基于锍盐稳定的靶向HDAC的多肽药物偶联体及其应用的制作方法

基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽药物偶联体，具体是一种基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体及其应用。


背景技术：

2.癌症是世界范围内一个主要的公共卫生问题。世卫组织公布2020年全球癌症数据显示，2020年中国新发癌症病例457万例，死亡病例300多万例，中国新发癌症人数位居全球第一。肺癌、结直肠癌，肝癌、胃癌、乳腺癌等都是死亡人数排名前十的癌症。肿瘤类型和肿瘤致病原因在不同的性别以及年龄中会不同，肿瘤疾病的复杂性为人类攻克该疾病带来了挑战。传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗和化疗，但是肿瘤的复发、转移和耐药让肿瘤的治疗迎来巨大的挑战。随着生物技术的高速发展，人类对肿瘤发病机制的认识越来越深入，因此研发的抗肿瘤治疗药物层出不穷，这些研究成果为人类彻底治愈肿瘤带来了巨大的信心。过去十几年来对人类癌症基因组的综合分析显示，在许多癌症中参与基因表达、dna修复和dna复制的表观遗传调控蛋白都出现了突变。进一步的研究表明，表观遗传学的异常参与肿瘤的转移、耐药等机制，因此联合表观遗传学疗法成为抗肿瘤治疗的重要手段之一。组蛋白去乙酰化酶(hdac)，作为表观遗传学重要调控因子，在很多恶性肿瘤(比如淋巴癌，乳腺癌，肝癌，结肠癌等)的发生发展及耐药中发挥重要的作用。因此，靶向hdac的药物研发一直受到药物化学家的青睐。截止日前，全球上市的hdac药物有5种，分别是伏立诺他、罗米地辛、贝利司他、帕比司他以及西达本胺，主要用于外周t细胞淋巴瘤和外周t细胞淋巴瘤，其中西达本胺是唯一获批用于实体瘤乳腺癌治疗的hdac抑制剂。目前，仍有很多hdac药物处于临床前或者临床研究用于实体瘤或者血液癌的治疗。因此，靶向hdac的药物对于治疗肿瘤具有较好的前景。
3.由于癌症的异质性和复杂性，癌症的治疗采用联合治疗的方案，比如靶向药与化疗药的联合，双靶点抑制剂、多功能抑制剂等等。凋亡多肽可通过诱导细胞的凋亡而抑制肿瘤的增殖，具有广谱抗肿瘤的效果。同时，凋亡多肽与一线化疗药物的抗肿瘤机制不同，对于治疗化疗耐药的肿瘤细胞也有潜在的应用前景。与生物大分子类似，多肽类分子对于靶点也有较高的结合力与选择性，相对于小分子类药物具有更小的脱靶效应。而多肽在体内的代谢产物为氨基酸，最大限度地降低了毒性。但是线性多肽往往很难维持原有的二级结构，因而具有较差的靶点亲和性、血清稳定性和细胞穿膜能力。化学稳定的多肽可以有效克服这些弱点，因此近十几年，化学稳定的多肽被用于各种蛋白靶点抑制剂的研发，且在细胞和动物水平展现出较好的抑瘤效果。
4.虽然hdac抑制剂和凋亡多肽可用于多种肿瘤的治疗，但是它们各自存在一些缺点，比如hdac抑制剂在临床应用中具有较多的毒副作用，凋亡多肽在早期的研究中发现，由于其具有较强的疏水性，使其对正常细胞和肿瘤细胞均具有抑制增殖的作用，因此生物安全性较差。前期开发的hdac多肽抑制剂具有较强的肿瘤干细胞选择性抑制活性，而对正常细胞在大于10倍浓度下仍没有毒性，说明多肽的引入可以显著降低hdac小分子抑制剂的毒
性。前期也有报道，改变凋亡多肽的亲疏水性，可显著影响多肽对细胞的毒性。因此，将hdac药物偶联多肽，并通过化学手段改变多肽的结构和疏水性，有望能改善多肽药物的选择性毒性。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是针对上述问题，提供一种基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体及其应用，本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
6.基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体，利用锍盐稳定的促凋亡多肽偶联hdac抑制剂，形成具有肿瘤选择性毒性的稳定多肽hdac抑制剂，多肽序列为：精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸，hdac抑制剂为羟肟酸结构。
7.进一步的，偶联子的结构为5个以上碳的饱和脂肪链。
8.基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体在制备抑制hdac家族酶活活性的药物中的应用。
9.基于锍盐稳定的靶向hdac的多肽药物偶联体在制备抑制hdac高表达的肿瘤细胞的药物中的应用。
