一种氨甲环酸脂肪醇酯及其凝胶制剂在硬化治疗的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氨甲环酸脂肪醇酯及其凝胶制剂在硬化治疗的应用。


背景技术：

2.目前医学上，根据血管内皮细胞生物学特性的分类法，将传统的“血管瘤”重新分为血管瘤和脉管畸形。而脉管畸形又包括毛细血管畸形、遗传性出血性毛细血管扩张症、静脉畸形、球细胞静脉畸形、淋巴管畸形和动静脉畸形等。而其中最常见的是静脉畸形，多发于头部、面部、颈部及口腔等部位，而这些部位常常含有丰富的血管丛，与周围正常组织界限清晰度不够，手术切除不理想，因此能够更准确控制给药部位的硬化治疗成为临床治疗的首选方式。“血管瘤和脉管畸形的诊断及治疗指南(2019版)”，《组织工程与重建外科杂志》,2019,15(5):277-317.中将硬化治疗作为临床治疗的首选方式。
3.硬化治疗是指在脉管管腔内注射药物，破坏管腔内皮细胞，从而使管腔壁纤维化，达到闭锁管腔的效果，具有这种作用的药物被称为硬化剂。硬化治疗是目前血管瘤、脉管畸形和静脉曲张的主要手段。
[0004]“聚多卡醇治疗血管瘤及脉管畸形研究进展”，中国口腔颌面外科杂志,2020,18(01):77-81.将硬化剂主要分为化学性硬化剂、表面活性剂类硬化剂和渗透性硬化剂3类。表面活性剂类硬化剂是最常用的硬化剂类型，其包括聚多卡醇、聚桂醇以及十四烷基硫酸钠等泡沫硬化剂。其中比较有代表性的表面活性剂类硬化剂药物为聚多卡醇，目前已经广泛应用于静脉曲张和静脉畸形等疾病的治疗。聚多卡醇硬化治疗早期主要用于肢体静脉曲张，以后逐步应用到口腔颌面-头颈部静脉畸形、淋巴管畸形的治疗，且获得了较为满意的治疗效果。聚多卡醇通过破坏细胞膜，使血管内皮细胞损伤裂解，剥离血管内膜，暴漏胶原纤维，使血小板聚集，激活凝血系统，形成血栓栓塞血管，进而发生血管纤维化，使血管闭锁。临床使用时，将它们与空气混合形成泡沫，注射入血管排挤血液，使药物与血管壁充分接触。但其不稳定的泡沫体积和短暂的泡沫半衰期可能导致栓塞不完全以及作用时间变短而限制了其应用。因此，可精准栓塞和实现药物缓释的新型制剂在静脉畸形治疗中显示出重要性。在这之中，可注射凝胶是近年常用于改善静脉畸形药物滞留性的有效方式之一，除传统高分子凝胶以外，更多研究者开始倾向于选择具有优异载药量、生物可降解性和力学性能的小分子凝胶。“low molecular gelators of organic liquids and the properties of their gels”.chemical reviews.1997,97(8):3133-3159.表明小分子凝胶是由低分子量凝胶因子通过氢键、π-π堆积、范德华力、离子键、供体-受体、疏水作用和金属配位等非共价键自组装形成三维网状结构束缚溶剂分子形成。目前研究更多的作为母体的化合物有氨基酸类、多肽类、糖类、脂肪酸类、吡啶类和脲键类，它们通常拥有易被修饰的或者能够提供自组装驱动力的亲水或疏水基团。“lecithin organogels:structure,dynamics,and phase behavior”，self assembly 2003,318-328.中表明其大量衍生物已作为载体，实现药物、蛋白和基因的体内递送，并充分证明了其杰出载药-释药能力、生物可
降解性和生物相容性。


技术实现要素：

[0005]
针对上述问题，本发明提供一种氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐及其凝胶制剂用作医疗上的硬化剂，在血管瘤及脉管畸形、静脉曲张硬化治疗中的应用。
[0006][0007]
式i中，所述r选自c
6-c9烷基，优选为c8或c9烷基。
[0008]
本发明在氨甲环酸脂肪醇酯实验研究中，发现氨甲环酸脂肪醇酯具有极好的血管硬化作用，并且可以在水中自组装形成凝胶，作为药物自递送载体，大大提高了载药能力和脉管硬化治疗的靶向性，这一发现在现有文献中未见类似报道。
[0009]
