鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性CAPS分子标记及其应用的制作方法

鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性caps分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子标记领域，具体涉及一种鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性caps分子标记及其应用。


背景技术：

2.雄性不育现象在自然界植物中普遍存在，植物雄性不育的形成原因多种多样，可以依据表型、遗传、来源等对其进行分类。在表型方面，依据花粉败育的时期可分为无花粉、单核败育、双核败育、三核败育等类型；依据败育花粉的形状、大小和染色反应可分为典败、圆败和染败等。在遗传方面，雄性不育可分为孢子体不育和配子体不育。依据育性表达能否发生显著变化可分为普通型雄性不育和可转换型雄性不育，其中，可转换型雄性不育又分为光温敏雄性不育和再生型雄性不育。根据不育基因、可育基因对应的显隐关系可分为隐性核不育和显性核不育，多数核不育属于隐性核不育，只有少数是显性核不育。根据雄性不育材料的基因型、育性基因的位置、遗传特征可分为细胞质不育型、细胞核不育型和质核互作不育型，即“三型学说”。有人认为，细胞质雄性不育实际上也是核质互作引起的，只是目前尚未找到恢复系，因此，将胞质雄性不育和核质基因互作产生的雄性不育统称为细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，cms)，这就是所谓的“二型学说”，即核不育型和核质互作不育型。
3.经实验验证发现，百日草可育和不育性状的分离符合孟德尔分离定律，属于隐性核不育，并且其不育的性状伴随有花瓣萼片化的性状发生。在目前鉴定百日草育性的分子标记主要分为两种，其一为随机引物扩增多态性dna(random amplifed polymorphic dna，rapd)，其二为简单序列重复标记(simple sequence repeat，ssr)。前者因对于引物的特异性、模板的质量和浓度、pcr循环次数要求高，而导致技术重复性差；后者虽多态性丰富但开发ssr标记需要大量引物，成本较高。在之前的研究中，所开发的标记皆以只区分百日草育性为目标，且所设标记与目的基因距离太远。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，根据百日草细胞核雄性不育的性状伴随有花瓣萼片化的性状出现的特性，利用百日草转录组学提供了一种鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性caps分子标记，该分子标记可以作为花瓣萼片化雄性不育双突变育种标记的辅助选择，为百日草品种育种提供新的分子标记。
5.为实现上述目的，本发明所设计一种鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性caps分子标记，所述共显性caps分子标记的核苷酸序列分别为如seq id no.1，其序列上的第71bp处为一个snp位点，该snp位点为a/c的碱基突变。
6.本发明还提供了一种用于获得上述分子标记的引物对，所述引物对为：
7.正向引物：5＇-tttccgccaccttgactgtt-3＇；
8.反向引物：5＇-gtggactcattcccattccca-3＇。
9.本发明还提供了一种上述共显性caps分子标记或上述引物对在鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状中的应用。
10.本发明还提供了一种鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，其中所述引物对为：
11.正向引物：5＇-tttccgccaccttgactgtt-3＇；
12.反向引物：5＇-gtggactcattcccattccca-3＇。
13.本发明还提供了一种上述试剂盒的鉴别方法，包括以下步骤：
14.1)提取待鉴别的百日草的基因组dna；
15.2)以待鉴别的百日草的基因组dna为模板，采用以下引物对：
16.正向引物：5＇-tttccgccaccttgactgtt-3＇；
17.反向引物：5＇-gtggactcattcccattccca-3＇。
18.进行pcr扩增，得到pcr产物，再用限制性核酸内切酶hhai酶切，得到酶切产物；
19.3)检测pcr酶切产物：
20.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，记录基因型，在紫外灯下拍照；
21.若电泳条带中含有154bp的条带时，该待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为纯合(平瓣可育纯合型aa由a a组成，为纯合可育，因两条dna链都不可以被酶切，故呈现为154bp的一条条带)；
22.或，若电泳条带中同时含有82bp和72bp的两条条带时，该待鉴别的百日草为花瓣萼片化雄性不育株，其为纯合(不育纯合型cc由c c组成，为纯合不育，因两条dna链都可以被酶切，故理论上呈现为72bp 82bp的两条条带，但是这两条条带距离很近，在实际电泳过程中距离不明显，近似重合)；
