用于清除可溶性生物分子的模块化组合物及其相关方法
1.本技术是2016年07月29日递交的pct国际申请pct/us2016/044674于2018年03月23日进入中国国家阶段的中国专利申请号为201680055816.1、发明名称为“用于清除可溶性生物分子的模块化组合物及其相关方法”的发明专利申请的分案申请。
2.优先权
3.本技术要求于2015年7月29日提交的美国临时专利申请号62/198,531、于2015年7月29日提交的美国临时专利申请号62/198,519、于2015年7月29日提交的美国临时专利申请号62/198,541、于2015年10月2日提交的美国临时专利申请号62/236,507和于2016年4月6日提交的美国临时专利申请号62/319,092的优先权，上述美国临时专利申请的每个通过引用被整体并入本文。
技术领域
4.本发明涉及用于清除可溶性生物分子的模块化组合物及其相关方法。
背景技术：
5.临床可用的或正在研发的许多抗癌疗法涉及刺激免疫系统以识别或破坏癌症的能力，或两者兼具。最突出的三个是来自百时美施贵宝(bristol-myers squibb)的抗检查点抑制剂(ipilimumab，易普利姆玛)、来自默克公司(merck)的(派姆单抗(pembrolizumab)，原名兰罗利珠单抗(lambrolizumab))。然而，这些和其他途径涉及受试者的免疫系统的净上调，诱导类似自身免疫紊乱的潜在严重症状和/或其他显著的副作用。
6.本领域需要更有效的药理学途径来克服癌症，特别是转移癌，而不扰乱受试者避免自身免疫的能力。除其他之外，本公开提供基于针对利用受试者的自身免疫系统对抗癌症的可替换的途径的方法和组合物，包含去抑制肿瘤微环境，即削弱肿瘤的防御系统，而不刺激免疫细胞。
技术实现要素：
7.除其他之外，本公开提供结合至并且抑制生物分子(特别是可溶性生物分子)的生物活性的组合物及其药物组合物。本公开还提供一些应用，其中所述组合物是有用的。例如，本文中描述的组合物对于抑制细胞(如癌细胞)的增殖、生长和/或存活是有用的。此外，本文中描述的组合物对于预防和/或治疗衰老、代谢紊乱和神经退行性疾病是有用的。在另一个实施例中，本文中描述的组合物对于结合至并且中和受试者的循环中的毒素(例如，动物毒素、细菌毒素和/或植物毒素)、病毒或其他外来化合物可以是有用的。
附图说明
8.图1描绘了结合至tnf受体(stnf-r)的可溶形式的颗粒的示例性实施方案。颗粒为大约1立方微米。颗粒的内表面包括被固定的tnf药剂，所述被固定的tnf药剂能够结合至
stnf-r靶标并且将stnf-r靶标从其天然配体隔离(清除)，从而抑制stnf-r靶标与其他蛋白质和细胞之间的相互作用。颗粒的内表面限定边界，所述边界包括孔隙空间。
9.图2描绘了包括结合至tnf受体(stnf-r)靶标的可溶形式的tnf药剂的颗粒的示例性实施方案。图2中所示的三个颗粒被描绘为已经结合0、3或10个stnf-r靶标的分子。尽管tnf药剂和stnf-r靶标没有按比例显示，但环状颗粒具有大约175nm的直径。颗粒的内表面含有被固定的tnf药剂，所述被固定的tnf药剂能够结合至stnf-r靶标并且将stnf-r靶标从其天然配体隔离(清除)，从而抑制stnf-r靶标与其他蛋白质和细胞之间的相互作用。环状颗粒的内部包括孔隙空间。
10.图3描绘了包括凸起的的颗粒的示例性实施方案。图左侧的颗粒是八面体，所述八面体具有最长线度为100至150nm的芯。图右侧的颗粒是二十面体，所述二十面体具有最长线度为200至300nm的芯。每个颗粒还包括从芯多面体结构的顶点指向外的分子凸起。颗粒被描绘为包括以深灰色显示的药剂，并且一些颗粒被描绘为已经结合靶标(例如，生物分子)，所述靶标以浅灰色显示并且被标识为0或3个“捕获物”。这些凸起用作“细胞反射器”，所述“细胞反射器”抑制结合至颗粒的药剂的靶标与细胞表面之间的相互作用。图3中的颗粒、凸起、药剂和结合的靶标的表示不一定按比例显示。
11.图4由两幅图片(标为图片(a)和(b))组成。图片(a)描绘了颗粒内的亚微颗粒堆积，所述颗粒包括芯亚微颗粒和保护亚微颗粒，其中每个亚微颗粒大体上是球形的并且尺寸大致相同。不过，颗粒可以包括不同形状和/或尺寸的亚微颗粒。此外，亚微颗粒显示为以六边形图案堆积；然而，亚微颗粒可以随机堆积或堆积为其他几何形状。图片(b)描绘了(i)被固定在芯亚微颗粒表面上的“捕获配体”(即，药剂)，(ii)特异性地结合至药剂的靶标(例如，生物分子)，和(iii)在颗粒的充满流体的孔隙空间内的靶标。图片(b)没有描绘保护亚微颗粒。图4中的亚微颗粒、捕获配体、靶标和孔隙空间的相对尺寸不一定按比例显示。
12.图5由四幅图片(标为图片(a)、(b)、(c)和(d))组成。每个图片描绘了颗粒的亚微颗粒，其中芯亚微颗粒显示为灰色，并且保护亚微颗粒显示为白色。每个颗粒包括55个芯亚微颗粒。图片(a)和(b)描绘了与图片(c)和(d)中描绘的视图正交的颗粒的视图。图片(a)和(c)仅描绘了芯亚微颗粒，并且图片(b)和(d)描绘了芯亚微颗粒和一些保护亚微颗粒。包括芯亚微颗粒和保护亚微颗粒的完整颗粒优选地被至少一层保护亚微颗粒覆盖，所述至少一层保护亚微颗粒在任何图片中都未完整显示。在图5中，每个芯亚微颗粒和保护亚微颗粒大体上是球形的并且尺寸大致相同；然而，颗粒内的亚微颗粒可以在形状和/或尺寸上不同。此外，图5的亚微颗粒显示为以六边形图案堆积；然而，颗粒的亚微颗粒可以堆积为其他几何形状，或它们可以随机堆积。图5中的亚微颗粒、捕获配体、靶标和孔隙空间的相对尺寸不一定按比例显示。
13.图6由6幅图片(标为图片(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f))组成。每个图片描绘了大体上二维的颗粒的视图。在每个图片中，圆圈描绘了被固定在颗粒表面上的药剂。大体上二维的颗粒可以包括“孔隙空间”，例如在十字形或星形的臂之间。图片(a)描绘了包括十字形的颗粒的“顶视图”，并且图(b)描绘了相同的十字形颗粒的正交“侧视图”。图片(a)的“十字形”是“大体上二维形状”，并且正交“侧视图”是不含有二维形状的第三维度。“侧视图”显示大体上二维的颗粒可以包括不同的表面，即“内部表面”(药剂被固定在所述“内部表面”上)(黑色)和“外部表面”(所述“外部表面”基本上没有药剂)(即“外部表面”)。不同的表面可以
包括不同的材料，例如，颗粒可以是层状的，或例如通过掩蔽一个表面而另一个表面交联至药剂或覆层分子，可以制备不同的表面。根据颗粒的尺寸以及药剂和靶标的性质，十字形将在不同的程度上抑制结合的靶标(例如，生物分子)与其他蛋白质或细胞之间的相互作用。颗粒的几何形状可以被调整，例如，以进一步抑制这样的相互作用。图片(c)描绘了包括六角星几何形状的颗粒，所述颗粒可以比图片(a)的十字形颗粒更大的程度抑制结合的靶标与其他蛋白质或细胞之间的相互作用。图片(d)描绘了三角星，所述三角星可以仅最低程度地抑制结合的靶标与其他蛋白质或细胞之间的相互作用。虽然如此，包括三角星几何形状的颗粒可以被修改以在更大程度上抑制结合的靶标与其他蛋白质或细胞之间的相互作用。例如，图片(e)描绘了包括三角星几何形状的颗粒，其中基本上没有药剂的材料包围颗粒，并且图片(f)描绘了包括三角星几何形状的颗粒(即，包括四个三角星)，所述三角星几何形状具有外表面，所述外表面基本上没有药剂。
14.图7描绘了包括反应基团的颗粒和包括官能团的药剂。根据每个基团的性质，结合颗粒和药剂从而可以在反应基团和官能团之间形成共价键或非共价键。
15.图8描绘了包括反应基团的颗粒、包括官能团的连接体，以及药剂。根据每个基团的性质，结合颗粒和连接体从而可以在反应基团和官能团之间形成共价键或非共价键。然后颗粒/连接体复合物可以与药剂结合，以在连接体和药剂之间形成共价键或非共价键，从而将颗粒连接至药剂。
具体实施方式
16.本公开的特征在于用于将可溶性生物分子从其天然环境隔离的组合物和方法，例如，从而抑制可溶性生物分子的生物活性。例如，本公开提供具有包括选择性地结合至可溶性生物分子的药剂(例如，被固定在颗粒的表面上)的表面的颗粒或多个颗粒。一旦可溶性生物分子被药剂结合，其被颗粒隔离，使得可溶性生物分子具有降低的与可溶性生物分子的其他天然的结合配偶体(binding partners)相互作用的能力(例如，大幅度降低的能力或无能力)。因此，可溶性生物分子变成惰性的。
17.本公开的多个方面涉及包括反应基团的颗粒，所述反应基团被配置以将药剂连接至颗粒。因此，颗粒可以不包括药剂，但是颗粒仍然可以能够偶联至药剂。基于待清除的生物分子的性质，不同的药剂可以被连接至颗粒。
18.在一些方面，本公开涉及包括颗粒和连接体的试剂盒。例如，连接体可以被选择，以与包括对颗粒特异性的部分的药剂反应。因此，可以在具有许多不同连接体的试剂盒中提供单个“通用清除剂”颗粒，用于将许多不同类型的药剂连接至颗粒(例如，其中不同连接体能够将不同部分连接至相同颗粒)。
19.颗粒的反应基团优选地被配置，使得连接至颗粒的药剂对于靶标生物分子的可溶形式比对于生物分子的膜结合形式或表面结合形式具有更高的选择性。例如，不与颗粒缔合的药剂可以以类似的结合亲和性(例如，以类似的缔合常数ka和/或类似的平衡常数kd)结合生物分子的可溶形式和膜缔合形式。相对于相同生物分子的膜缔合形式，直接地连接至颗粒的反应基团或间接地连接至颗粒的反应基团(例如，通过连接体)的药剂可以表现对于靶标生物分子的可溶形式更高的结合亲和性(例如，更高的ka和/或更低的kd)。
20.在优选的实施方案中，多个反应基团中的每个反应基团在颗粒上被配置，使得相
比于当药剂不被连接至颗粒的反应基团时(例如，以及药剂反而在溶液中是游离的或被连接至暴露的表面)，连接至反应基团(直接地或间接地，例如，通过连接体)的药剂对于靶标生物分子的膜缔合形式具有较低的结合亲和性。例如，反应基团可以在颗粒上被配置，使得相比于当药剂不被连接至颗粒的反应基团时，连接至反应基团(直接地或间接地，例如，通过连接体)的药剂对于靶标生物分子的膜缔合形式具有较低的缔合常数ka。对于靶标生物分子的膜-结合形式，连接至颗粒的药剂的ka(k
a，颗粒
)可以比在溶液中游离的或连接至暴露的表面的药剂的ka小0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005或0.001阶(例如，对于药剂和膜结合的靶标，k
a，颗粒
÷ka，游离的