本发明采用氨甲环酸为化合物母体，利用酯化反应合成了新型阳离子两亲性分子氨甲环酸脂肪醇酯。氨甲环酸脂肪醇酯具有良好血管硬化作用的机制为：破坏血管内皮细胞膜，使内皮细胞坏死，损伤血管壁，诱发血栓；同时氨甲环酸脂肪醇酯在血液中逐步代谢为氨甲环酸，氨甲环酸可以抑制纤溶酶原和纤溶酶的活性，防止血栓的溶解，对已经生成的血栓起到保护作用，最终使血管纤维化从而导致血管闭锁，起到硬化治疗作用。氨甲环酸(tranexamic acid,ta)又名凝血酸，反-4-氨甲基环已烷甲酸，是人工合成赖氨酸类似物。“tranexamic acid:a review of its use in surgery and other indications”，drugs,1999,57(6):1005-1032.中认为氨甲环酸在纤溶酶k结构域的亲和力大于止血纤维蛋白的赖氨酸残基，优先结合在k结构域后几乎完全阻断纤溶酶原或纤溶酶重链与纤维蛋白的结合，抑制了纤维蛋白的溶解，从而保持和稳定止血纤维蛋白骨架结构。凝血酸自身不会激发凝血，只抑制纤溶酶原和纤溶酶的活性，对已经生成的血栓起保护作用，不会引发非靶区的凝血风险。氨甲环酸临床上广泛用于急性或慢性、局限性或全身性原发性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血，以及黄褐斑的治疗，给药途径有口服、注射和外用；氨甲环酸在体内稳定，大约95％的药物以原形排泄，大规模的临床试验充分证实了氨甲环酸凝血作用的疗效和以及很好的安全性。本发明实现了以“血栓诱发-纤溶抑制”双重机制对需要硬化的血管系统进行强力干预，增加了血栓的紧实性、稳固性与持续性，在最短时间内实现了血管硬化治疗作用。氨甲环酸脂肪醇酯是一种在血管瘤、脉管畸形以及静脉曲张的硬化治疗中具有极大治疗潜力的药物化合物。同等重要的是，氨甲环酸脂肪醇酯作为凝胶因子，它们能在水中自组装形成水凝胶，不需要任何其他辅料辅助成型，就可以作为治疗药物氨甲环酸脂肪醇酯的自递送载体系统，极大地减少了非活性物质带来的潜在副作用和增加了血管硬化治疗靶部位的精准性和方便性。
[0010]
综上，本发明首要目的是提供一种氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐在硬化治疗中制备硬化剂的用途。
[0011]
本发明还提供一种氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐在制备治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张的药物中的用途。
[0012]
所述氨甲环酸脂肪醇酯是c
6-c9脂肪醇的单一酯，或者是两种或两种以上c
6-c9脂肪醇酯的任意比例的混合物。进一步地，氨甲环酸脂肪醇酯是氨甲环酸正己醇酯(c6脂肪醇酯)、氨甲环酸正庚醇酯(c7脂肪醇酯)、氨甲环酸正辛醇酯(c8脂肪醇酯)或氨甲环酸正壬醇酯(c9脂肪醇酯)。
[0013]
所述药学上可接受的盐，通过加入药学上可接受的酸获得，所述药学上可接受的酸包括盐酸，硫酸，磷酸，枸橼酸，酒石酸及乳酸。
[0014]
所述硬化治疗中制备硬化剂的用途和/或在制备治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张的药物中的用途，其中氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐被制备成凝胶制剂，所述凝胶制剂为自组装凝胶剂型，由氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐和注射用水组成，氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐在凝胶中的浓度％(w/w)为1％-90％。
[0015]
本发明还提供一种用于治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张的凝胶制剂，该凝胶剂型为自组装的凝胶，凝胶由氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐和注射用水组成，氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐在凝胶中的浓度％(w/w)为1％-90％。
