动物双歧杆菌乳亚种BLa80在制备调节肠道动力的药物或食物中的应用的制作方法

动物双歧杆菌乳亚种bla80在制备调节肠道动力的药物或食物中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及动物双歧杆菌乳亚种bla80在制备调节肠道动力的药物或食物中的应用。


背景技术：

2.便秘作为一种常见的慢性胃肠疾病，通常表现为排便次数减少和排便困难，已成为影响现代人生活质量的重要因素之一。便秘可分为器质性便秘和功能性便秘，功能性便秘是指缺乏器质性病因，没有结构异常或代谢障碍，又除外肠易激综合征的慢性便秘，主要原因在于肠功能紊乱。日常生活中，造成便秘的因素很多，如年龄、生活习惯、心里状况或肠道病变等因素。有研究显示，成人慢性便秘患病率为4-6％，老年人群中便秘的发病率可达到15-20％，并且有逐年增长的趋势。
3.目前，治疗便秘药物种类有容积性泻剂、渗透性泻剂及刺激性泻剂，这些药物能够有效缓解便秘。cn105435231a公开了一种治疗便秘的组合物，所述组合物含有低聚糖类双歧因子和渗透性泻剂，相对1重量份的低聚糖类双歧因子，所述渗透性泻剂的含量为0.5-10重量份。所述组合物相对单一的低聚木糖或渗透性泻剂能够取得明显增强治疗便秘的效果。但渗透性泻剂不适合长期服用，容易引起不良反应。
4.cn108030847a公开了一种外用治疗便秘的药物组合物，所述药物组合物包括：杏仁油、蜂蜜、火麻仁油、胡麻油、槟榔油和龙眼肉汁。所述药物组合物无毒副作用，对于便秘具有良好的疗效，可显著改善便秘患者腹部胀满及便秘等症状，适于长期使用，是一种安全有效治疗便秘的药物，具有良好的应用前景。但所述药物组合物包括的原料种类较多，经济成本较高。
5.cn109965280a公开了一种调节儿童和青少年便秘的肠道微生态制剂，所述肠道微生态制剂包括：山楂、橘皮、麦芽、叶黄素、决明子、菊粉、葛根、姜黄和益生菌；所述益生菌的活菌数为10
8-10
10
cfu/g。所述肠道微生态制剂通过控制益生菌的质量分数和活菌数，能够有效提高儿童和青少年便秘的肠道微生态制剂的调节效果。
6.基于以上研究，可以看到，益生菌作为微生物，具有增强免疫、调节肠道的作用，与传统的泻剂相比，副作用较小，且缓解便秘的效果较为明显。因此进一步寻找可缓解便秘的菌株是目前研究的热点与重点。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和现实实际的需求，本发明的目的在于提供动物双歧杆菌乳亚种bla80在制备调节肠道动力的药物或食物中的应用。所述动物双歧杆菌乳亚种bla80具有调节肠道的作用，促进肠道内酸性细菌的生长，增加肠道内有益菌的含量，能够用于制备调节肠道动力的药物或食物。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供动物双歧杆菌乳亚种bla80在制备调节肠道动力的药物或食物中的应用。
10.本发明涉及的动物双歧杆菌乳亚种bla80能够显著提升个体内短链脂肪酸的含量水平，所述短链脂肪酸能刺激肠壁蠕动，增加肠道蠕动收缩频率，提高肠内渗透压，促进水分吸收，所述短链脂肪酸还能降低肠道内的ph值，进一步促进肠道内酸性细菌如乳杆菌或双歧杆菌的生长，进一步增加肠道内有益菌的含量。同时，动物双歧杆菌乳亚种bla80可以促进个体小肠动力的恢复，提高小肠推进率。所述动物双歧杆菌乳亚种bla80能够制备调节肠道动力的药物或食物，从而保证个体的肠道动力维持在正常水平，可以有效缓解便秘。
11.第二方面，本发明提供一种调节肠道动力的药物，所述调节肠道动力的药物包括单一菌剂动物双歧杆菌乳亚种bla80菌剂。
12.所述动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)bla80保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为 2018年3月5日，保藏编号为cgmcc no.15410，地址为：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号。
13.本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌剂为单纯的动物双歧杆菌乳亚种bla80或动物双歧杆菌乳亚种bla80与保护剂的组合物。
14.优选地，所述保护剂包括乳化剂、多糖和甘油。
15.优选地，所述乳化剂包括脱脂乳。
16.优选地，所述多糖包括海藻糖和/或蔗糖。
17.本发明中，所述调节肠道动力的药物的剂型包括栓剂、粉剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、乳剂、灌肠剂、凝胶剂或片剂中的任意一种。
18.本发明中，所述调节肠道动力的药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是载体和稀释剂的组合或稀释剂和赋形剂的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
19.本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌剂的活菌数为1
×
109cfu/ml， cfu为菌落形成单位(colony forming units)。
20.第三方面，本发明提供一种调节肠道动力的食物，所述调节肠道动力的食物包括单一菌剂动物双歧杆菌乳亚种bla80菌剂。
21.所述动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)bla80保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为 2018年3月5日，保藏编号为cgmcc no.15410，地址为：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号。
22.本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌剂为单纯的动物双歧杆菌乳亚种bla80或动物双歧杆菌乳亚种bla80与保护剂的组合物。
23.优选地，所述保护剂包括乳化剂、多糖和甘油。
24.优选地，所述乳化剂包括脱脂乳。
25.优选地，所述多糖包括海藻糖和/或蔗糖。
26.本发明中，所述调节肠道动力的食物包括固体饮料、发酵乳或发酵果蔬中的任意一种。