23.或，若电泳条带中同时含有154bp、82bp和72bp的三条条带时，该待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为杂合(杂合型ac由a c组成，为杂合可育，因只有一条c链可以被酶切，另一条a链不可以被酶切，故理论上应该呈现出154 72 82的三条条带)。
24.作为优选方案，所述步骤2)中，pcr扩增的反应体系：
25.百日草基因组dna2μlpcrmix25μl正向引物2μl反向引物2μl加入ddh20至50μl
26.pcr扩增的反应为：94℃预变性10min后，循环30次94℃变性30s、57℃退火、72℃延伸5min；
27.酶切反应体系：
28.pcr reaction mixture10μlddh2o18μl10x buffer2μlhhai1μl
29.caps酶切反应为：37℃恒温培养箱放置6h。
30.本发明原理
31.本发明的共显性caps分子标记中包含三个snp位点，分别位于该seq id no.1中第46bp处(c/g)、第48bp处(a/g)和第71bp处(c/a)；其中，该第71bp处位点为a/c的碱基突变，由平瓣可育的—acgg—突变为花瓣萼片化雄性不育的—ccgg—，从而导致hhai(c
↓
cgg)酶切多态性，又因在此snp位点附近没有其他的hhai酶切位点，故在此snp位点附近设计引物，从而鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状。
32.上述共显性caps分子标记的制备方法，包括以下步骤：
33.1)利用构建完成的百日草花瓣萼片化雄性不育双突变和平瓣可育兄妹交分离群体，挑选兄妹交分离群体中多株的平瓣可育株和多株的花瓣萼片化雄性不育株(为消除株高分离的影响)且多株样本中包括高株和超矮株(尽可能的确保对应的可育株和不育株长势相同)，每个单株透色期采集等量未开放小花数枚混合，来构建百日草花瓣萼片化雄性不育极端性状混合池和平瓣可育极端性状混合池，进行深度约为20x的转录组混池测序；
34.2)根据百日草花瓣萼片化雄性不育极端性状混合池和平瓣可育极端性状混合池极端性状池中snp的差异，将其中131个snp标记开发成caps标记，并验证其多态性，通过对交换单株的筛选不断缩小定位区间，在此基础上继续开发snp标记，直至缩小至单侧只有1株交换单株；
35.3)运用本地blast将百日草多态性分子标记比对到向日葵16号染色体，最终将百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育基因定位于向日葵16号染色体上10485288和10869078之间约0.38mb的区域内，距离目的基因最近的标记在71bp的位置发生a
→
c的突变，且其在花瓣萼片化不育株和平瓣可育株材料中差异明显，此结果为基于转录组测序数据预测的不育/可育连锁snp标记。
36.4)根据以上序列信息，设计实验验证，将snp标记开发为鉴别百日草花瓣萼片化雄性不育和平瓣可育性状的共显性caps分子标记，通过酶切检测条带，从而判断各个材料的基因型。
37.本发明的有益效果：
38.本发明首先利用bsa-seq技术将百日草花瓣萼片化基因和雄性不育基因定位于近缘物种向日葵16号染色体上的10485288至10869078区域内，将单侧标记的snp位点开发成caps标记，进而利用该caps标记对百日草花瓣萼片化雄性不育株和平瓣可育株进行鉴定。本发明中提及的caps标记与目的基因的距离更近，与雄性不育基因和花瓣萼片化基因连锁度更高。
附图说明
39.图1为百日草平瓣可育株和花瓣萼片化雄性不育株照片，
40.图中，a为百日草平瓣可育株，b为花瓣萼片化雄性不育株
41.图2为标记酶切结果胶图，
42.aa/cc/ac代表基因型为aa的纯合平瓣可育株/基因型为cc的花瓣萼片化雄性不育株/基因型为ac的杂合平瓣可育株酶切标记条带；
43.图3为120株百日草花瓣萼片化雄性不育分离群体的酶切结果胶图；
44.图中，1-120为单株编号，
45.1，4，5，7，11，16，17，22，23，25，28，31，32，35，40，41，43，46，48，49，55，58，60，63，64，72，73，74，75，76，77，82，85，89，91，92，95，98，101，107，109，118，120为平瓣杂合可育株；
46.2，3，6，8，9，10，12，13，14，15，18，19，20，21，24，26，27，29，30，33，34，36，37，38，39，42，44，45，47，50，51，52，53，54，56，57，59，61，62，65，66，67，68，69，70，71，78，79，80，81，83，84，86，87，88，90，93，94，96，97，99，100，102，103，104，105，106，108，110，111，112，113，114，115，116，117，119为花瓣萼片化雄性不育株。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
48.实施例1百日草花瓣萼片化雄性不育系分离群体的育性鉴定
49.1)选取6个百日草样品(4个百日草平瓣可育株和2个花瓣萼片化雄性不育株)，采用改良的ctab法提取6个待鉴别的百日草的基因组dna；
50.2)以待鉴别的百日草的基因组dna为模板，采用以下引物对：
51.正向引物：5＇-tttccgccaccttgactgtt-3＇；
52.反向引物：5＇-gtggactcattcccattccca-3＇。
53.进行pcr扩增，得到pcr产物，其中，pcr扩增的反应体系：
