纳米纤维支架的制备方法、采用该纳米纤维支架与黑素细胞构建组织工程材料的方法与流程

1.本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种纳米纤维支架、纳米纤维支架与黑素细胞构建组织工程材料的方法及构建的组织工程材料在治疗白癜风方面的应用。


背景技术：

2.白癜风是一种常见多发的色素脱失性皮肤病。临床表现主要为局限性或泛发性白色斑片，边界清楚，无自觉症状，白癜风全球发病率为0.1-4％。目前，白癜风发病机制尚不明确，一般认为是某种原因所导致的黑素细胞功能性缺失，主要的病理学说有遗传学说、自身免疫说、氧化应激学说、神经精神学说、病毒学说、黑素细胞自毁学说等。
3.白癜风很少直接危害患者生理健康或造成致命威胁，但大量研究发现，白癜风可能伴生其他免疫疾病，包括甲状腺疾病、糖尿病、恶性贫血、银屑病等，同时与黑色素瘤、听力下降有关。
4.目前治疗方法包括药物疗法、光化学疗法、光疗法和外科疗法。其中，黑素细胞移植是目前治疗稳定期白癜风的有效方法，代表着白癜风移植疗法的发展方向。其中最常用的是细胞悬液移植，但大量的临床结果表明，该方法存在两个主要问题：1)细胞悬液具有流动性，细胞在某些运动部位难以附着；2)细胞悬液移植后，生长环境发生改变，从而细胞活性受到损伤。为此，可通过引入组织工程技术，开发黑素细胞载体，在载体上培养黑素细胞并整体移植到病灶区，从而能有效地改善上述存在的问题，为提高黑素细胞移植疗效提供可能。
5.申请公布号cn 103861147a公开了“一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法”，并进一步公开了通过将一种或两种生物相容性材料溶于溶剂中进行静电纺丝制备纳米纤维支架，在该纳米纤维支架中进行黑素细胞培养，所述的生物相容性材料选自壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇、聚乙烯醇。
6.上述方法中的纳米纤维膜与传统致密膜相比，具有高的比表面积和孔隙率，能更好地模仿人体细胞外基质，促进细胞培养液和黑素细胞代谢产物的更新，但是对于黑素细胞的老化问题仍然没有大的改善。