27.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
28.本发明采用动物双歧杆菌乳亚种bla80制备调节肠道动力的药物或食物，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80能够显著提升个体内短链脂肪酸的含量水平，从而刺激肠壁蠕动，增加肠道蠕动收缩频率，提高肠内渗透压，促进水分吸收，降低肠道内的ph值，促进肠道内酸性细菌如乳杆菌或双歧杆菌的生长，进一步增加肠道内有益菌的含量。同时，动物双歧杆菌乳亚种bla80可以促进个体小肠动力的恢复，提高小肠推进率。
附图说明
29.图1为本发明涉及的不同组别小鼠首例排黑便时间的结果图；
30.其中a，b之间统计值p《0.01，a，c之间统计值p《0.01，b，c之间统计值 p《0.05，p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著；
31.图2为本发明涉及的不同组别小鼠粪便含水量的结果图；
32.其中，a，b之间统计值p《0.01，p《0.01表示差异极显著；
33.图3为本发明涉及的不同组别小鼠粪便总短链脂肪酸含量的结果图；
34.其中a，b之间统计值p《0.01，a，c之间统计值p《0.01，a，d之间统计值 p《0.01，b，c之间统计值p《0.01，b，d之间统计值p《0.01，c，d之间统计值 p《0.01，p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著；
35.图4为本发明涉及的不同组别小鼠肠道推进率的结果图；
36.其中，a，b之间统计值p《0.01，a，c之间统计值p《0.01，b，c之间统计值 p《0.05，p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著。
具体实施方式
37.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
38.下述实施例中相应材料和原料的来源如下：
39.其中，spf级balb/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；阿拉伯树胶 购自国药集团化学试剂公司；复方地芬诺酯购自江苏华阳制药有限公司(国药 准字号h32020933)；动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp. lactis)bla80为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (cgmcc)，保藏时间为2018年3月5日，保藏编号为cgmcc no.15410的 菌种。其余材料和原料，无特殊说明，均可从商业途径获得。
40.制备例1
41.本制备例提供一种动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液，其制备方法如下：
42.挑取平板复壮的动物双歧杆菌乳亚种bla80单菌落接种于10ml tpy液体培养基，37℃厌氧培养12h，活化后的菌液以2％的接种量接种于100ml tpy 液体培养基中，37℃厌氧培养12h，4℃下5000g离心10min，取离心后的菌体沉淀，用无菌pbs缓冲溶液重悬，调整菌悬液浓度为109cfu/ml，得到所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液，4℃保存备用。
43.实施例1
44.本实施例探究不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80对小鼠首粒排黑便时间的影
响。选择50只健康spf级balb/c小鼠，体重18-20g，饲养于符合动物试验规程的动物房：维持室温25℃，相对湿度55％，12h光照，12h黑暗，自由进食和饮水，所有小鼠进行7天适应性饲养观察无异常后，按如下方式处理：
45.(1)进行分组，分为5组：空白组、模型组、低剂量动物双歧杆菌乳亚种 bla80干预组、中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组和高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组，每组各10只，其中空白组灌胃无菌pbs缓冲溶液，模型组灌胃无菌pbs缓冲溶液，低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠灌胃1
×
107cfu的动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液，中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠灌胃1
×
108cfu的动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液，高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠灌胃1
×
109cfu的动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液，每日9点各灌胃一次，连续灌胃14天。
46.(2)建立便秘小鼠模型，构建方法为：每千克体重小鼠灌胃10mg复方地芬诺酯，诱导小鼠便秘，并以构建的便秘小鼠模型为基础，探究不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80对小鼠首粒排黑便时间的影响。具体实验方法如下：
47.配制墨汁：称取100g阿拉伯树胶，加水800ml，煮沸至溶液透明，称取 50g活性炭加到上述溶液中煮沸3次，冷却，加水定容到1000ml，于冰箱中4℃保存，用前摇匀；
48.实验：在灌胃14天后，各组小鼠禁食不禁水过夜。第15天空白组灌胃0.9％的nacl溶液，模型组、低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组分别灌胃给予复方地芬诺酯(每千克体重小鼠灌胃10mg复方地芬诺酯)，给予复方地芬诺酯0.5h后，空白组和模型组小鼠灌胃墨汁0.1ml/kg，低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠以含有动物双歧杆菌乳亚种bla80 1
×
108cfu、1
×
109cfu和1