10.本发明中，我们基于报道的凋亡多肽“rll”序列设计的锍盐化学稳定的环肽，通过锍盐的亲水性改变凋亡多肽的疏水性，从而降低其非特异性的毒性。同时，为了进一步提高其对肿瘤的杀伤效果，我们将多肽的碳端引入了hdac抑制剂羟肟酸，从而实现双功能多肽抗肿瘤的目的。本发明设计的新颖的多肽药物偶联体在细胞水平具有较好的选择性毒性，对肝癌细胞huh7和结肠癌细胞hct116和ht29等具有较好的毒性，但是对正常细胞293t的细胞毒性较弱。充分说明，我们设计的多肽药物能在保持抗肿瘤效果的同时，具有较好的生物安全性。
11.本发明通过hdac酶活抑制实验、细胞凋亡、细胞周期、免疫印迹分析、转录组测序等实验，证实该多肽药物偶联体可以显著影响hdac相关的信号通路。同时，我们采用溶血实验进一步验证，该多肽药物具有较好的生物相容性，在合适的浓度范围内不会引起红细胞破碎。本发明有益于解决传统hdac抑制剂的毒副作用，增加其临床使用的治疗窗口。
12.本发明采用了锍盐稳定多肽的方法形成凋亡环肽。通过固相合成的方法将hdac抑制剂羟肟酸结构引入该多肽序列的碳端，通过免疫印迹分析证明该多肽偶联体可以有效抑制hdac胞内的生物活性。通过细胞凋亡、细胞周期实验以及对肿瘤细胞的总rna测序实验证明该多肽可以抑制hdac相关的信号通路。
13.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明将改造后的凋亡多肽与hdac抑制剂偶联，既达到了双功能抗肿瘤的活性，又减低了其非特异性毒性，该项目有望成为一种高效、低毒的抗肿瘤药物。项目首先通过一系列的酶活抑制实验证明我们的多肽偶联体可以有效抑制hdac蛋白，属于广谱类hdac抑制剂。通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期阻滞实验证明我们的多肽药物偶联体可以有效抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡。通过转录组测序和免疫印迹实验证明本发明的多肽可以抑制hdac相关信号通路。溶血实验说明该多肽药物偶联体具有较好的生物相容新，血清稳定性实验证明环肽比线性多肽具有更好的血清稳定性。该研究成果为未来开发新颖的、更广安全治疗窗口的多功能hdac抑制剂
苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(pybop)(5eq，0.4m，dmf)溶液，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气1h。抽掉反应液，按上述方法洗树脂后接下一个氨基酸，即抽掉反应液，按上述方法洗树脂后进行下一步操作，即在用吗啡啉脱掉树脂上fmoc保护基团之后，将配制好(2)fmoc-leu-oh或者(3)fmoc-arg(pdf)-oh或(4)fmoc-leu-oh或者(5)fmoc-leu-oh或者(6)fmoc-met-oh或者(7)fmoc-arg(pdf)-oh或者(8)fmoc-leu-oh或者(9)fmoc-arg(pdf)-oh或者(10)fmoc-met-oh或者(11)fmoc-leu-oh或者(12)fmoc-arg(pdf)-oh或者(13)fmoc-leu-oh或者(14)fmoc-leu-oh或者(15)fmoc-arg(pdf)-oh，pybop和dipea溶液混匀后加入树脂中鼓氮气2h；抽掉反应液，按上述方法洗涤树脂后进行下一步操作。将合成好的树脂肽n末端fmoc脱掉进行乙酰化，即配制乙酰化试剂dcm：diea:ac2o＝8:1:0.5。用三氟乙酸(tfa)，三异丙基硅烷(tips)和h2o(v:v:v＝9.5:0.25:0.25)剪切液将多肽从树脂上切下来，除去剪切液。将粉末状的多肽粗品溶解在70％乙腈/ddh2o(v:v)中，加入甲酸使其终浓度为1％，随后将1,3-间苯二溴(2.0eq)溶解在少许dmf后，加入多肽混合物中，反应24小时。将ddh20加至反应液中，使其乙腈浓度达到50％，过滤反应液，将澄清的滤液用高效液相色谱分离，esi质谱鉴定多肽分子量。
31.实施例3：靶向hdac的稳定多肽药物偶联体的酶活抑制效果
32.hdac酶活抑制效果的鉴定，用商业购买的hdac酶活检测试剂盒进行操作，每次操作至少重复三遍，hdac酶来自多篇文献报道的hela核提取物，该酶活结果根据商业化试剂盒的操作执行，最后用酶标仪测量多肽药物偶联体对hdac蛋白的抑制活性，如表1所示：
33.表1本发明设计的不同多肽药物对hdac的酶活抑制效果图
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实施例4：靶向hdac的稳定多肽药物偶联体对不同细胞杀伤作用的评价
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靶向hdac的稳定多肽药物偶联体对肿瘤细胞比如肝癌细胞huh7，结肠癌细胞ht29、hct116等具有明显的杀伤作用，而对正常细胞293t抑制效果比较微弱。但是线性凋亡多肽对正常细胞、肿瘤细胞都有较强的抑制效果，如图3所示。细胞活力通过cck8细胞毒性实验测定。细胞在96孔板中以4