[0016]
所述的凝胶制剂中，所述氨甲环酸脂肪醇酯为是c
6-c9脂肪醇的单一酯，或者是两种或两种以上c
6-c9脂肪醇酯的任意比例的混合物。进一步地，氨甲环酸脂肪醇酯是氨甲环酸正辛醇酯(c8脂肪醇酯)、氨甲环酸正壬醇酯(c9脂肪醇酯)或二者的混合物。
[0017]
所述的凝胶制剂中，还可以加入药学上可接受的辅料，所述辅料包括乙醇、丙二醇、甘油。
[0018]
所述的凝胶制剂的制备方法包括，称取氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐置于注射用水中，搅拌使全部溶解，静置，即得到。进一步地，称取氨甲环酸脂肪醇酯或其药学上可接受的盐置于注射用水中，再加入辅料，搅拌使全部溶解，静置，即得到，所述辅料包括乙醇、丙二醇、甘油。
[0019]
综上所述，本发明的有益效果主要概括为以下三点：
[0020]
1.本发明的氨甲环酸脂肪醇酯具有硬化治疗的药效作用，其通过破坏血管内皮细胞膜，损伤血管壁，形成血栓栓塞血管，使血管纤维化闭琐；是一种理想的硬化剂，可以用于血管瘤、脉管畸形以及静脉曲张的治疗。
[0021]
2.本发明的氨甲环酸脂肪醇酯，在结构上属于两亲性分子，作为小分子的凝胶因子，不需要添加任何辅料，它们能在水中自组装形成可注射的水凝胶，用作药物自递送载体，具有优异的载药量。氨甲环酸脂肪醇酯水凝胶注入血管后，因具有粘弹性和成型性，依靠自身机械性能抵抗血液的侵蚀，提高了药物在给药部位的滞留性，延长了对血管内壁的作用时间，有利于血管的栓塞快速形成，并且大大避免了发生异位栓塞的风险。
[0022]
3.氨甲环酸脂肪醇酯凝胶注射到需要治疗的血管后，在血管中释放的药物能逐渐代谢为母体药物氨甲环酸，氨甲环酸通过抑制纤溶酶原和纤溶酶的活性对已经生成的血栓起到保护作用，强化了栓塞和硬化作用，巩固了治疗效果；同时因为代谢产物氨甲环酸不会影响凝血系统以及诱发新的血栓，这种代谢性能可以避免因药物扩散后对正常血管和组织的破坏，赋予其优异的生物可降解性和生物相容性，使得氨甲环酸脂肪醇酯凝胶这一硬化剂治疗药物具有极高的安全性。
[0023]
以上特征赋予本发明极高的新颖性和创造性，这些特征也是其作为硬化剂在治疗血管瘤、脉管畸形以及静脉曲张中与现有的硬化剂最大区别和优势。
附图说明
[0024]
图1 ta6核磁共振氢谱；
[0025]
图2 ta6核磁共振碳谱；
[0026]
图3 ta8核磁共振氢谱；
[0027]
图4 ta8核磁共振碳谱；
[0028]
图5 ta9核磁共振氢谱；
[0029]
图6 ta9核磁共振碳谱；
[0030]
图7不同浓度ta6、ta8和ta9凝胶的t
gel
；
[0031]
图8不同浓度ta8凝胶的体外溶蚀率曲线；
[0032]
图9不同浓度ta9凝胶的体外溶蚀率曲线；
[0033]
图10不同浓度ta9对huvec细胞毒性；
[0034]
图11不同浓度ta和壬醇对huvec细胞毒性；
[0035]
图12不同浓度ta9作用于huvec细胞ldh释放率；
[0036]
图13注射含cy7的生理盐水(ns)、8％ta9溶液(sol)和47.4％ta9凝胶(gel)后不同时间的小鼠体内荧光分布图；
[0037]
图14小鼠尾静脉注射生理盐水(ns)、8％ta9溶液(sol)及47.4％ta9凝胶(gel)后15min、1d、4d、8d、15d变化图；
[0038]
图15兔耳缘静脉注射生理盐水(ns)和47.4％ta9凝胶(gel)前、1d、4d、7d、12d、15d变化图及它们的局部放大图(partial)；
[0039]
图16兔耳缘静脉注射生理盐水(ns)和47.4％ta9凝胶(gel)30min、4d、7d的h&e染色图。
具体实施方式
[0040]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰，使本领域技术人员能够更好地理解本发明，以下结合附图与实施例对本发明的实施方式作进一步详细地阐述。
[0041]
实验材料
[0042]
试剂：
[0043]
氨甲环酸(武汉拉那白医药化工有限公司)
[0044]
正己醇(天津市大茂化学试剂厂)
[0045]
正辛醇(上海源叶生物科技有限公司)
[0046]