×
10
10
cfu的量灌胃墨汁0.1ml/kg。从灌胃墨汁开始，记录每只小鼠首次排黑便时间并作统计分析。
49.结果如图1所示，与模型组相比，灌胃不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种 bla80干预组均缩短了小鼠首粒排黑便时间。统计学分析表明，空白组与模型组的小鼠首例排黑便时间存在极显著差异(p《0.01)，空白组与低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠首例排黑便时间存在显著差异(p《0.05)，空白组与中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠首例排黑便时间差异并不显著。模型组与低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠首例排黑便时间存在显著性差异(p《0.05)，与中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80 干预组的小鼠首例排黑便时间存在极显著差异(p《0.01)。对于不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组而言，低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组同中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠首例排黑便时间差异极为显著(p《0.01)，中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠首例排黑便时间差异不明显，这表明动物双歧杆菌乳亚种bla80在缩减小鼠的首粒排黑便时间上存在剂量效应。
50.实施例2
51.本实施例参考实施例1构建的小鼠模型，探究不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80对小鼠粪便水分含量的影响。具体方法如下：
52.采用实施例1得到的小鼠，在第16-20天，空白组灌胃0.9％的nacl溶液，模型组灌胃复方地芬诺酯(每千克体重小鼠灌胃10mg复方地芬诺酯)，低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠分别灌胃含有复方地芬诺酯的1
×
108cfu、1
×
109cfu和1×
10
10
cfu的动物双歧杆菌乳亚种 bla80菌悬液，在第19天灌胃后，将单只小鼠放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称量湿重后，平均分成两份，一份干燥后记录干重，按下式计算粪便的水含量：
53.粪便中水分含量＝(粪便湿重－粪便干重)/粪便湿重
×
100％。
54.结果如图2所示，与空白组相比，模型组中小鼠粪便水分含量降低的数值较大，灌胃不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中小鼠粪便水分含量均有所提升。结合统计学分析，空白组与模型组之间存在极显著差异(p《0.01)，空白组与低、中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组存在极显著差异 (p《0.01)，空白组与中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间无明显差异。模型组与低、中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组无明显差异，与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在极显著差异(p《0.01)。对于不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组而言，低、中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在极显著差异(p《0.01)，高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中小鼠粪便水分含量恢复至正常水平，表明动物双歧杆菌乳亚种bla80在改善便秘小鼠粪便水分含量上存在剂量效应。
55.实施例3
56.本实施例参考实施例1构建的小鼠模型，探究不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80对小鼠粪便中总短链脂肪酸含量的影响。检测的具体方法如下：
57.将实施例2收集的另一份粪便用于scfas含量的测定，采用气相色谱-质谱 (gas chromatography-mass spectrometry，gc-ms)分别测定乙酸，丙酸，正丁酸和异丁酸的含量，随后计算总和，得到小鼠粪便中总脂肪酸含量。
58.结果如图3所示，与空白组相比，模型组的小鼠粪便中总脂肪酸含量显著降低，灌胃不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠粪便中总脂肪酸含量均有显著提升。结合统计学分析，空白组与模型组之间存在极显著差异 (p《0.01)，空白组与低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组存在极显著差异(p《0.01)。模型组与低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80 干预组存在极显著差异(p《0.01)。对于低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种 bla80干预组而言，中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在极显著差异(p《0.01)，低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间无明显差异，表明动物双歧杆菌乳亚种bla80在改善便秘小鼠粪便中总脂肪酸含量上存在剂量效应。
59.实施例4
60.本实施例参考实施例1构建的小鼠模型，探究不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80对小鼠肠道推进率的影响。具体方法如下：