≤0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005或0.001)。类似地，反应基团可以在颗粒上被配置，使得相比于当药剂不被连接至颗粒的反应基团时，连接至反应基团(直接地或间接地，例如，通过连接体)的药剂对于靶标生物分子的膜缔合形式具有较高的平衡常数kd。对于靶标生物分子的膜-结合形式，连接至颗粒的药剂的kd(k
d，颗粒
)可以比在溶液中游离的或连接至暴露的表面的药剂的kd大10％、20％、25％、50％、100％、200％、250％、500％、1000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％阶(例如，对于药剂和膜-结合的靶标，k
d，颗粒
÷kd，游离的
≥1.1、1.2、1.25、1.5、2.0、2.5、3.5、5.0、10、5、100、500或1000)。
21.在优选的实施方案中，颗粒被配置，使得将药剂连接至颗粒的反应基团本质上不影响药剂对于靶标生物分子的可溶形式的结合亲和性(例如，相对于当药剂不被连接至颗粒的反应基团，以及药剂反而是在溶液中游离的或被连接至暴露的表面时)。例如，反应基团可以在颗粒上被配置，使得相对于当药剂不被连接至颗粒的反应基团时，连接至反应基团(直接地或间接地，例如，通过连接体)的药剂对于靶标生物分子的可溶形式具有大约相同的缔合常数ka。对于靶标生物分子的可溶形式，连接至颗粒的药剂的ka(k
a，颗粒
)可以与在溶液中游离的或连接至暴露的表面的药剂的ka(k
a，游离的
)大约相同(例如，对于药剂和可溶性靶标，k
a，颗粒
÷ka，游离的
可以是从0.1至10，如0.2至5，0.5至2，0.8至1.2，或0.9至1.1)。类似地，反应基团可以在颗粒上被配置，使得相对于当药剂不被连接至颗粒的反应基团时，连接至反应基团(直接地或间接地，例如，通过连接体)的药剂对于靶标生物分子的可溶形式具有大约相同的平衡常数kd。对于靶标生物分子的可溶形式，连接至颗粒的药剂的kd(k
d，颗粒
)可以与在溶液中游离的或连接至暴露的表面的药剂的kd(k
d，游离的
)大约相同(例如，对于药剂和可溶性靶标，k
d，颗粒
÷kd，游离的
可以是从0.1至10，如0.2至5，0.5至2，0.8至1.2，或0.9至1.1)。
22.因此，包括多个反应基团的颗粒可以被连接至药剂(例如，抗体、fab、scfv或细胞表面受体的配体)以设计颗粒，所述颗粒选择性地结合靶标的可溶形式(例如，抗原和/或细胞表面受体的可溶形式)但是不明显地结合靶标的膜结合的形式。这样的颗粒可以在体内或在体外被利用，例如，以降低流体中的可溶性靶标的浓度而不将药剂暴露给靶标的膜结合的形式。
23.i.生物分子
24.可溶性生物分子通常是特异性的结合对的第一构件。如本文中使用的，“结合配偶体”、“特异性的结合配偶体”或“特异性的结合对的构件”通常包括以很大程度的亲和性和特异性彼此结合的结合构件对中的任何构件。一对结合配偶体可以彼此结合以很大程度的排除样品的其他组分的至少大部分或至少基本上全部，和/或可以具有小于约10-4
、10-5
、10-6
、10-7
或10-8
m等的解离常数等。一对结合配偶体可以以预先确定的方式“配合”在一起，所
述预先确定的方式依赖于多个原子相互作用以合作地增加特异性和亲和性。结合配偶体可以衍生自生物系统(例如，受体-配体相互作用)、化学相互作用、和/或通过分子印迹技术等。表1中给出了示例性相应的多对结合配偶体，也称为特异性的结合对，其具有任意的和可互换的名称“第一”和“第二”。
25.本文中使用的术语“生物分子”是指可以对活体产生作用的任何分子。在一些实施方案中，生物分子是原子，如锂或铅(例如，生物分子可以是金属阳离子)。在一些实施方案中，生物分子不是原子或金属离子。例如，生物分子可以是分子，如有机化合物或无机化合物。在一些实施方案中，生物分子是药物，如华法林或达比加群酯。生物分子可以是精神活性药物，如二乙酰吗啡。生物分子可以是毒物、毒素或毒液。生物分子可以是过敏原。生物分子可以是致癌物质。生物分子可以是化学武器的药剂，如神经药剂。生物分子可以是生物体的内生分子，如激素、细胞因子、神经递质、可溶性胞外受体、抗体或可溶性基质蛋白。生物分子可以是肽、多肽、蛋白质、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可以包括肽、多肽、蛋白质、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可能是错误折叠蛋白质。生物分子可以是淀粉样蛋白或淀粉样蛋白的可溶性前体。“多肽”、“肽”和“蛋白质”被可互换地使用，并且意指氨基酸的任何肽连接链，而不管长度或翻译后修饰。生物分子可以是脂质、类固醇或胆固醇。生物分子可以包括脂质、类固醇或胆固醇。生物分子可以是循环游离核酸，如循环游离rna。生物分子可以是微小rna(mirna)。
26.生物分子可以是由细胞(例如，哺乳动物细胞)分泌的生物分子。生物分子可以是膜蛋白的胞外区域，所述膜蛋白的胞外区域易于被切割成可溶形式。生物分子可以是细胞溶质生物分子。例如，生物分子可以是跟随细胞凋亡在体内释放的细胞溶质生物分子，或颗粒可以在体外方法中使用，其中细胞溶质生物分子在溶液中是游离的。
27.在某些优选的实施方案中，生物分子是可溶性生物分子。在某些优选的实施方案中，靶标是可溶性生物分子。虽然如此，颗粒可以靶向水性溶液中不是溶质的生物分子，和/或不与细胞表面上的结合配偶体相互作用的生物分子。例如，颗粒可以特异性地结合与蛋白质聚集体有关的生物分子(如淀粉样蛋白或朊粒聚集体)。这样的颗粒可以通过解聚聚集体(例如，通过使热力学平衡转向远离聚集状态)和/或通过隔离聚集体(例如，以抑制进一步聚集和/或以允许清除结合的聚集体)来提供治疗益处。类似地，颗粒可以特异性地结合至结晶钙或羟磷灰石。类似地，颗粒可以特异性地结合至与病毒或细胞有关的生物分子(如，细菌、原生动物、真菌或酵母细胞)，例如，其中生物分子不是水性溶液中的溶质，但生物分子被分配进入膜、细胞壁或衣壳。因此，颗粒可以隔离病原性病毒或细胞，从而减弱病毒或细胞的致病性。颗粒可以特异性地结合至与胞外囊泡有关的生物分子(如核外颗粒体、外来体、脱落囊泡或凋亡小体)。颗粒可以特异性地结合至低密度脂蛋白，例如，以隔离低密度脂蛋白颗粒。
28.生物分子可以是细胞表面受体的配体。配体可以是天然存在的配体或合成的配体。配体可以是受体的天然配体(例如，由受试者体内产生的配体)或非天然配体(例如，被引入进受试者的配体，如病毒或药物)。生物分子可以是细胞溶质受体或核受体的配体。
29.表1.特异性的结合对的实施例
[0030][0031]
已知肿瘤细胞通过排出细胞因子受体的可溶形式来保护自身免受宿主免疫监视，这些可溶受体结合至肿瘤微环境中的免疫细胞产生的细胞因子。例如，癌细胞排出tnf受体的可溶形式和其他细胞因子受体，如il-2受体和trail受体。这些可溶性受体通过减轻细胞对tnfα、il-2和trail的促凋亡作用而赋予癌细胞生长优势。karpatova等报道了通过人类癌细胞的67kd层粘连蛋白受体的排出，这可能增加肿瘤侵袭和转移(j cell biochem 60(2):226-234(1996))。因此，本文中描述的颗粒可以被设计用于清除细胞表面受体蛋白的可溶形式，例如，用于治疗癌症。
[0032]
因此，在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白由癌细胞表达，和/或细胞表面受体蛋白是癌细胞以细胞表面受体蛋白的可溶形式排出的蛋白质。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白在被激活时诱导细胞凋亡(例如，死亡受体)。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是肿瘤坏死因子受体(tnfr)蛋白(例如，tnfr-1或tnfr-2)。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是fas受体蛋白。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是tnf相关细胞凋亡配体受体(trailr)蛋白、4-1bb受体蛋白、cd30蛋白、eda受体蛋白、hvem蛋白、淋巴毒素β受体蛋白、dr3蛋白或tweak受体蛋白。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是白介素受体蛋白，例如，il-2受体蛋白。应当理解，在这样的实施方案中，靶标可溶性生物分子可以是细胞表面受体的可溶形式，例如，排出自癌细胞。
[0033]
在一些实施方案中，生物分子是可溶性tim3(“t细胞ig黏蛋白3”)。可溶性tim3(stim3)已经牵涉自身免疫性疾病和癌症，并且升高的stim3与hiv感染有关。半乳糖凝集素9(“gal9”)和潜在的其他配体与tim3(所述tim3与ceacam1成异源二聚体缔合)的缔合导致t细胞应答的抑制，并且tim3和ceacam1的共阻断导致抗肿瘤免疫应答。相应地，生物分子可以是stim3或stim3的天然配体(如tim3l或gal9)。生物分子可以是ceacam1的可溶性同种型。以这种方法，颗粒可以适合于清除stim3，而不抑制gal9与膜结合的tim3(mtim3)之间的相互作用。类似地，药剂可以是stim3，对stim3(或其抗原结合部分)具有选择性的抗体或tim3的配体。药剂可以是ceacam1的天然配体(如gal9或其变体)或对ceacam1或其可溶性同种型具有选择性的抗体。前述颗粒中的任何一种可以用于，例如，治疗癌症的方法、治疗hiv感染的方法，和治疗自身免疫性疾病(如移植物抗宿主疾病)的方法。
[0034]
在一些实施方案中，生物分子可以是gal9(半乳糖凝集素9)。颗粒可以包括对gal9具有选择性的药剂(如gal9的天然配体(如tim3)或其变体)，或对gal9具有选择性的抗体。以这种方法，颗粒可以适合于清除gal9，而不抑制膜结合的gal9(mgal9)与膜结合的tim3(mtim3)的相互作用。在一些实施方案中，生物分子可以是ceacam1的可溶性同种型(“sceacam1”)。药剂可以是sceacam1的天然配体(如gal9)或其变体，或对ceacam1或ceacam1的可溶性同种型具有选择性的抗体。
[0035]
在一些实施方案中，生物分子是可溶性ctla4。可溶性ctla4(“sctla4”)已经牵涉