技术实现要素：

7.为了解决目前基于纳米纤维支架培养黑素细胞时存在黑素细胞老化严重的问题，本发明的目的是提供一种纳米纤维支架，采用该纳米纤维支架与黑素细胞构建组织工程材料，本发明的纳米纤维支架由于采用静电纺丝工艺，具有高的比表面积和孔隙率，类似于细胞外基质的结构，能更好地支持黑素细胞的贴附、生长和增殖，同时纳米纤维支架中碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的加入，促进了黑素细胞树突生长，抑制了黑素细胞的老化问题，采用纳米纤维支架与黑素细胞构建的组织工程材料能够快速、简便、廉价、高效、批量及规模化生产黑素细胞。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一方面，提供一种纳米纤维支架的制备方法，包括如下步骤：
10.s1，将壳聚糖和碱性成纤维细胞生长因子溶于溶剂中，获得纺丝溶液；
11.s2，采用上述的纺丝溶液进行静电纺丝，获得纳米纤维膜；
12.s3，用交联剂将纳米纤维膜进行交联处理，获得纳米纤维支架。
13.其中，所述s1中壳聚糖的质量浓度为2-8％。
14.其中，所述s1中碱性成纤维细胞生长因子与壳聚糖的质量比为1:50-1:100。
15.其中，所述s1中的溶剂为质量浓度为80-90％的乙酸。
16.其中，所述s2中静电纺丝的注射器规格为5ml，针头内径为0.4-0.7mm，接收屏采用铝箔接地接收，针头与接收屏的距离为10-20cm，纺丝电压为10-30kv，静电纺丝过程中喷出流速为0.2-1ml/h。
17.其中，所述s3中的交联剂为戊二醛，所述戊二醛的质量浓度为10-30％，体积为8-20ml，交联时间为3-25h。
18.本发明的第二方面，提供采用上述制备方法制备的纳米纤维支架。
19.本发明的第三方面，提供采用纳米纤维支架与黑素细胞构建组织工程材料的方法，包括如下步骤：
20.s1，将纳米纤维支架进行碱处理；
21.s2，将碱处理后的纳米纤维支架进行消毒灭菌；
22.s3，将消毒处理后的纳米纤维支架置入细胞培养板，加入细胞培养液，放入细胞培养箱中进行孵化；
23.s4，弃去孵化用的细胞培养液，将黑素细胞以2
×
103个/cm
2-10
×
103个/cm2的细胞密度接种到孵化过的纳米纤维支架上，同时加入细胞培养液，放入细胞培养箱中进行培养，每两天更换一次细胞培养液，培养1-10天，即获得组织工程材料。
24.本发明的第四方面，提供采用上述方法获得的组织工程材料。
25.本发明的第五方面，提供上述的组织工程材料在制备治疗白癜风试剂方面的应用。
26.与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明采用纳米纤维支架与黑素细胞构建的组织工程材料能够快速、简便、廉价、高效、批量及规模化生产黑素细胞。
附图说明
27.以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
28.图1为黑素细胞在对照组和纳米纤维支架上分别培养1、3和5d后的mts吸光度值比较；
29.图2为黑素细胞在对照组和纳米纤维支架上分别培养1、3和5d后单个细胞黑素含量值比较；
30.图3为不同条件下黑素细胞的增殖情况。
具体实施方式
31.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明
书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
32.实施例1纳米纤维支架的制备
33.1、bfgf溶液的配制：配制质量浓度为0.5％的bfgf溶液20ml，溶剂为质量浓度80％-90％的乙酸，搅拌均匀，待用；
34.2、纺丝液的配制：向上述溶液中加入1.2g壳聚糖，使壳聚糖的质量分数为6％，其中碱性成纤维细胞生长因子与壳聚糖的质量比为1：12，搅拌3小时，至壳聚糖完全溶胀；然后在室温下搅拌12小时至完全溶解，得到聚合物溶液呈透明状；
35.3、用5ml注射器(针头内径为0.4-0.7mm)抽取上述纺丝液，固定在静电纺丝装置上，固定静电压为12kv，接收距离为12cm，喷射流速为0.6ml/h，进行静电纺丝，得到壳聚糖/bfgf纳米纤维膜；
36.4、在干燥器底部放入盛有10ml 25％戊二醛溶液的培养皿，将壳聚糖/bfgf纳米纤维膜放入干燥器中，25℃下进行交联，交联10h后取出，置于60℃烘箱中加热5h，进一步交联，同时去除残留的交联剂，获得纳米纤维支架。
37.实施例2纳米纤维支架的制备
38.1、bfgf溶液的配制：配制质量浓度为0.5％的bfgf溶液20ml，溶剂为质量浓度80％-90％的乙酸，搅拌均匀，待用；
39.2、纺丝液的配制：向上述溶液中加入1.5g壳聚糖，使壳聚糖的质量分数为7.5％，其中碱性成纤维细胞生长因子与壳聚糖的质量比为1：15，搅拌3小时，至壳聚糖完全溶胀；然后在室温下搅拌12小时至完全溶解，得到聚合物溶液呈透明状；
40.3、用5ml注射器(针头内径为0.4-0.7mm)抽取上述纺丝液，固定在静电纺丝装置上，固定静电压为12kv，接收距离为12cm，喷射流速为0.6ml/h，进行静电纺丝，得到壳聚糖/bfgf纳米纤维膜；