61.在实施例2中的各组小鼠灌胃第20天后，各组小鼠禁食不禁水过夜。第21 天上午，称量记录各组小鼠体重并计算平均值。随后，空白组灌胃0.9％的nacl 溶液，模型组和低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组灌胃复方地芬诺酯(每千克体重小鼠灌胃10mg复方地芬诺酯)，灌胃30min后，空白组和模型组灌胃实施例2中配制的墨汁0.1ml/kg，低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组中每千克体重小鼠分别以含有动物双歧杆菌乳亚种bla80 1
×
108cfu、1
×
109cfu和1
×
10
10
cfu的量灌胃墨汁0.1ml/kg。30min后立即处死小鼠，采集小鼠血液加入抗凝剂后4℃保藏备用，随后立即打开腹腔分离肠系膜，剪取幽
门下端至盲肠尾部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度，定义为“小肠总长度”，测量幽门至墨汁前沿长度，定义为“墨汁推进长度”。按下式计算小鼠肠道推进率：
62.小肠推进率＝墨汁推进长度/小肠总长度
×
100％。
63.结果如图4所示，与空白组相比，模型小鼠小肠推进率显著降低，灌胃不同剂量的动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组的小鼠肠道推进率均有提升。结合统计学分析，空白组与模型组之间存在极显著差异(p《0.01)，空白组与低、中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组存在极显著差异(p《0.01)，但空白组与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间无明显差异。模型组与低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间无明显差异，与中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组存在显著差异(p《0.05)，与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80 干预组存在极显著差异(p《0.01)。对于低、中、高剂量动物双歧杆菌乳亚种 bla80干预组而言，低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在显著差异(p《0.05)，低剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在极显著差异(p《0.01)，中剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组与高剂量动物双歧杆菌乳亚种bla80干预组之间存在极显著差异(p《0.01)，表明动物双歧杆菌乳亚种bla80在改善便秘小鼠肠道推进率上存在剂量效应。
64.实施例5
65.本实施例探究动物双歧杆菌乳亚种bla80对治疗功能性便秘人群的作用。
66.具体方法如下：
67.选择到医院就诊并确认为功能性便秘的患者100例为研究对象，提前问询患者的每周排便频次和体感评分，采集患者的粪便根据布里斯托大便分类法进行分类。在患者完全自愿的情况下，对患者进行动物双歧杆菌乳亚种bla80菌粉为期4周的试食试验验证，动物双歧杆菌乳亚种bla80菌粉服用剂量为2.0
ꢀ×
10
10
cfu/d，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌粉的制备方法如下：
68.取制备例1获得的动物双歧杆菌乳亚种bla80菌悬液接入10ml tpy液体培养基中，于37℃培养12h，得到一级种子液；将一级种子液按照2％(v/v) 的接种量接入10ml tpy液体培养基中，于37℃培养12h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入10ml tpy液体培养基中，于37℃培养12h，得到菌液，将菌液6000g离心15min收集沉淀；将沉淀用ph为7.4 的pbs缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有80g/l 脱脂乳、20g/l海藻糖、2 5g/l蔗糖与10g/l甘油的保护剂溶液将菌体重悬至细胞浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到bla80乳化液；将该乳化液进行冷冻干燥，得到所述动物双歧杆菌乳亚种bla80菌粉。
69.试验期间，每周记录一次受试患者的排便频率和体感评分，试验后采集患者粪便，并根据布里斯托大便分类法进行分类，布里斯托大便分类法参考表1，体感评分选取慢性便秘严重度评分量表中的部分指标进行。
70.表1
71.[0072][0073]
所述慢性便秘严重度评分量表如下表2所示：
[0074]
表2
[0075]
[0076][0077]
在剔除31例无效患者后，对剩余69例患者干预前后的大便频次，布里斯托大便分型和排便体感评分进行统计分析，结果如下表3所示(其中，表中数据右上标的不同字母表示各组之间存在显著性差异，相同字母表示无显著性差异)：
[0078]
表3
[0079]
组别平均排便频次布里斯托大便类型排便体感评分服用药粉前3.42
±
0.89a1.86
±
0.35a7.23
±
0.86a服用药粉后5.54
±
1.36b3.47
±
0.82b5.12
±
0.44b[0080]
由上表数据可知，服用药粉前后，患者的平均排便频次、布里斯托大便类型和排便体感评分均存在显著性差异(p《0.05)，服用药粉后患者的平均排便频次有显著提升，布里斯托大便类型由便秘恢复至正常，排便体感显著提升，表明动物双歧杆菌乳亚种bla80能够有效缓解便秘症状。
[0081]
综上所述，本发明采用动物双歧杆菌乳亚种bla80制备调节肠道动力的药物或食物，所述动物双歧杆菌乳亚种bla80能够显著提升个体内短链脂肪酸的含量水平，刺激肠壁蠕动，增加肠道蠕动收缩频率，提高肠内渗透压，降低肠道内的ph值，增加肠道内有益菌的含量。同时，动物双歧杆菌乳亚种bla80 可以促进个体小肠动力的恢复，提高小肠推进率，可以有效缓解便秘。
[0082]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。