癌症，并且有效抵抗sctla4但不抵抗膜结合的ctla4(“mctla4”)的抗体在癌症的动物模型中是有效的。在一些实施方案中，生物分子是sctla4。药剂可以是ctla4的天然配体(如可溶性b7-1或可溶性b7-2)或其变体，或对ctla4具有选择性的抗体(如易普利姆玛(ipilimumab)或替西木单抗(ticilimumab))。以这种方法，颗粒可以适合于清除sctla4，而不抑制配体与mctla4之间的相互作用。因此，sctla4可以从肿瘤微环境(“tme”)和/或tme的外部循环中被移除，同时使mctla4游离作为正常免疫应答的一部分用于相互作用。靶向sctla4的颗粒可以被用于，例如，治疗癌症的方法中。
[0036]
可溶性pd-1(“spd1”)牵涉自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)。过量spd1可能扰动pd1与其配体pd-l1和pd-l2之间的平衡，导致自身免疫。因此，生物分子可以是spd1。药剂可以是spd1的天然配体(如pd-l1、pd-l2)或其变体，或对pd1具有选择性的抗体(如pd1阻断药物，例如，纳武单抗(nivolumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)或派姆单抗(pembrolizumab))。因此，颗粒可以适合于清除spd1，而不抑制pd-l1或pd-l2与膜结合的pd1的相互作用。这样的颗粒可以被用于，例如，治疗自身免疫性疾病(如关节炎)的方法中。
[0037]
lag3是一种t细胞表面受体，当所述t细胞表面受体被其配体结合时，引起抑制。lag3的可溶形式(“slag3”)与自身免疫相关，例如，在i型糖尿病和其他自身免疫性疾病中。生物分子可以是slag3。药剂可以是slag3的天然配体或其变体，或对slag3具有选择性的抗体。因此，颗粒可以适合于清除slag3，而不抑制配体与膜结合的lag3之间的相互作用。这样的颗粒可以被用于，例如，治疗自身免疫性疾病(如i型糖尿病)的方法中。
[0038]
生物分子可以是tnfα。药剂可以包括抗-tnfα抗体(如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、cerolizumab、阿非莫单抗(afelimomab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、欧咗立珠单抗(ozoralizumab)或戈利木单抗(golimumab))，或药剂可以包括抗-tnfα抗体的抗原结合部分。药剂可以是依那西普(etanercept)。药剂可以是tnfα的可溶性受体(stnf-r或其变体)。靶向tnfα的颗粒对治疗或预防各种自身免疫性疾病(如强直性脊柱炎、克罗恩病、化脓性汗腺炎、银屑病、斑块状银屑病、银屑病性关节炎、顽固性哮喘、幼年特发性关节炎、溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎)可以是特别有用的。除其他疾病和病况以外，靶向tnfα的颗粒对治疗或预防阿尔茨海默病、心血管疾病、ii型糖尿病、肌营养不良和肥胖症也可以是有用的。
[0039]
生物分子可以是β2微球蛋白(b2m)。药剂可以是抗b2m抗体。除其他疾病和病况以外，靶向b2m的颗粒对治疗或预防记忆丧失、认知减退、外周动脉疾病，透析相关性淀粉样变、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤可以是有用的。
[0040]
生物分子可以是ccl2(趋化因子(c-c基序)配体2)。药剂可以是抗-ccl2抗体。除其他疾病和病况以外，靶向ccl2的颗粒对治疗或预防阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、局部缺血(例如，缺血性发作)、癫痫、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、肾小球肾炎和外伤性脑损伤可以是有用的。
[0041]
生物分子可以是ccl11(c-c基序趋化因子11；嗜酸性粒细胞趋化因子1)。药剂可以是抗-ccl11抗体。除其他疾病和病况以外，靶向ccl11的颗粒对治疗或预防记忆丧失和认知减退可以是有用的。
[0042]
生物分子可以是ccl19。药剂可以是抗-ccl19抗体。除其他疾病和病况以外，靶向
ccl19的颗粒对治疗或预防衰老和认知减退可以是有用的。
[0043]
生物分子可以是干扰素γ(infγ)。药剂可以包括抗-infγ抗体(如芳妥珠单抗(fontolizumab))或可溶性infγ受体(sinfγr)。生物分子可以是可溶性infγ受体。药剂可以包括infγ或抗sinfγr抗体。除其他疾病和病况以外，靶向干扰素γ的颗粒对治疗或预防自身免疫性疾病(如克罗恩病、类风湿性关节炎和银屑病)可以是特别有用的。
[0044]
生物分子可以是簇集素(例如，分泌簇集素、同种型2)。药剂可以包括抗-簇集素抗体或其抗原结合部分。除其他疾病和病况以外，靶向簇集素的颗粒对治疗或预防癌症(例如，头颈癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝细胞癌或黑色素瘤)、肾脏疾病(例如，肾病性胱胺酸贮积症、范科尼综合征、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和心肌梗死可以是有用的。
[0045]
生物分子可以是高迁移率族蛋白b1(hmgb1)。药剂可以包括抗-hmgb1抗体或其抗原结合部分。生物分子可以是热休克蛋白(例如，hsp60、hsp70、hsp90)。药剂可以包括抗-hsp抗体或其抗原结合部分。生物分子可以是过氧化物还原酶(例如，过氧化物还原酶1或过氧化物还原酶2)。药剂可以包括抗-过氧化物还原酶抗体或其抗原结合部分。
[0046]
药剂可以是清道夫受体的胞外部分，如a类清道夫受体(例如，scara1(巨噬细胞清道夫受体1；msr1；cd204)、scara2(巨噬细胞受体；marco)、scara3、scara4(colec12)、scara5)、b类清道夫受体(例如，scarb1、scarb2、scarb3(cd36))、cd68、黏蛋白或凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lox-1)。
[0047]
生物分子可以是胰岛素样生长因子1(igf-1)或胰岛素样生长因子结合蛋白(例如，igfbp-1、igfbp-2、igfbp-3、igfbp-4、igfbp-5、igfbp-6)。药剂可以是胰岛素样生长因子1(igf-1)或胰岛素样生长因子结合蛋白(例如，igfbp-1、igfbp-2、igfbp-3、igfbp-4、igfbp-5、igfbp-6)。药剂可以是抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分选择性地结合胰岛素样生长因子1(igf-1)或胰岛素样生长因子结合蛋白(例如，igfbp-1、igfbp-2、igfbp-3、igfbp-4、igfbp-5、igfbp-6)。
[0048]
药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合cd63、cd9或cd81的胞外表位。靶向cd63、cd9和/或cd81的颗粒对清除胞外囊泡(如核外颗粒体、外来体、脱落囊泡或凋亡小体)可以是特别有用的。清除各种胞外囊泡的颗粒对治疗或预防癌症(例如，具有与囊泡的排出相关的疾病进展的癌症)可以是特别有用的。
[0049]
生物分子可以是cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl4l1、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、ccl1、ccl2、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、xcl1、xcl2或cx3cl1(参见，例如，zlotnik,a.and yoshie,o.,immunity,36(5):705(2012))。药剂可以包括抗体(或其抗原结合部分)，所述抗体(或其抗原结合部分)特异性地结合cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl4l1、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、ccl1、ccl2、ccl3、ccl3l1、ccl3l3、ccl4、ccl4l1、ccl4l2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、xcl1、xcl2或cx3cl1。
[0050]
生物分子可以是白介素1、白介素1α、白介素1β、白介素2、白介素3、白介素4、白介
素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素13、白介素14、白介素15、白介素16、白介素17、白介素18、白介素19、白介素20、白介素21、白介素22、白介素23、白介素24、白介素25、白介素26、白介素27、白介素28、白介素29、白介素30、白介素31、白介素32、白介素33、白介素35或白介素36。药剂可以包括抗体(或其抗原结合部分)，所述抗体(或其抗原结合部分)特异性地结合白介素1、白介素1α、白介素1β、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素13、白介素14、白介素15、白介素16、白介素17、白介素18、白介素19、白介素20、白介素21、白介素22、白介素23、白介素24、白介素25、白介素26、白介素27、白介素28、白介素29、白介素30、白介素31、白介素32、白介素33、白介素35或白介素36。药剂可以包括可溶性白介素-2受体、可溶性白介素-3受体、可溶性白介素-4受体、可溶性白介素-5受体、可溶性白介素-6受体、可溶性白介素-7受体、可溶性白介素-9受体、可溶性白介素-10受体、可溶性白介素-11受体、可溶性白介素-12受体、可溶性白介素-13受体、可溶性白介素-15受体、可溶性白介素-20受体、可溶性白介素-21受体、可溶性白介素-22受体、可溶性白介素-23受体、可溶性白介素-27受体或可溶性白介素-28受体。药剂可以是可溶性st2，所述可溶性st2结合白介素33。