正壬醇(上海源叶生物科技有限公司)
[0047]
亚硫酰氯(山东西亚化学工业有限公司)
[0048]
甲基叔丁基醚(天津市大茂化学试剂厂)
[0049]
dmem培养基(美国corning公司)
[0050]
胰蛋白酶(美国sigma-aldrich公司)
[0051]
青霉素链霉素(美国gibco公司)
[0052]
cck-8(上海碧云天生物技术有限公司)
[0053]
4％多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司)
[0054]
he染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司)
[0055]
细胞及动物：
[0056]
人脐静脉内皮细胞(huvec)(美国atcc细胞库)
[0057]
家兔、km小鼠(辽宁长生生物科技有限公司)
[0058]
实验仪器：
[0059]
df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)
[0060]
re-52aa旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)
[0061]
dz-1bciv真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)
[0062]
bruker av-400核磁共振仪(德国bruker公司)
[0063]
质谱仪(美国thermo fisher公司)
[0064]
mco-18ac二氧化碳培养箱(日本panasonic公司)
[0065]
hr40-iia2超净工作台(青岛海尔股份有限公司)
[0066]
酶标仪(美国thermo fisher公司)
[0067]
in-vivo xtreme小动物活体成像系统(德国bruker公司)
[0068]
实施例1
[0069]
氨甲环酸脂肪醇酯的合成与表征
[0070]
将氨甲环酸(5g，31.84mmol)溶于二氯甲烷，在冰浴条件下滴加亚硫酰氯(3.23ml，44.58mmol)，升温至25℃反应12h。滴加相应的醇(正己醇(4.79ml，38.21mmol)、正辛醇(6.01ml，38.21mmol)、正壬醇(6.66ml，38.21mmol))，25℃继续反应24h，减压蒸馏除去二氯甲烷得白色固体，甲基叔丁基醚洗涤，真空干燥24h，分别得到以下三种产物。核磁共振谱图如图1-6所示。
[0071]
氨甲环酸正己醇酯(ta6)：1h nmr(600mhz,d2o)δ3.99(t,j＝6.7hz,2h),2.82(d,j＝7.1hz,2h),2.31-2.17(m,1h),1.92(d,j＝5.4hz,2h),1.84(d,j＝12.2hz,2h),1.67-1.60(m,1h),1.58-1.49(m,2h),1.37(qd,j＝13.0,3.2hz,2h),1.32-1.08(m,6h),1.01(qd,j＝13.0,3.3hz,2h),0.81(t,j＝6.8hz,3h).
13
c nmr(151mhz,meod)δ175.79,64.12,44.64,42.60,35.24,31.07,28.70,28.21,27.85,25.15,22.08.
[0072]
氨甲环酸正辛醇酯(ta8)：1h nmr(600mhz,d2o)δ3.98(t,j＝6.8hz,2h),2.81(d,j＝7.1hz,2h),2.22(dd,j＝9.6,6.2hz,1h),1.91(d,j＝12hz,2h),1.84(d,j＝11.2hz,2h),1.63(dd,j＝7.3,3.7hz,1h),1.54(dd,j＝14.1,6.9hz,2h),1.36(tt,j＝13.0,6.5hz,2h),1.29-1.10(m,10h),0.99(dt,j＝12.8,9.8hz,2h),0.80(t,j＝6.9hz,3h).
13
c nmr(151mhz,meod)δ175.79,64.11,44.64,42.60,35.24,31.45,28.83,28.79,28.70,28.23,27.85,25.52,22.20,12.93.