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103接种，用溶于培养基(5％血清)的多肽药物偶联体处理24h或者48小时，将cck8加入培养基孵育1h。采用酶标仪在450nm测定吸光度。其中未处理的细胞存活率为100％。
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结果表明，靶向hdac的稳定多肽药物偶联体对肿瘤细胞比如肝癌细胞huh7、结肠癌细胞ht29、hct116等具有明显的杀伤作用，而对正常细胞293t抑制效果比较微弱。
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实施例5：多肽药物偶联体的溶血毒性研究
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为了评价多肽药物偶联体对红细胞的非特异性毒性，我们采用小鼠溶血毒性实验。新鲜的小鼠红细胞用眼球摘除法取得并置于含有抗凝剂的ep管中(1ml的血液加10μl浓度为10mg/ml的肝素钠)，8600rpm/min快速离心10s，并用0.9％生理盐水洗涤至上清澄清。将得到的红细胞稀释至108/ml，取一系列不同浓度的多肽与红细胞在37℃下共孵育1小时。快速离心后用nano drop 2000c测定上清中释放的血红素，测定吸收波长为570nm。0.1％triton x-100和0.9％生理盐水分别作为正负对照。溶血百分比根据已报道公式计算得到％溶血性＝[(样品570nm吸收-负对照570nm吸收)/(正对照570nm吸收
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负对照570nm吸收)]
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100。通过溶血实验我们发现，经过锍盐稳定的多肽药物偶联体比线性凋亡多肽具有更低的毒性，如图4。由此可以证实，锍盐稳定的多肽药物偶联体，可以显著降低多肽的非特异性毒性。
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实施例6：靶向hdac的稳定多肽偶联体对肝癌细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响。
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为了评价该多肽药物是否引起肿瘤细胞凋亡，我们采用annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪检测多肽药物引起细胞凋亡的情况。如图5所示，该多肽药物确实可以明显引起肿瘤细胞的凋亡。
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对于细胞周期实验，将药物处理24小时的细胞收集，先用70％冰乙醇，在-20℃孵育过夜，pi染色，再用流式细胞仪分析。结果表明多肽药物可以明显引起肿瘤细胞发生g1期的细胞周期阻滞，如图6所示。
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实施例7：多肽药物偶联体能显著提高hdac的底物乙酰化水平
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采用免疫印迹实验(wb)研究不同多肽在不同的给药浓度处理肿瘤细胞后，对hdac底物乙酰化水平的影响。经过反复多次的wb实验发现，我们设计的靶向hdac的稳定多肽药物wp1可以明显引起hdac组蛋白底物乙酰化水平的上调，如图7所示，揭示我们的药物可以明显抑制肿瘤细胞hdac的活性。
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实施例8：多肽药物偶联体对肝癌细胞hdac相关信号通路的影响
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为了进一步验证多肽药物偶联体对肝癌细胞的整个信号通路的影响，我们进行转录组测序，检测了多肽药物对肿瘤细胞整个基因表达的影响，发现该多肽药物对肝癌细胞的多个信号通路都有影响(图8a是rna微阵列分析加药组与不加药组的总基因表达的差异性，图8b是汇总的加药组和不加药组总上调基因和下调基因的个数，图8c是全基因组分析多肽药物在肝癌细胞中影响的不同生物功能的信号通路。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。