，严重的会导致残疾。近年来，组织工程这个治疗策略取得一定进展，已有文献报道通过嵌入生长因子可以诱导骨髓间充质干细胞增殖分化，对骨软骨再生修复有积极的作用。然而生长因子使用的局限性也凸显，包括疼痛、肿胀或异位骨形成，此外生物活体再生修复是一个相当漫长的过程，药效与不良反应之间的平衡很难把控。因此不借助生长因子到达修复目的可能是未来的发展方向。此外，由于骨和软骨的组织结构不同，一旦骨软骨一体缺损就会导致整个修复过程相当复杂度变高。考虑到软骨和软骨下骨复杂的生化结构和复杂的功能也是相当重要的。因此，在规避使用生长因子的情况下，又需要能刺激调控细胞的生物活性因子。
3.目前，一些治疗性离子也被关注，这些生物活性刺激因子已被报道可以促组织修复。研究表明治疗离子尤其对关节软骨组织和骨组织的发育维持起到重要作用，特别是镁离子，铜离子等作为人体所需元素，参与了人体的代谢、结构和调节功能。镁离子引入不但可以调控机械性能，还可以介导基质，促进软骨合成。铜作为一种微量元素，在骨髓间充质干细胞分化增殖和成骨分化等方面有调节作用，还具有优异的抗菌特性。目前在仿生水凝胶支架中添加两种治疗性离子的研究相对缺乏。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种调控骨和软骨细胞促进修复的仿生双层水凝胶制备方法，以解决现有技术中仿生水凝胶支架中添加两种治疗性离子的研究相对缺乏的技术问题。
5.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶，包括上层软骨层、下层的骨层，软骨层包含聚谷氨酸、羧甲基壳聚糖、细菌纤维素、硫酸镁、水、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐；所述骨层包含聚谷氨酸、羧甲基壳聚糖、细菌纤维素、硫酸铜、水、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐；所述软骨层与骨层的界面之间紧密连接。
6.进一步地，所述软骨层中聚谷氨酸的重量份为5-9、羧甲基壳聚糖重量份为 4-6、细菌纤维素的重量份为5-9、水的重量份为80-150、硫酸镁重量份为1-3、 n-羟基琥珀酰亚胺的重量份为1-2、1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐的重量份为2-3。
7.进一步地，所述骨层中聚谷氨酸的重量份为5-9、羧甲基壳聚糖重量份为 4-6、细菌纤维素的重量份为5-9、水的重量份为80-150、硫酸铜的重量份为 0.05-0.09、n-羟基琥
珀酰亚胺的重量份为1-2、1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐的重量份为2-3。
8.进一步地，其压缩模量为0.08-0.925mpa，压缩应变范围为60-80％。
9.进一步地，所述骨层中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
10.进一步地，所述软骨层中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
11.为了实现上述目的，根据本发明的另一个方面，还提供了一种调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
12.步骤一、将5-9重量份的聚谷氨酸、4-6重量份的羧甲基壳聚糖、5-9重量份的细菌纤维素和0.05-0.09重量份的硫酸铜溶于80-150重量份的超纯水中，混合待用；
13.步骤二：将5-9重量份的聚谷氨酸、4-6重量份的羧甲基壳聚糖、5-9重量份的细菌纤维素和1-3重量份的硫酸镁溶于80-150重量份的超纯水中，混合待用；
14.步骤三、将步骤一所得的混合溶液中加入1-2份的n-羟基琥珀酰亚胺、2-3 份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌均匀后倒入磨具中形成骨层，将步骤二所得的混合溶液中加入1-2份的n-羟基琥珀酰亚胺、2-3份的 1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀后倒在骨层的上表面形成软骨层，最终得到调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶；
15.进一步地，步骤二所得的混合溶液中加入的n-羟基琥珀酰亚胺以及1-(3
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二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐的量均少于步骤一。
16.进一步地，所述步骤一中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
17.进一步地，所述步骤二中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
18.可见，本发明制备的上层软骨层以天然高分子网络为基体，引入治疗性镁离子。镁离子引入可以调控水凝胶支架的力学性能，使得水凝胶的能承受的在载荷达到软骨所需承受的机械性能，以及水凝胶的压缩模量与软骨所匹配。此外，镁离子的释放可以促进软骨细胞增殖分化，促进再生修复。
19.本发明制备的下层骨层高强度水凝胶通过引入治疗性铜离子，其增强效果能使的水凝胶具有和骨结构相匹配的力学特性，还使得材料具有优异的抗菌特性，更重要的是，铜离子的有效释放还可以诱导血管生成，促进骨生长。
20.本发明制备的调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶，具有很好的生物相容性，并且具有全生物降解性，通过加入不同的生物活性因子和不同含量的 n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐可以同时调节同一种水凝胶的内部结构、力学性能和组分，从而使得一个材料同时满足促进骨和软骨再生需求，实现骨软骨缺损一体化再生修复提供一种可能。