41.4、在干燥器底部放入盛有10ml 25％戊二醛溶液的培养皿，将壳聚糖/bfgf纳米纤维膜放入干燥器中，25℃下进行交联，交联10h后取出，置于60℃烘箱中加热5h，进一步交联，同时去除残留的交联剂，获得纳米纤维支架。
42.实施例3纳米纤维支架的制备
43.1、bfgf溶液的配制：配制质量浓度为0.5％的bfgf溶液20ml，溶剂为质量浓度80％-90％的乙酸，搅拌均匀，待用；
44.2、纺丝液的配制：向上述溶液中加入1.0g壳聚糖，使壳聚糖的质量分数为5％，其中碱性成纤维细胞生长因子与壳聚糖的质量比为1：10，搅拌3小时，至壳聚糖完全溶胀；然后在室温下搅拌12小时至完全溶解，得到聚合物溶液呈透明状；
45.3、用5ml注射器(针头内径为0.4-0.7mm)抽取上述纺丝液，固定在静电纺丝装置上，固定静电压为12kv，接收距离为12cm，喷射流速为0.6ml/h，进行静电纺丝，得到壳聚糖/bfgf纳米纤维膜；
46.4、在干燥器底部放入盛有10ml 25％戊二醛溶液的培养皿，将壳聚糖/bfgf纳米纤维膜放入干燥器中，25℃下进行交联，交联10h后取出，置于60℃烘箱中加热5h，进一步交联，同时去除残留的交联剂，获得纳米纤维支架。
47.实施例4组织工程材料的制备
48.1、纳米纤维支架的处理：将纳米纤维支架用1mol/l碳酸钠溶液浸泡30分钟，之后
用pbs多次浸泡冲洗去除残留碳酸钠；再用75％酒精浸泡12h，并用pbs冲洗干净，随后用紫外灯照射12h消毒；最后将纳米纤维支架置于12孔板中，每孔注入细胞培养液1ml，置于37℃、5vol％co2细胞培养箱中孵化2h；其中，细胞培养液为市售培养液，包括胎牛血清、霍乱毒素、异丁酰甲基黄嘌呤、谷氨酰胺和庆大霉素。
49.2、取健康的人体包皮组织，通过消化、分离、纯化提取人体黑素细胞；将黑素细胞加入细胞培养液中，在37℃、5vol％co2细胞培养箱中进行培养，每2天更换一次培养液，当观察到培养中的黑素细胞接近80％融合时进行传代培养；弃去孵化用的细胞培养液，将8
×
103个/cm2的黑素细胞接种到纳米纤维支架上，轻晃细胞培养板以保证细胞均匀分布；把细胞培养板置于37℃、5vol％co2细胞培养箱中进行培养，每2天更换一次细胞培养液，获得组织工程材料。
50.实施例5 mts法检测黑素细胞数量
51.mts法检测原理：活细胞线粒体中脱氢酶能使mts(中文名称：2-对磺酸基苯基-3-(4,5二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐)还原为水溶性的甲瓒盐，甲瓒盐可直接溶于培养基中，在一定细胞数量范围内，甲瓒盐与细胞数成正比，用酶联免疫检测仪(酶标仪)在490nm波长处测定甲瓒盐的吸光度，可间接反映活细胞数量。
52.采用mts法测定时，首先要除去原有细胞培养液和漂浮的死细胞。
53.测定方法：在细胞培养板中每孔加入1ml含10％(质量浓度)mts的细胞培养液，置于细胞培养箱内于37℃、5vol％co2条件下孵化3h，取100μl含黑素细胞的溶液置于96孔细胞培养板中，用酶标仪测定该溶液在490nm波长下的吸光度。
54.以不加纳米纤维支架的细胞培养板、加入细胞培养液作为对照，采用相同的方法培养黑素细胞，比较黑素细胞在对照组和纳米纤维支架上的增殖情况，以mts法进行表征，结果如图1。如图1所示，黑素细胞在对照组和纳米纤维支架上培养3d至5d时，mts值大幅度增加而培养1d至3d时，只是小幅度上升，说明黑素细胞在培养3d时的增殖速率最快、活性最高，黑素细胞适合在培养3d后进行移植。另外，在各个时间段内，黑素细胞在纳米纤维支架上的数量均多于对照组，说明纳米纤维支架更有利于黑素细胞的增殖。
55.实施例6单个细胞中黑素含量测定
56.测定方法：除去原细胞培养液，加入0.25％胰酶，使黑素细胞从纳米纤维支架上脱离，加入细胞培养液终止消化；将含有黑素细胞的溶液转移到离心管中充分打匀，取少量用血小板计数器统计细胞密度，结合溶液体积计算得到黑素细胞的数量。所得溶液在1000rpm条件下离心5min，弃去上清液，加入1ml的1mol/lnaoh溶液，旋涡仪振荡使细胞充分裂解，用酶标仪测得475nm处溶液吸光度，吸光度与黑素细胞的黑素含量存在如下关系：
57.m(ng)＝a
λ/n×
10-3
×
156.25
58.式中:m为单个黑素细胞黑素含量,a
λ
为吸光度值,n为1ml悬液中黑素细胞个数。
59.以不加纳米纤维支架的细胞培养板、加入细胞培养液作为对照，采用相同的方法培养黑素细胞，比较黑素细胞在对照组和纳米纤维支架上培养相同时间后，单个细胞中黑素含量。
60.黑素细胞在纳米纤维支架和对照组中分别培养1、3和5d后，单个黑素细胞的黑素含量如图2所示。从图2中可以看出，在纳米纤维支架上培养的黑素细胞，其黑素含量始终低于对照组，这表明纳米纤维支架上黑素细胞的老化程度低于对照组上的黑素细胞。
61.实施例7
62.以不加纳米纤维支架作为对照组，以壳聚糖构建纳米纤维支架、向细胞培养液中加入bfgf、实施例3中制备的纳米纤维支架这四种方式分别进行黑素细胞培养，比较黑素细胞在不同条件下的增殖情况，以mts法进行表征，结果如图3。从图3中可以看出，以实施例3制备的纳米纤维支架进行黑素细胞培养，其黑素细胞数量明显高于另外三种方式。
63.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。