[0073]
氨甲环酸正壬醇酯(ta9)：1h nmr(600mhz,d2o)δ3.97(t,j＝7.0hz,2h),2.84(d,j＝7.0hz,2h),2.21(dd,j＝19.9,7.7hz,1h),1.90(t,j＝13.9hz,4h),1.75-1.61(m,1h),1.55(dd,j＝13.4,6.6hz,2h),1.47-1.32(m,2h),1.14-1.31(m,j＝18.1hz,12h),1.08-0.93(m,2h),0.81(t,j＝6.8hz,3h).
13
c nmr(151mhz,meod)δ175.80,64.12,44.64,42.60,35.24,31.45,28.83,28.79,28.71,28.23,27.85,25.52,22.20,12.93.
[0074]
实施例2
[0075]
氨甲环酸长链醇酯凝胶制剂的制备
[0076]
(1)室温下，分别称取1.3、1.4、1.5、1.6g氨甲环酸正己醇酯(ta6)置于1g注射用水
中，搅拌使全部溶解，静置，即得56.5％、58.3％、60.0％、61.5％(w/w)系列浓度ta6凝胶。
[0077]
(2)室温下，分别称取0.9、1.0、1.1、1.2g氨甲环酸正辛醇酯(ta8)置于1g注射用水中，搅拌使全部溶解，静置，即得47.4％、50.0％、52.4％、54.5％(w/w)系列浓度ta8凝胶。
[0078]
(3)室温下，分别称取0.7、0.8、0.9、1.0g氨甲环酸正壬醇酯(ta9)置于1g注射用水中，搅拌使全部溶解，静置，即得41.2％、44.4％、47.4％、50.0％(w/w)系列浓度ta9凝胶。
[0079]
实施例3
[0080]
氨甲环酸长链醇酯凝胶制剂性能试验
[0081]
(1)凝胶-溶胶转变温度测定(t
gel
)
[0082]
测定方法：临界胶凝温度采用落球法测定，分别取实施例2中制备的不同浓度的3种凝胶放置在10ml试管，将直径为0.28mm，0.096g的不锈钢球置于凝胶表面，并将试管置于油浴锅中，从室温开始升温，升温速率为1℃/min，测得不锈钢球落到试管底部的温度，即为不同浓度凝胶的t
gel
。
[0083]
测定结果和结论：如图7所示，凝胶t
gel
均大于37℃，完全达到人体内给药要求。t
gel
的变化表明三种凝胶热稳定性均受浓度及脂肪醇的碳链长度影响，浓度越大，碳链越长，温度破坏凝胶三维网状结构越困难。
[0084]
(2)体外溶蚀试验
[0085]
测定方法：分别取实施例2中制备的不同浓度的2种凝胶(ta8、ta9)，置于已知重量的直径为1.00cm的5ml试管中，精密称重后，将试管放入37
±
0.5℃的恒温振荡仪中，振荡速率为75r/min，并向试管中加入1ml预热至相同温度的生理盐水，于不同时间(2、4、6、8、10、15、20、30、45、60、75、90、120、150min)取出全部释放介质，滤纸擦干试管壁，精密称重。再补充相同体积释放介质，继续恒温振荡，直到剩余凝胶不足90％，平行3组。
[0086]
测定结果和结论：体外溶蚀实验模拟了凝胶进入血管后血液对凝胶的侵蚀，而且药物自递送载体给药，其溶蚀行为与释放行为一致，因此溶蚀率可代表药物释放率。在预实验中发现ta6即使在最高浓度所形成的凝胶，也在较短时间内溶蚀完全，说明其抵抗溶出介质侵蚀的能力较弱，进入血管后容易被血液快速破坏而快速释放药物。不同浓度ta8、ta9凝胶的溶蚀曲线分别如图8和图9所示，结果说明浓度越大，脂肪醇的碳链越长抵抗介质溶蚀能力越强，即药物释放越慢，这可以避免高浓度药物瞬间在血管内释放导致的副作用，延长凝胶与血管壁的接触时间使药物更好的发挥治疗作用。
[0087]