21.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌均匀后倒入磨具中形成骨层，将步骤二所得的混合溶液中加入1-2份的n-羟基琥珀酰亚胺、2-3份的 1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀后倒在骨层的上表面形成软骨层，最终得到调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶；
40.步骤二所得的混合溶液中加入的n-羟基琥珀酰亚胺以及1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐的量均少于步骤一。
41.所述步骤一中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
42.所述步骤二中细菌纤维素为质量体积百分比为0.75％—1％的细菌纤维素溶浆。
43.cu
2
即铜离子，n-羟基琥珀酰亚胺即nhs，1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐即edc。
44.如图1所示，上层的水凝胶为仿生软骨的致密结构，这是由于通过edc/nhs 调控水凝胶的孔径，使材料符合软骨层1致密的特点；下层的水凝胶为仿生高强度骨结构，一方面通过edc/nhs调控水凝胶的孔径，另一方面通过cu
2
调控水凝的力学性能，在制备时，需要在一层水凝胶未完全胶时倒入另外一层，最终形成能同时修复骨和软骨的一体化可调控双层水凝胶支架即本发明的产品调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶。
45.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：
46.实施例1
47.步骤一、将5的聚谷氨酸、4的羧甲基壳聚糖、5的细菌纤维素和0.05g的硫酸铜溶于80g的超纯水中，混合待用；
48.步骤二：将5g的聚谷氨酸、4g的羧甲基壳聚糖、5g的细菌纤维素和1g的硫酸镁溶于80g的超纯水中，混合待用；
49.步骤三、将步骤一所得的混合溶液中加入1份的n-羟基琥珀酰亚胺、2份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌3分钟后倒入模具，继续静置3-6分钟形成骨层2，将步骤二所得的混合溶液中加入1份的n-羟基琥珀酰亚胺、2份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐，3分钟后倒在骨层2的上表面继续静置3-6分钟形成软骨层1，最终得到调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶；
50.实施例2
51.步骤一、将7g的聚谷氨酸、5g的羧甲基壳聚糖、7g的细菌纤维素和0.07g 的硫酸铜溶于110g的超纯水中，混合待用；
52.步骤二：将7g的聚谷氨酸、5g的羧甲基壳聚糖、7g的细菌纤维素和2g的硫酸镁溶于110g的超纯水中，混合待用；
53.步骤三、将步骤一所得的混合溶液中加入1.5份的n-羟基琥珀酰亚胺、2.5 份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌3分钟后倒入模具，继续静置3-6分钟形成骨层2，将步骤二所得的混合溶液中加入1.5份的n-羟基琥珀酰亚胺、2.5份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐，3分钟后倒在骨层2的上表面继续静置3-6分钟形成软骨层1，最终得到调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶；
54.实施例3
55.步骤一、将9g的聚谷氨酸、6g的羧甲基壳聚糖、9g的细菌纤维素和0.9g 的硫酸铜溶于150g的超纯水中，混合待用；
56.步骤二：将9g的聚谷氨酸、6g的羧甲基壳聚糖、9g的细菌纤维素和3g的硫酸镁溶于150g的超纯水中，混合待用；
57.步骤三、将步骤一所得的混合溶液中加入2份的n-羟基琥珀酰亚胺、3份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌3分钟后倒入模具，继续静置3-6分钟形成骨层2，将步骤二所得的混合溶液中加入2份的n-羟基琥珀酰亚胺、3份的1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐，3分钟后倒在骨层2的上表面继续静置3-6分钟形成软骨层1，最终得到调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶；
58.将上述制备所得调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶冷冻干燥，取其断面，喷金后用扫描电镜观察水凝胶及其连接面。
59.如图2所示，调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶的上下双层界面连接紧密，上层结构紧凑。如图3所示，证实了调控骨和软骨细胞促进修复的仿生水凝胶的下层即骨层2表现出多孔结构，孔径范围为150-350μm。
60.以上对本发明的有关内容进行了说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。基于本发明的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。