[0051]
生物分子可以是可溶性白介素-2受体、可溶性白介素-3受体、可溶性白介素-4受体、可溶性白介素-5受体、可溶性白介素-6受体、可溶性白介素-7受体、可溶性白介素-9受体、可溶性白介素-10受体、可溶性白介素-11受体、可溶性白介素-12受体、可溶性白介素-13受体、可溶性白介素-15受体、可溶性白介素-20受体、可溶性白介素-21受体、可溶性白介素-22受体、可溶性白介素-23受体、可溶性白介素-27受体或可溶性白介素-28受体。药剂可以包括抗体(或其抗原结合部分)，所述抗体(或其抗原结合部分)特异性地结合可溶性白介素-2受体、可溶性白介素-3受体、可溶性白介素-4受体、可溶性白介素-5受体、可溶性白介素-6受体、可溶性白介素-7受体、可溶性白介素-9受体、可溶性白介素-10受体、可溶性白介素-11受体、可溶性白介素-12受体、可溶性白介素-13受体、可溶性白介素-15受体、可溶性白介素-20受体、可溶性白介素-21受体、可溶性白介素-22受体、可溶性白介素-23受体、可溶性白介素-27受体或可溶性白介素-28受体。药剂可以是白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素13、白介素15、白介素20、白介素21、白介素22、白介素23、白介素27或白介素28。
[0052]
生物分子可以是肾上腺素、去甲肾上腺素、褪黑素、血清素、三碘化钾腺氨酸或甲状腺素。生物分子可以是前列腺素(例如，前列环素i2(pgi2)、前列腺素e2(pge2)、前列腺素f2α(pgf2α))、白三烯、前列环素或血栓烷。生物分子可以是睾酮、脱氢表雄酮(dhea)、雄烯二酮、二氢睾酮(dht)、醛固酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、黄体酮、皮质醇、骨化三醇或骨化二醇。
[0053]
生物分子可以是淀粉不溶素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原、血管紧张素i、血管紧张素ii、抗利尿激素(后叶加压素)、爱帕琳肽、心房钠尿肽、脑钠尿肽、降钙素、趋化素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质素释放激素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、促卵泡激素、甘丙肽、肠抑胃肽、促胃液素、饥饿素、胰高血糖素、类胰高血糖素多肽-1、促性腺素释放激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(生长调节素，例如，igf-i)、瘦素、促脂素、黄
体化激素、促黑激素、胃动素、食欲肽、催产素、胰多肽、甲状旁腺激素、垂体腺苷酸环化酶激活肽、催乳素、催乳素释放激素、松弛素、肾素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、甲状腺促进激素(thyroid-stimulating hormone)(促甲状腺素(thyrotropin))、促甲状腺素释放激素或血管活性肠肽。药剂可以包括抗体(或其抗原结合部分)，所述抗体(或其抗原结合部分)特异性地结合淀粉不溶素、脂联素、促肾上腺皮质激素、爱帕琳肽、血管紧张素原、血管紧张素i、血管紧张素ii、抗利尿激素(后叶加压素)、心房钠尿肽、脑钠尿肽、降钙素、趋化素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质素释放激素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、促卵泡激素、甘丙肽、肠抑胃肽、促胃液素、饥饿素、胰高血糖素、类胰高血糖素多肽-1、促性腺素释放激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(生长调节素，例如，igf-i)、瘦素、促脂素、黄体化激素、促黑激素、胃动素、食欲肽、催产素、胰多肽、甲状旁腺激素、垂体腺苷酸环化酶激活肽、催乳素、催乳素释放激素、松弛素、肾素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、甲状腺促进激素(thyroid-stimulating hormone)(促甲状腺素(thyrotropin))、促甲状腺素释放激素或血管活性肠肽。
[0054]
生物分子可以是血管内皮生长因子-a(vegf-a)。药剂可以包括特异性地结合vegf-a的抗体(如贝伐单抗或布鲁赛珠单抗(brolucizumab))或其抗原结合部分(如雷珠单抗(ranibizumab))。例如，药剂可以是阿柏西普(aflibercept)。除其他病况和疾病以外，靶向vegf-a的颗粒对治疗或预防黄斑变性(例如，湿性黄斑变性)、增生型糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼、黄斑水肿、癌症(例如，结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、脑癌)、支气管哮喘、糖尿病、缺血性心肌病和心肌缺血可以是特别有用的。
[0055]
生物分子可以是可溶性血管内皮生长因子受体，如可溶性血管内皮生长因子受体1(可溶性vegfr-1)、可溶性血管内皮生长因子受体2(可溶性vegfr-2)或可溶性血管内皮生长因子受体3(可溶性vegfr-3)。药剂可以是抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分选择性地结合可溶性vegf受体(如培化阿珠单抗(alacizumab)、依库单抗(icrucumab)或雷莫芦单抗(ramucirumab))。药剂可以是vegf受体的配体(如vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d或胎盘生长因子(pgf))。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性vegf受体的颗粒对治疗或预防癌症可以是特别有用的。
[0056]
生物分子可以是表皮生长因子家族的成员，如表皮生长因子(egf)、肝素结合表皮生长因子样生长因子(hb-egf)、转化生长因子-α(tgf-α)、双调蛋白(ar)、上皮调节蛋白(epr)、上皮细胞有丝分裂蛋白抗体、β细胞素(btc)、神经调节素-1(nrg1)、神经调节素-2(nrg2)、神经调节素-3(nrg3)或神经调节素-4(nrg4)。药剂可以是抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分选择性地结合egf、hb-egf、tgf-α、ar、epr、上皮细胞有丝分裂蛋白抗体、btc、nrg1、nrg2、nrg3或nrg4。药剂可以包括可溶性egf受体(如可溶性egf受体、可溶性her2或可溶性her3)。除其他病况和疾病以外，靶向表皮生长因子家族的成员的颗粒对治疗或预防癌症可以是特别有用的。
[0057]
生物分子可以是可溶性表皮生长因子受体(egf受体)(如可溶性egf受体、可溶性人表皮生长因子受体2(可溶性her2)或可溶性人表皮生长因子受体3(可溶性her3))。药剂可以是抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分选择性地结合可溶性egf受体，如西妥昔单抗(cetuximab)、弗图希单抗(futuximab)、英戈土珠单抗(imgatuzumab)、马妥
national academy sciences usa 107(44):18769(2010)))。药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合可溶性人白细胞抗原(hla)蛋白。药剂可以是可溶性杀伤细胞免疫球蛋白样受体。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性hla的颗粒对治疗或预防癌症可以是特别有用的。
[0065]
生物分子可以是可溶性ul16结合蛋白同种型(例如，可溶性raet1(ulbp1；raet1e2)、可溶性raet1h(ulbp2)、可溶性raet1n(ulbp3)、可溶性raet1e(ulbp4)、可溶性raet1g(ulbp5)或可溶性raet1l(ulbp6))。药剂可以是抗体或其抗原结合部分，所述抗体特异性地结合可溶性ul16结合蛋白同种型。药剂可以是可溶性nkg2d受体(参见，例如，pct专利申请公开号wo 2006/024367，其通过引用被整体并入本文)。
[0066]
生物分子可以是可溶性mic-a或可溶性mic-b(参见，例如，groh,v.et al.,nature 419(6908):734(2002))。药剂可以是抗-mic-a抗体或抗-mic-b抗体，或任一抗体的抗原结合部分。药剂可以是可溶性nkg2d受体(参见，例如，pct专利申请公开号wo 2006/024367，其通过引用被整体并入本文)。
[0067]
药剂可以是可溶性天然细胞毒性受体(参见，例如，jarahian,m.et al.plos pathogens 7(8):e1002195(2011))。
[0068]
生物分子可以是可溶性c型凝集素结构域家族2成员d(可溶性clec2d；可溶性凝集素样转录物-1(llt1))(参见，例如，chalan,p.et al.,plos one 10(7):e0132436(2015))。药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合可溶性llt1。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性llt1的颗粒对治疗或预防自身免疫性疾病(如节炎类风湿性关节炎)可以是特别有用的。
[0069]
生物分子可以是可溶性cd16(参见，例如，hoover,r.g.,j clinical investigation 95:241(1995))。药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合可溶性cd16。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性cd16的颗粒对治疗或预防癌症可以是特别有用的。