(3)通针性试验
[0088]
测定方法：分别取实施例2中制备的不同浓度的ta8和ta9凝胶，将其装入1ml注射器，凝胶可以顺利通过25g针头即为通针性好。
[0089]
表1不同浓度ta8和ta9通针性
[0090][0091]
测定结果和结论：测定的凝胶样品均具有良好的通针性，适合注射给药。
[0092]
实施例4
[0093]
1.体外细胞试验
[0094]
(1)细胞毒性试验
[0095]
测定方法：采用cck-8法测定ta9细胞毒性，人脐静脉内皮细胞(huvec)培养于完全培养基dmem中，其中含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素混合液，置于含5％co2，37℃细胞培养箱中培养。待细胞增殖至80％后取出，pbs洗涤2次，0.25％的胰蛋白酶进行消化，再加入2ml培养基使细胞脱落重悬。以每孔104个细胞接种到96孔细胞培养板中，使细胞贴壁生长12h。加入含有系列梯度浓度的ta9(或氨甲环酸、壬醇)培养基，继续培养24h。向每孔加入10μl cck-8溶液，继续在培养箱中孵育2h，用酶标仪于450nm处测定吸光度值，计算细胞活性(％)。以不含细胞的孔及不含药物的孔为空白组和对照组。
[0096]
测定结果和结论：如图10所示，本发明ta9导致的细胞毒性呈浓度依赖性，浓度为0.03μm/ml时细胞可基本存活，但是在0.09μm/ml的浓度下，细胞活性急剧降低，说明在达到一定浓度时ta9对细胞有显著的毒性。如图11所示，而其代谢产物氨甲环酸(ta)和壬醇(1-nonanol)在高于ta9产生细胞毒性浓度10倍下细胞存活率为95％以上，可以证明细胞毒性是由ta9诱导的而不是其代谢产物，也证明了ta9代谢后的安全性。
[0097]
(2)乳酸脱氢酶(ldh)释放实验
[0098]
测定方法：采用ldh释放法测定细胞膜完整性，人脐静脉内皮细胞(huvec)培养于完全培养基dmem中，其中含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素混合液，置于含5％co2，37℃细胞培养箱中培养。待细胞增殖至80％后取出，pbs洗涤2次，0.25％的胰蛋白酶进行消化，再加入2ml培养基使细胞脱落重悬。以每孔104个huvec细胞接种到96孔细胞培养板中培养，使细胞贴壁生长12h。吸去旧培养基，用ph7.4 pbs洗涤1次，分别加入含有系列梯度浓度的ta9培养基，继续培养24h，并根据乳酸脱氢酶测定试剂盒说明进行测定。用酶标仪在490nm处测定吸光度，计算ldh释放量(％)。以不含细胞的孔及不含药物的孔为空白组和最大酶释放组。
[0099]
测定结果和结论：如图12所示，本发明中ta9作用于huvec细胞后，ldh的释放随着浓度的增加而增加，在ta9浓度为30μg/ml条件下，ldh释放量急剧增加至71.94％，与细胞毒性结果一致，说明ta9会引发严重的细胞膜损伤。
[0100]
实施例5
[0101]
凝胶体内滞留性研究
[0102]
测定方法：通过小动物活体成像仪观察荧光物质cy7在小鼠体内的扩散和分布，分析ta9溶液及其凝胶在小鼠尾部的滞留情况，分别向km小鼠尾静脉注射含cy7的生理盐水(ns)、8％(w/w)ta9溶液(sol)和47.4％(w/w)ta9凝胶(gel)，于注射后5min、0.5h、1.5h、5h和24h记录小鼠体内荧光分布。
[0103]