54.百日草基因组dna2μlpcr mix25μl正向引物2μl反向引物2μl加入ddh2o至50μl
55.pcr扩增的反应为：94℃预变性10min后，循环30次94℃变性30s、57℃退火、72℃延伸5min；
56.经pcr产物测序结果：以百日草纯合平瓣雄性可育株为dna模板的pcr产物序列为seq id no.3：
57.tttccgccaccttgactgttggaatcatggacgaagccagaaagggggttagtgtaattggtagaagaacgacggtttgaattgtggttgccgtctttggtagaagatgaggatgattcttctccaagatacttgggaatgggaatgagtccac；
58.以百日草花瓣萼片化雄性不育株为dna模板的pcr产物序列为seq id no.2：tttccgccaccttgactgttggaatcatggacgaagccagaaaggcgattagtgtaattggtagaagaacgccggtttgaattgtggttgccgtctttggtagaagatgaggatgattcttctccaagatacttgggaatgggaatgagtccac；
59.以百日草杂合平瓣雄性可育株为dna模板的pcr产物序列为seq id no.1：tttccgccaccttgactgttggaatcatggacgaagccagaaaggs(c/g)gr(a/g)ttagtgtaattggtagaagaacg m(c/a)cggtttgaattgtggttgccgtctttggtagaagatgaggatgattcttctccaagatacttgggaatgggaatgagtccac
60.3)caps酶切反应得到酶切产物，其中酶切体系：
61.pcr reaction mixture10μlddh2o18μl
10x buffer2μlhhai1μl
62.caps酶切反应为：37℃恒温培养箱放置6h。
63.4)检测pcr酶切产物：
64.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，记录基因型，在紫外灯下拍照；
65.如图1～2所示：电泳条带中含有154bp的条带时，两个待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为纯合；
66.电泳条带中同时含有82bp和72bp的两条条带时，两个待鉴别的百日草为花瓣萼片化雄性不育株，其为纯合；
67.电泳条带中同时含有154bp、82bp和72bp的三条条带时，两个待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为杂合。
68.实施例2 120株百日草花瓣萼片化雄性不育分离群体兄妹交后代的育性鉴定
69.1)制备120株百日草花瓣萼片化雄性不育分离群体兄妹交分离后代的基因组dna
70.采用改良的ctab法提取100个待检测百日草的基因组dna；
71.2)以待鉴别的百日草的基因组dna为模板，采用以下引物对：
72.正向引物：5＇-tttccgccaccttgactgtt-3＇；
73.反向引物：5＇-gtggactcattcccattccca-3＇。
74.进行pcr扩增，得到pcr产物，其中，pcr扩增的反应体系：
75.百日草基因组dna2μlpcr mix25μl正向引物2μl反向引物2μl加入ddh20至50μl
76.pcr扩增的反应为：94℃预变性10min后，循环30次94℃变性30s、57℃退火、72℃延伸5min；
77.3)caps酶切反应得到酶切产物，其中酶切体系：
78.pcr reaction mixture10μlddh2o18μl10x buffer2μlhhai1μl
79.caps酶切反应为：37℃恒温培养箱放置6h。
80.4)检测pcr酶切产物：
81.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，记录基因型，在紫外灯下拍照；
82.如图3所示：电泳条带中含有154bp的条带时，该待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为纯化；1，4，5，7，11，16，17，22，23，25，28，31，32，35，40，41，43，46，48，49，55，58，60，63，64，72，73，74，75，76，77，82，85，89，91，92，95，98，100，101，107，109，118，120电泳条带中同时含有82bp和72bp的两条条带时，对应的待鉴别的百日草为花瓣萼片化雄性不育株，其为纯化；
83.2，3，6，8，9，10，12，13，14，15，18，19，20，21，24，26，27，29，30，33，34，36，37，38，
39，42，44，45，47，50，51，52，53，54，56，57，59，61，62，65，66，67，68，69，70，71，78，79，80，81，83，84，86，87，88，90，93，94，96，97，99，102，103，104，105，106，108，110，111，112，113，114，115，116，117，119电泳条带中同时含有154bp、82bp和72bp的三条条带时，对应的待鉴别的百日草为平瓣可育株，其为杂合。
84.其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。