[0070]
生物分子可以是纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-2)、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶、纤溶酶原、凝血酶或α2-巨球蛋白。药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-2)、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶、纤溶酶原、凝血酶或α2-巨球蛋白。
[0071]
生物分子可以是因子xii、因子xiia、因子xi、因子xia、因子ix、因子ixa、因子x、因子xa、因子vii、因子viia、因子xiii、因子xiiia、因子v、凝血酶原、凝血酶、冯
·
维勒布兰德因子、血栓烷a2、纤维蛋白原或纤维蛋白。药剂可以是抗体，所述抗体选择性地结合至因子xii、因子xiia、因子xi、因子xia、因子ix、因子ixa、因子x、因子xa、因子vii、因子viia、因子xiii、因子xiiia、因子v、凝血酶原、凝血酶、冯
·
维勒布兰德因子、血栓烷a2、纤维蛋白原或纤维蛋白。
[0072]
生物分子可以是丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶、抗胰蛋白酶相关蛋白、α1-抗胰凝乳蛋白酶、人源性激肽释放酶结合蛋白、蛋白质c抑制物、皮质素传递蛋白、甲状腺素结合球蛋白、血管紧张素原、centerin(gcet1)、蛋白质z相关蛋白酶抑制物、丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗凝血酶、肝素辅因子ii、纤溶酶原激活物抑制剂1、胶质源性连接素(蛋白酶连结素i)、色素上皮细胞衍生因子、α2-抗纤维蛋白溶酶、补体1-抑制物、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂、2serpina1或serpina2)。药剂可以包括抗体或其抗原结合部分，所述抗体选择性地结合丝氨酸蛋白酶抑制剂。
[0073]
生物分子可以是可溶性st2。药剂可以是白介素33或特异性地结合可溶性st2(或
其片段)的抗体。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性st2的颗粒对治疗或预防心脏病、心肌梗死、急性冠脉综合征和心力衰竭可以是特别有用的。
[0074]
生物分子可以是肌肉生长抑制素(生长分化因子8(gdf-8))。药剂可以是抗肌肉生长抑制素抗体(如司他芦单抗(stamulumab)或trevogrumab)。药剂可以是激活素受体或其肌肉生长抑制素结合部分，例如，药剂可以是可溶性激活素iib型受体。除其他疾病和病况以外，靶向肌肉生长抑制素的颗粒对治疗肌营养不良、恶病质、肌肉减少症和各种形式的肌肉损失(如零重力肌肉损失)可以是特别有用的。
[0075]
生物分子可以是饥饿素。药剂可以是抗饥饿素抗体。靶向饥饿素的颗粒对治疗或预防肥胖症、普-威综合征、成瘾、酒精中毒和瘦素抵抗(例如，遗传瘦素抵抗)可以是特别有用的。
[0076]
生物分子可以是slr11(可溶性sorl1；可溶性sorla；可溶性sorla1)。药剂可以是抗-slr11抗体。除其他疾病和病况以外，靶向slr11的颗粒对治疗或预防肥胖症可以是特别有用的。
[0077]
生物分子可以是tgf-β(转化生长因子β，例如tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3)。药剂可以是抗-tgf-β抗体(如非苏木单抗(fresolimumab)、乐地单抗(lerdelimumab)或美替木单抗(metelimumab))。药剂可以包括tgf-β受体的tgf-β结合结构域。药剂可以是ltbp1(组织内转化生长因子β结合蛋白1)、14-3-3-蛋白ε(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，ε；ywhae)或真核细胞翻译起始因子3亚基i(eif3i)，其各自结合至tgf-β。除其他疾病和病况以外，靶向tgf-β的颗粒对治疗或预防硬皮病、特发性肺纤维化、肾脏疾病、局灶性节段性肾小球硬化、圆锥形角膜、马凡综合征、阿尔茨海默病、认知减退、外伤性脑损伤、肌肉萎缩和癌症(例如，肾肿瘤和黑色素瘤)可以是特别有用的。
[0078]
生物分子可以是wnt(例如，wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11、或wnt16)。药剂可以是抗-wnt抗体。除其他疾病和病况以外，靶向wnt的颗粒对治疗或预防肥胖症、ii型糖尿病、动脉粥样硬化、钙化性主动脉瓣狭窄、心脏病发作、心力衰竭、中风和癌症(例如，乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤或卵巢癌)可以是特别有用的。
[0079]
生物分子可以是可溶性notch配体(例如，可溶性jagged1、可溶性jagged2、可溶性delta样配体1(dll1)、可溶性delta样配体3(dll3)和delta样配体4(dll4))。药剂可以是抗-notch配体抗体(如登西珠单抗(demcizumab)或艾诺提克单抗(enoticumab))或可溶性notch受体(例如，可溶性notch1、notch2、notch3或notch4)或其变体。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性notch配体的颗粒对治疗或预防动脉粥样硬化、钙化性主动脉瓣狭窄、心脏病发作、心力衰竭、中风和癌症(例如，乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌和实体瘤)可以是特别有用的。
[0080]
生物分子可以是可溶性notch受体(例如，可溶性notch1、notch2、notch3或notch4)。药剂可以是抗-notch受体抗体(如他瑞妥单抗(tarextumab)或布隆妥珠单抗(brontictuzumab))或可溶性notch配体。除其他疾病和病况以外，靶向可溶性notch受体的颗粒对治疗或预防动脉粥样硬化、钙化性主动脉瓣狭窄、心脏病发作、心力衰竭、中风和癌症(例如，乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌和实体瘤)可以是特别有用的。
[0081]
靶标可以是羟磷灰石或钙(例如，结晶钙)。药剂可以是螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、硫代硫酸钠(sts)、六磷酸肌醇或柠檬酸)。除其他疾病和病况以外，靶向羟磷灰石或钙的颗粒对治疗或预防动脉粥样硬化、钙化性主动脉瓣狭窄和钙化性肌腱炎可以是特别有用的。
[0082]
在一些实施方案中，生物分子是自身抗体。自身抗体是由受试者产生的抗体，所述抗体特异性地结合受试者产生的抗原。自身抗体与许多不同的疾病状态(包含狼疮)有关。此外，新的自身抗体的诱导可以与治疗性干预有关，例如，引起药物诱导的狼疮。因此，包括多个颗粒的组合物可以用于，例如，治疗或预防狼疮(例如，药物诱导的狼疮)的方法中，其中所述多个颗粒包括选择性地结合一个或更多个自身抗体的药剂。生物分子可以是，例如，双链dna自身抗体或抗-核自身抗体。
[0083]
靶向自身抗体的颗粒可以包括药剂，所述药剂是自身抗体的抗原。
[0084]
生物分子可以是抗-β肾上腺素受体自身抗体或抗-m2毒蕈碱受体自身抗体，例如，用于预防或治疗特发性扩张型心肌病。特别地，靶向抗-β肾上腺素受体自身抗体或抗-m2毒蕈碱受体自身抗体的颗粒可以被施用至患有恰加斯氏病的受试者，其与这样的自身抗体的诱导相关(参见，例如，herda,l.r.et al.,br j pharmacol 166(3)847(2012))。生物分子可以是抗-α-1-肾上腺素能受体自身抗体，例如，用于治疗或预防高血压(参见，例如，luther,h.p.et al.,hypertension 29(2):678(1997))。生物分子可以是抗-毒蕈碱3型受体自身抗体，例如，用于治疗或预防斯耶格伦氏综合症(参见，例如，lee,b.h.et al.,plos one 8(1):e53113(2013))。
[0085]
例如，通过可逆地结合至激素和细胞因子，针对激素和细胞因子的自身抗体可以缓冲它们的浓度，以控制游离的活性物质的浓度。与健康的自身抗体水平的偏差可以带来由细胞因子或激素体内平衡的丧失引起的疾病。例如，抗-ifnγ自身抗体可以诱导播散性非结核分枝杆菌感染，抗-il-17自身抗体与慢性粘膜念珠菌病的发展有关，并且抗-il-6自身抗体与严重的葡萄球菌感染或链球菌感染有关。饥饿激素饥饿素的自身抗体可以调整可用于结合至饥饿素受体ghsr1的饥饿素的有效浓度。
[0086]
在一些实施方案中，生物分子是自身抗体。例如，自身抗体可以是抗-ifnγ、抗-il-17、抗-il-6或抗-饥饿素自身抗体。在一些实施方案中，药剂是自身抗体的天然配体(例如，被自身抗体靶向的抗原)。例如，药剂可以是ifnγ、il-17、il-6或饥饿素。在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有细胞因子调节异常疾病(如自身免疫性疾病)的患者的方法。在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有代谢紊乱(如肥胖症)的患者的方法。
[0087]
结合至激活素iib型受体actriib的激活素导致恶病质模型中的肌肉萎缩。血清中过量的激活素水平与恶病质模型中的肌肉萎缩和纤维化有关，这可以被阻断激活素a和b/actriib信号传导的抗体逆转，并且在癌症患者的血清中发现升高的激活素水平。肌肉减少症是衰老中肌肉质量丧失的渐进病况，并且也与过量的激活素信号传导有关。因此，生物分子可以是激活素(例如，激活素a或激活素b)。药剂可以是激活素的天然配体(如激活素受体蛋白(如actriib)或其变体)或抗激活素的抗体。药剂可以是肌肉生长抑制素。在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有肌肉萎缩疾病(如恶病质或肌肉减少症)的患者的方法。