测定结果和结论：如图13所示，含cy7的生理盐水在注射后0.5h可观察到荧光分布在小鼠整个尾部，因为生理盐水在尾部没有滞留性，随血液循环cy7浓度被稀释且分布于小鼠全身，5h左右生理盐水组尾部荧光几乎消失，24h后全部消失。而ta9溶液组和ta9凝胶组的荧光在24h内仍旧大部分聚集在小鼠尾部，说明荧光物质被滞留。溶液组的荧光滞留是由于8％ta9溶液在给药后药物能够在尾静脉快速扩散，并急剧破坏血管壁，造成了尾部血管血栓栓塞，因此将绝大部分cy7滞留在了尾部，间接说明8％ta9溶液也能发挥血栓诱导作用治疗静脉畸形。它们两组的差异在于5h内溶液组的荧光分布在了整条尾巴，而ta9凝胶组荧光仅出现在给药部位，说明凝胶不仅可以有效地发挥作用，在体内还具有更好的滞留性，实
现畸形血管的靶向给药，而且有效避免异位栓塞的风险。
[0104]
实施例6
[0105]
体内药效
[0106]
(1)小鼠尾静脉药效学评价
[0107]
测定方法：将15只km小鼠随机分为3组，a组为生理盐水组(ns)，b组为8％(w/w)ta9溶液组(sol)，c组为实施例2中制备的47.4％(w/w)ta9凝胶gel)。随机选择小鼠尾静脉，分别注射30μl生理盐水、8％(w/w)ta9溶液及47.4％(w/w)ta9凝胶，并于给药后15min、1d、4d、8d、15d记录小鼠尾静脉情况。
[0108]
测定结果和结论：由图14可观察到生理盐水注射后小鼠尾静脉无明显变化。8％(w/w)ta9溶液组注射后约15min，小鼠尾巴从注射部位到尾尖开始变黑，4天后尾尖坏死，原因是ta9溶液无法在给药部位滞留，且ta9溶液能够快速扩散，破坏血管壁，诱发尾部大面积血管血栓栓塞，致使尾尖坏死，表明8％(w/w)ta9溶液也能够发挥硬化治疗作用，但是可控性差，存在一定的异位栓塞风险。注射47.4％(w/w)ta9凝胶后约15min，在注射部位观察到明显的血栓形成，但在注射部位以外并没有观察到其他血栓和组织坏死的异常症状。与溶液组相比，充分证明了ta9凝胶具有更好的滞留性，避免了对远端血管的栓塞和周围组织的破坏。15天后，凝胶组注射部位的尾静脉成功闭锁，表明ta9凝胶作为硬化剂，可以有效用于治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张。
[0109]
(2)兔耳缘静脉药效学评价
[0110]
测定方法：将10只家兔随机分为2组，a组为生理盐水组(ns)，b组为实施例3中制备的47.4％(w/w)ta9凝胶(gel)。随机选择家兔左耳或右耳的耳缘静脉，分别注射50μl生理盐水及ta9凝胶，并于给药后1d、4d、7d、12d、15d记录家兔耳缘静脉情况。并分别于给药后30min、4d、7d处死一只家兔，取兔耳以4％多聚甲醛固定，石蜡切片，进行h&e染色观察组织学变化。
[0111]
图15是兔耳缘静脉注射生理盐水(ns)和47.4％ta9凝胶(gel)前、1d、4d、7d、12d、15d变化图及它们的局部放大图(partial)，可看出注射生理盐水后的耳缘静脉在观察时间内无明显变化。但注射凝胶的耳缘静脉30min内注射部位明显变黑引发局部血栓，1天后静脉血栓栓塞明显，血管周围组织有炎症发生。第4天开始，炎症缓慢消失，血栓栓塞面积逐渐减少，纤维化面积增大，被栓塞血管无血流通过，第15天被栓塞血管成条索状纤维。
[0112]
通过图16h&e染色可观察到生理盐水组无异常，未见血栓和其他异常病变。凝胶组在给药后30min可观察到混合血栓的形成，白色血栓紧贴血管壁并向内延伸，中心红细胞聚集成团并被纤维蛋白网网络形成红色血栓，栓塞整个血管。4天后血栓依旧存在，血管壁损伤明显，发生渗漏，周围纤维组织中可见大量红细胞和炎性细胞(图16，黑色方框)。7天后在血栓周围及内部出现内皮细胞和纤维母细胞，表明血管纤维组织的增生(图16，黑色箭头)。以上药效学实验证明了本发明对血管瘤、脉管畸形和静脉曲张硬化治疗的有效性。