[0088]
本领域技术人员也将会理解本文中描述的颗粒对于清除更多种类的靶标也是有用的，所述靶标的生物活性可以是，例如，不期望的。例如，颗粒可以被设计以结合至病毒壳
体或包膜的组分，从而从受试者的血液中隔离病毒。在一些实施方案中，颗粒可以被设计在受试者的循环中结合并隔离毒素(例如，细菌毒素、植物毒素和动物毒素(如蛇毒的一种或更多种组分))。在一些实施方案中，颗粒可以被设计结合至并从受试者的循环中隔离小分子(例如，精神活性药物或小分子毒素)。在这样的实施方案中，颗粒对于从身体去除毒素(例如，在被蛇或昆虫咬伤之后)可以是有用的。在一些实施方案中，颗粒可以用于在受试者中治疗、预防、延缓过敏性休克的发作或降低过敏性休克的严重性(例如，通过清除引起过敏性免疫应答的抗原)。
[0089]
在一些实施方案中，靶标与病毒(例如，被药剂结合的病毒结构蛋白(如病毒壳体或病毒包膜蛋白))有关。在这样的实施方案中，颗粒可用作抗病毒疗法，例如，用于被感染病毒或有被感染病毒的风险的受试者。病毒可以是包膜病毒或非包膜病毒。
[0090]
在一些实施方案中，可溶性生物分子是小分子或大分子。在一些实施方案中，可溶性生物分子的最长线度不大于600nm(例如，小于550nm、500nm、450nm、400nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、50nm或25nm)。例如，生物分子可以具有约至约1μm的分子半径，如约至约100nm、约至约20nm、约1nm至约1μm、约1nm至约100nm或约1nm至约20nm。生物分子可以具有约3amu至约107amu的分子量，如约100amu至约107amu、约3amu至约106amu、约3amu至约105amu、约100amu至约106amu或约400amu至约106amu。生物分子可以具有约105amu至约107amu的分子量。
[0091]
术语“特异性的结合”、“特异性地结合”、“选择性的结合”、“选择性地结合”和类似符合语法规则的术语，如本文中使用的，是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。典型地，当缔合常数(ka)高于106m-1
s-1
时，结合被认为是特异性的。因此，特异性的结合对的第一构件可以以至少(或大于)106m-1
s-1
(例如，至少或大于107m-1
s-1
、108m-1
s-1
、109m-1
s-1
、10
10
m-1
s-1
、10
11
m-1
s-1
、10
12
m-1
s-1
、10
13
m-1
s-1
、10
14
m-1
s-1
或10
15
m-1
s-1
或更高)的ka特异性地结合至结合对的第二构件。在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于或等于10-3
s-1
(例如，8
×
10-4
s-1
、5
×
10-4
s-1
、2
×
10-4
s-1
、10-4
s-1
或10-5
s-1
)的解离常数(kd)。
[0092]
特异性的结合不是指主要由非特异性的静电相互作用或非特异性的疏水相互作用驱动的相互作用，其可以具有有利的缔合常数。例如，带负电荷的核酸可以以有利的缔合常数结合至阳离子颗粒，而不依赖于特异性的相互作用，并且这样的结合不是如本文中定义的“特异性的结合”。类似地，脂质可以以有利的缔合常数结合至疏水性颗粒，而不依赖于特异性的相互作用，并且这样的结合不是如本文中定义的“特异性的结合”。
[0093]
在一些实施方案中，生物分子和颗粒在生理ph(～7.4)具有相同的电荷。例如，生物分子可以具有负电荷，并且颗粒可以具有负电荷，或生物分子可以具有正电荷，并且颗粒可以具有正电荷。在一些实施方案中，生物分子和颗粒在生理ph具有相反的电荷。例如，生物分子可以具有正电荷，并且颗粒可以具有负电荷，或生物分子可以具有负电荷，并且颗粒可以具有正电荷。在一些实施方案中，生物分子在生理ph具有中性电荷和/或颗粒在生理ph具有中性电荷。
[0094]
生物分子可以具有约0至约14的等电点。核酸具有约4至约7的等电点，并且因此，生物分子可以具有约4至约7的等电点。蛋白质通常具有约4至约10的等电点，并且因此，生物分子可以具有约4至约10的等电点。不过，未修饰的肽和蛋白质可以具有范围从约2.5(基于天冬氨酸；pi～2.8)至约11(基于精氨酸；pi～11)的等电点，尽管等电点落在此范围之外
的蛋白质是已知的。相应地，生物分子可以具有范围从约2.5至约11的等电点。分泌蛋白和膜蛋白的可溶性胞外部分通常在生理ph具有轻微的负电荷，并且因此，生物分子可以具有约4至约7(如约4至约6)的等电点。生物分子可以具有约0至约4、约2至约6、约4至约8、约6至约10、约8至约12或约10至约14的等电点。生物分子具有约0至约2、约1至约3、约2至约4、约3至约5、约4至约6、约4至约6、约5至约7、约6至约8、约7至约9、约8至约10、约9至约11、约10至约12、约11至约13或约12至约14的等电点。
[0095]
在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m或10-12
m的kd。平衡常数kd是动力学速率常数的比率，即kd/ka。在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于1
×
10-9
m的kd。
[0096]
如本文中使用的，当涉及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触(例如，结合)。通常，这样的相互作用导致所述分子中的一个或两个的活性(所述活性产生生物学效应)。抑制这样的相互作用导致参与相互作用的一个或更多个分子的活性的破坏。
[0097]
如本文中使用的，术语“抑制”及其符合语法规则的对等词是指特定作用、功能或相互作用的降低、限制和/或阻断。在一个实施方案中，所述术语是指降低给定输出或参数的水平至至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或小于相应对照中的量的量(例如，特异性的结合对的两个构件之间的相互作用的背景水平)。给定输出或参数的降低的水平无需(尽管其可能)意味着输出或参数的绝对不存在。本发明不要求并且不限于完全消除输出或参数的方法。很大程度的抑制可以是，例如两个生物分子(例如，结合对的第一和第二构件)之间的相互作用的至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更大)的抑制。
[0098]
用于检测相互作用或测量一个生物分子对另一个生物分子的亲和性的方法是本领域已知的。例如，两个生物分子的结合可以使用多种技术(如，但不限于，生物膜层干涉(bli)、蛋白质印迹、点渍印迹、表面等离子体共振法(spr)、酶联免疫吸附测定(elisa)、或测定或基于质谱法的方法)被检测和/或被定量。
[0099]
在一些实施方案中，可以使用本领域已知的用于表征两个生物分子的相互作用的动力学参数的任何基于spr的测定来测定结合。包含，但不限于biacore仪器(biacore ab；瑞典乌普萨拉)、lasys仪器(affinity sensors；马萨诸塞州富兰克林)、ibis系统(windsor scientific limited；英国柏克斯郡)、spr-cellia系统(nippon laser and electronics lab；日本北海道)和spr检测器spreeta(texas instruments；德克萨斯州达拉斯)的任何商业可获得的spr仪器可被用于本文中描述的方法中。(参见，例如，mullett et al.,methods 22:77-91(2000)；dong et al.,reviews in mol biotech 82:303-323(2002)；fivash et al.,curr opin biotechnol 9:97-101(1998)；和rich et al.,curr opin biotechnol 11:54-61(2000))。
[0100]
在一些实施方案中，可以在octet(fortebio inc.)上使用bli测定两个生物分子之间的生物分子相互作用。bli是一种无标记的光学分析技术，所述光学分析技术通过实时测量生物传感器末梢上的蛋白质层的厚度变化来感测被固定在生物传感器末梢上的配体与溶液中的分析物之间的结合。
[0101]
在一些实施方案中，alphascreen(perkinelmer)测定可被用于表征两个生物分子
的结合。首字母缩略词alpha代表放大化学发光亲和均相测定(amplified luminescent proximity homogeneous assay)。alphascreen是一种基于珠的亲和测定，所述测定通过测量供体和受体珠之间的能量转移产生的信号来感测附连于供体和受体珠的分子之间的结合。(参见，例如，eglen et al.,curr chem genomics 1:2-10(2008))。
[0102]
在一些实施方案中，(perkinelmer)测定可用于表征两个生物分子的结合。alphalisa从上述的alphascreen测定改造为包含含铕受体珠并且用作传统elisa测定的替代。(参见，例如，eglen et al.,curr chem genomics 1:2-10(2008))。
[0103]
可以使用各种各样的免疫测定技术，包含竞争的或非竞争的免疫测定。术语“免疫测定”包含技术，所述技术包含，但不限于流式细胞术、facs、酶免疫测定(eia)(如酶多种免疫测定技术(emit)、酶联免疫吸附测定(elisa)、igm抗体捕捉elisa(mac elisa)和微颗粒酶免疫测定(meia))、以及毛细管电泳免疫测定(ceia)、放射免疫测定(ria)、免疫放射测定(irma)、荧光偏振免疫测定(fpia)和化学发光测定(cl)。如果需要的话，这样的免疫测定可以是自动化的。免疫测定也可以与激光诱导荧光结合使用。脂质体免疫测定(如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器)也适合用于本发明。此外，散射比浊测定(其中，例如，生物分子复合物的形成导致增加的光散射，所述光散射作为标志物浓度的函数被转换为峰值速率信号)适合于用于本发明的方法。在本发明的优选实施方案中，温育产物通过elisa、ria、荧光免疫测定(fia)或可溶性颗粒免疫测定(spia)被检测。
[0104]
在一些实施方案中，可以使用热变性方法(涉及差示扫描荧光测定法(dsf)和差分静态光散射(dsls))测定两个生物分子的结合。
[0105]
在一些实施方案中，可以使用基于质谱的方法(如，但不限于，亲和性选择耦合至质谱(as-ms)的平台)测定两个生物分子的结合。这是一种无标记的方法，其中蛋白质和测试化合物被温育，未结合的分子被洗掉，并通过ms分析蛋白质-配体复合物以在解络步骤后进行配体鉴定。
[0106]
在一些实施方案中，可以使用，例如，可检测地标记的蛋白质(如，放射性标记的(例如，
32
p、
35
s、
14
c或3h)、荧光标记的(例如，fitc)或酶促标记的生物分子)，通过免疫测定或通过色谱检测来定量两个生物分子的结合。
[0107]
在一些实施方案中，本发明预期了荧光偏振测定和荧光共振能量转移(fret)测定在直接地或间接地测量两个生物分子之间的相互作用的程度的用途。
[0108]
ii.颗粒
[0109]
如本文中使用的，术语“颗粒”是指可以包括任何材料(如氧化铝、金属(例如，金或铂)、玻璃、二氧化硅、乳胶、塑料、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或任何聚合材料)并且可以为任何尺寸或形状的小团块(small mass)。在一些实施方案中，颗粒或多个颗粒包括硅。(参见，例如，国际专利申请公开号wo 2013/011764、wo 2013/029278和wo 2014/151381以及美国专利申请公开号2014/0271886，其中的每个的公开内容通过引用被整体并入本文)。在一些实施方案中，颗粒包括淀粉或由淀粉组成(参见，例如，国际专利申请公开号wo 2010/084088)。在一些实施方案中，颗粒或多个颗粒由核酸(例如，天然存在的或非天然存在的核酸)组成。用于制作这样的基于核酸的微观结构的方法是本领域已知的，并且在，例如，douglas et al.,nucl acids res 37(15):5001-5006(2009)；douglas et al.,nature 459(7245):414-428(2009)；voigt et al.,nat nanotechnol 5(3):200-203(2010)；和
endo et al.,curr protoc nucleic acid chem chapter 12(unit 12.8)(2011)中被描述。
[0110]
在优选的实施方案中，颗粒不溶于水性溶液(例如，颗粒可以不溶于水、血清、血浆、细胞外液和/或间质液)。例如，可以通过例如以足以从细胞悬液的水性溶液中分离细胞悬液的细胞的速度离心包括颗粒的溶液，从水性溶液中分离颗粒。不过，颗粒可以作为水性溶液中的悬浮物而容易地存在，例如，水性溶液中的多个颗粒的轻微摇动或涡旋足以使颗粒悬浮在溶液中。在一些实施方案中，颗粒不是水凝胶。在一些实施方案中，颗粒不包括水凝胶。在一些实施方案中，颗粒不包括聚合物。
[0111]
颗粒优选足够大以结合至多于一个生物分子，并且抑制多于一个结合的生物分子与结合配偶体的相互作用。例如，颗粒可以是约50nm至约10μm。颗粒的尺寸可以是1μm至5μm、1.2μm至4μm、1.5μm至4μm或2μm至4μm。
[0112]
具有小于300nm(如小于200nm或小于150nm)的尺寸的颗粒对于其中颗粒意图进入和/或离开受试者的脉管系统(如可以通过皮下注射施用的颗粒)的应用是优选的。不过，对于其中颗粒不意图进入脉管系统的方法，较大的颗粒同样非常适合于皮下注射。具有约1μm至约5μm的尺寸的颗粒对于其中颗粒意图在受试者的脉管系统内循环(例如，在静脉内施用之后)的应用是优选的。具有大于5μm的尺寸的颗粒对于其中颗粒意图驻留在其被植入的位置处(如在肿瘤内或邻近肿瘤)的应用是优选的；然而，小于5μm的颗粒也可以适合于植入。任何尺寸的颗粒都可以被用于体外应用。
[0113]
本文的特征也在于颗粒的收集。在一些实施方案中，多个颗粒具有窄的或宽的多分散性。如本文中使用的，“多分散性”是指特定颗粒群体内颗粒的尺寸范围。也就是说，极度多分散的群体可能涉及具有，假设，1μm的平均尺寸的颗粒，其中单个颗粒从0.1μm至4μm变化。在一些实施方案中，“窄的多分散性”是优选的。也就是说，给定特定的平均颗粒尺寸，本技术优选的是群体中的单个颗粒与平均颗粒尺寸的差异不超过
±
20％，优选地不超过
±
15％，并且在本技术中最优选地不超过
±
10％。更具体地，颗粒群体优选地具有约0.5μm至约2μm的平均颗粒尺寸，更优选地在本技术中为从约0.8至约1.5μm。因此，如果选择1μm的平均颗粒尺寸，群体中的单个颗粒将最优选地在从约0.8μm至约1.2μm的范围内。在一些实施方案中，颗粒群体具有约0.3μm至约1μm的平均颗粒尺寸，例如，约0.4μm至约0.9μm、约0.5μm至约0.9μm、约0.4μm至约0.8μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.3μm至约0.9μm或约0.3μm至约0.7μm。在一些实施方案中，颗粒群体具有约1μm至约10μm(例如，约1.1μm至约4.8μm、约1.2μm至约4.6μm、约1.4μm至约4.4μm、约1.6μm至约4.2μm、约1.8μm至约4.0μm，或约2.0μm至约3.8μm)的平均颗粒尺寸。
[0114]
在一些实施方案中，本公开的特征在于具有确定的平均颗粒尺寸的一些或多个颗粒。如本文中使用的，通过测量单个颗粒的尺寸，然后除以颗粒的总数来获得“平均颗粒尺寸”。平均颗粒尺寸的测定是本领域公知的。典型地，颗粒的最长平均线度不大于4μm。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度不大于3.9μm(例如，不大于3.8μm、3.7μm、3.6μm、3.5μm、3.4μm、3.3μm、3.2μm、3.1μm、3.0μm、2.9μm、2.8μm、2.7μm、2.6μm、2.5μm、2.4μm、2.3μm、2.2μm、2.1μm、2μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm、1.6μm、1.5μm、1.4μm、1.3μm、1.2μm、1.1μm或1μm)。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度不大于2.5μm、2μm、1.5μm或1.25μm。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度为至少1μm，但不大于4μm。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线
度为至少1μm，但不大于2μm。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度为至少1μm，但不大于1.5μm。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度为至少0.5μm(例如，至少0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm或1.5μm)，但不大于4μm(例如，不大于3.9μm、3.8μm、3.7μm、3.6μm、3.5μm、3.4μm、3.3μm、3.2μm、3.1μm、3.0μm、2.9μm、2.8μm、2.7μm、2.6μm、2.5μm、2.4μm、2.3μm、2.2μm、2.1μm、2μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm或1.6μm)。
[0115]
在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒。在一些实施方案中，颗粒的最长平均线度不大于900nm(例如，850nm、800nm、750nm、700nm、650nm、600nm、550nm、500nm、450nm、400nm、450nm、400nm、350nm、300nm、250nm、200nm或150nm)。在一些实施方案中，颗粒被确定形状和尺寸以在受试者(例如人类受试者)的血液或脉管系统(例如动脉、静脉和毛细血管)中循环。示例性颗粒设计在图1至6中阐述。
[0116]
在一些实施方案中，颗粒的最长线度为约50nm至约5μm(如约100nm至约4.5μm、约200nm至约4μm、约300nm至约3.5μm、约300nm至约μm，或约400nm至约3μm)。在一些实施方案中，颗粒的最短线度为至少约300nm(如约300nm至约4μm或约400nm至约3μm)。
[0117]
在一些实施方案中，多个颗粒是多面体的，例如，立方的。在一些实施方案中，多个颗粒是球形的。在一些实施方案中，本文中描述的任何颗粒可以是多孔的。这样的多孔颗粒包括外表面和所述颗粒的孔的多个内表面。药剂可以，例如，被固定在所述多个内表面上。在一些实施方案中，多个孔具有至少50nm的横截面线度。在一些实施方案中，多个孔具有至少100nm的横截面线度。例如美国专利申请公开号20140199352、20080277346和20040105821已经描述了多孔纳米颗粒，其中的每个的公开内容通过引用被整体并入本文。例如美国专利号8,778,830和8,586,096已经描述了球形颗粒，其中的每个以引用方式被并入本文。
[0118]
在一些实施方案中，球形颗粒还可以包括从颗粒的球形表面延伸的两个相交的脊，其中每个结构的最长线度不大于4μm(例如，不大于3.9μm、3.8μm、3.7μm、3.6μm、3.5μm、3.4μm、3.3μm、3.2μm、3.1μm、3.0μm、2.9μm、2.8μm、2.7μm、2.6μm、2.5μm、2.4μm、2.3μm、2.2μm、2.1μm、2μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm、1.6μm、1.5μm、1.4μm、1.3μm、1.2μm、1.1μm或1μm)，并且其中脊被确定尺寸并且被定向：(i)以抑制被固定在球形颗粒的表面上的药剂结合至或激活细胞表面受体蛋白，和/或(ii)当可溶性生物分子被结合至药剂时，以抑制可溶性生物分子与特异性的结合对的第二构件的相互作用，其中可溶性生物分子是特异性的结合对的第一构件。
[0119]
在一些实施方案中，多个颗粒是环形的。在这样的实施方案中，药剂可以被固定在颗粒的内周表面上(例如，在洞周围，参见图2)。在一些实施方案中，颗粒的直径不大于4μm(例如，3.9μm、3.8μm、3.7μm、3.6μm、3.5μm、3.4μm、3.3μm、3.2μm、3.1μm、3.0μm、2.9μm、2.8μm、2.7μm、2.6μm、2.5μm、2.4μm、2.3μm、2.2μm、2.1μm、2μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm、1.6μm、1.5μm、1.4μm、1.3μm、1.2μm、1.1μm或1μm)。在一些实施方案中，颗粒的直径不大于900nm(例如，850nm、800nm、750nm、700nm、650nm、600nm、550nm、500nm、450nm、400nm、350nm、300nm、200nm或150nm)。
[0120]
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒是树枝状的。例如，du et al.,small 11(4):392-413(2015)；siegwart,d.j.et al.,proceedings national academy sciences usa 108(32):12996(2011)；美国专利号5,814,272和7,932,311以及美国专利申请公开号
no.20040166166中描述了这样的颗粒，其中的每个的公开内容以引用方式被并入本文。如下文详述的，在一些实施方案中，树枝状颗粒的几何结构是这样以致于被固定在颗粒的内表面上的药剂具有降低或大幅度降低的与细胞表面上的生物分子相互作用的能力，和/或通过药剂被结合至颗粒的可溶性生物分子具有降低或大幅度降低的与其同源配体(特异性的结合对的第二构件)相互作用的能力。
[0121]
在一些实施方案中，多个颗粒是多面体的，例如八面体的或二十面体的(参见，例如，图3)，无论是规则的还是不规则的。颗粒可以包括至少一个来自所述颗粒的顶点中的至少一个的凸起(参见，例如，图3)。颗粒可以包括多于一个(例如2、3、4、5、6、7或8或更多个)的来自所述颗粒的顶点的凸起。这样的凸起可以是，例如，被确定尺寸和/或被定向的：(i)以抑制被固定在球形颗粒的表面上的药剂结合至或激活细胞表面受体蛋白和/或(ii)当可溶性生物分子被结合至药剂时，以抑制可溶性生物分子与特异性的结合对的第二构件的相互作用，其中生物分子是特异性的结合对的第一构件。
[0122]
颗粒可以包括孔隙空间，在本文中被称为“孔隙”或“多个孔隙”。孔隙是被流体(例如，液体(其可以包括生物分子)或气体(如当颗粒是干燥的时))或被空的空间(例如，当颗粒处于真空时，如冻干之后)填充的颗粒中的空间。颗粒的孔隙体积可以包含，例如，颗粒的孔体积和/或中空芯/壳颗粒、管的内腔、圆环或环的内部体积。
[0123]
在一些实施方案中，例如，当颗粒位于受试者的脉管系统中时，颗粒被配置使得血浆可以自由地进入和/或离开颗粒的孔隙空间。在一些实施方案中，例如，当颗粒位于受试者的脉管系统中时，颗粒被配置使得血清可以自由地进入和/或离开颗粒的孔隙空间。在优选的实施方案中，颗粒被配置使得血细胞不能进入颗粒的孔隙空间。在一些实施方案中，颗粒被配置使得血小板不能进入颗粒的孔隙空间。不过，例如，当颗粒被配置用于体外或当颗粒被配置以结合病毒、细菌、原生生物、真菌或酵母细胞或其他大靶标(如尺寸从约100nm到约2μm的靶标)时，颗粒可以允许血小板进入其孔隙空间。
[0124]
在一些实施方案中，颗粒被配置使得细胞外液可以自由地进入和/或离开颗粒的孔隙空间。在一些实施方案中，颗粒被配置使得间质液可以自由地进入和/或离开颗粒的孔隙空间。在一些实施方案中，颗粒被配置使得脑脊液可以自由地进入和/或离开颗粒的孔隙空间。
[0125]
颗粒中的孔隙空间的体积优选足够大以容纳多于一个生物分子，例如，颗粒的总孔隙体积优选足够大以容纳结合至颗粒的每个生物分子。不过，只要颗粒能够抑制每个结合的生物分子与包含每个生物分子的结合对的第二构件之间的相互作用，孔隙可以小于每个结合的生物分子的总体积。例如，颗粒可以仅需要隔离生物分子的结合位点以抑制生物分子与结合对的第二构件之间的相互作用，并且这样的颗粒可以含有孔隙体积，所述孔隙体积容纳每个生物分子的结合位点，但允许一个或更多个生物分子的其他部分从孔隙空间向外突出。
[0126]
在一些实施方案中，颗粒可以包括约5％至约95％的孔隙空间。包括凸起的颗粒可以包括很少的孔隙空间或没有孔隙空间，例如，因为凸起可以抑制结合的生物分子与结合对的第二构件之间的相互作用。包括管的颗粒可以包括大量的孔隙空间，例如，因为管可以包括相对于管壁厚度的大的内部体积。不过，具有相似几何形状的颗粒的孔隙体积可以包括不同量的孔隙体积，例如，包括相同厚度的壁的管可以根据管直径在孔隙体积百分比中
al.,j.am.chem.soc.131(32):11361
–
11370(2009)和guan,b.et al.,langmuir,27(1):328
–
334(2011)，其中的每个以引用方式被整体并入本文)。进一步地，这样的方法通常适用于本文所描述的任何颗粒的制造。
[0134]
孔尺寸可以被预先选择为药剂和靶标生物分子的尺寸特性，以控制生物分子的释放。典型地，太小的孔尺寸妨碍药剂的装载和/或生物分子的结合。例如，材料的平均孔径可以选自针对高分子量分子(例如，200,000-500,000amu)的较大的孔(例如，15nm至40nm)和针对较低分子量的分子(例如，10,000-50,0000amu)的较小的孔(例如，2nm至10nm)。例如，直径约6nm的平均孔尺寸可以适合于分子量为约14,000至15,000amu(如约14,700amu)的分子。分子量约为45,000至50,000amu(如约48,000amu)的分子可以选择直径约10nm的平均孔尺寸。分子量约为150,000nm的分子可以选择直径约25-30nm的平均孔尺寸。
[0135]
孔尺寸可以被预先选择以适应药剂或生物分子的分子半径。例如，直径约25nm至约40nm的平均孔尺寸可以适合于具有从约6nm至约8nm的最大分子半径的分子。分子半径可以通过任何合适的方法(如通过使用基于x射线晶体学数据的分子的物理线度或使用代表分子的溶液状态尺寸的流体动力学半径)计算。由于溶液状态计算取决于进行计算的溶液的性质，一些测量可能优选使用基于x射线晶体学数据的分子的物理线度。如本文中使用的，最大分子半径反映了治疗剂的最大线度的一半。
[0136]
在某些实施方案中，平均孔径被选择以限制孔内分子(例如，蛋白质)的聚集。阻止生物分子(如蛋白质)在载体材料中聚集将是有利的，因为聚集被认为阻碍分子受控释放至生物系统中。因此，由于孔尺寸和生物分子的尺寸之间的关系，允许，例如在任何一个时间仅一个生物分子进入孔的孔，将比允许多个生物分子一起进入孔并在孔内聚集的孔更为优选。在某些实施方案中，多个生物分子可以被装载到孔中，但是由于孔的深度，分布遍及整个孔深度的蛋白质将以较小的程度聚集。
[0137]
iv.包括至少一个管的颗粒
[0138]
在一些实施方案中，颗粒包括至少一个管。在优选的实施方案中，至少一个管包括一个开口端或两个开口端。
[0139]
术语“管”是指三维形状，所述三维形状具有沿着轴(例如，笛卡儿空间中的一维轴)的长度以及沿着所述形状的长度的内部腔、管腔、孔隙或储存器。在一些实施方案中，沿着管的轴的垂直横截面具有大体上相同的形状和/或尺寸。如涉及管所使用的，术语“横截面”是指垂直于管的轴的二维横截面。较大的结构可以包括管。例如，注射器包括管，但是管不包括注射器柱塞。颗粒或其他物体可以包括多于一个的管。例如，注射器可以包括对应于注射器针头和注射器筒，或对应于双注射器的平行筒(例如，用于环氧树脂组合物)的两个管。
[0140]
管可以具有直径，所述直径是垂直于管的轴的线段的平均长度，其中每条线段由管的外表面上的两个点界定。管可以具有宽度和高度，其中管的宽度是由管的外表面上的两个点限定的最长的线段，所述线段垂直于管的轴，并且管的高度是由管的外表面上的两个点限定的线段，所述线段垂直于管的轴和限定管的宽度的线段。
[0141]
管可以具有内部直径，所述内部直径是垂直于管的轴的线段的平均长度，其中每条线段由管的内表面上的两个点界定。管可以具有内部宽度和内部高度，其中管的内部宽度是由管的外表面上的两个点限定的最长的线段，所述线段垂直于管的轴，并且管的内部
高度是由管的外表面上的两个点限定的线段，所述线段垂直于管的轴和限定管的宽度的线段。
[0142]
管可以是大体上圆柱形的。管可以具有大体上圆形的横截面。管的横截面可以可以是椭面(如圆形)。
[0143]
管的横截面可以是多边形(如规则多边形)。管的横截面可以是三角形(如等边三角形)。管的横截面可以是四边形(如规则四边形、长方形或正方形)。管的横截面可以是五边形(如规则五边形)。管的横截面可以是六边形(如规则六边形)。管可以是三角管、四角管、五角管、六角管、七角管或八角管。
[0144]
管的长度可以是约5nm至约5μm(如约5nm至约4μm、约5nm至约3μm、约5nm至约2μm或约5nm至约1μm)。管的长度可以是约50nm至约5μm(如约50nm至约4μm、约50nm至约3μm、约50nm至约2μm或约50nm至约1μm)。管的长度可以是约100nm至约5μm(如约100nm至约4μm、约100nm至约3μm、约100nm至约2μm或约100nm至约1μm)。管的长度可以是约300nm至约5μm(如约300nm至约4μm、约300nm至约3μm、约300nm至约2μm或约300nm至约1μm)。管的长度可以是约500nm至约5μm(如约500nm至约4μm、约500nm至约3μm、约500nm至约2μm或约500nm至约1μm)。
[0145]
管的直径、宽度和/或高度可以是约5nm至约5μm(如约5nm至约4μm、约5nm至约3μm、约5nm至约2μm、约5nm至约1μm、约5nm至约900nm、约5nm至约800nm、约5nm至约700nm、约5nm至约600nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm或约5nm至约100nm)。管的直径、宽度和/或高度可以是约50nm至约5μm(如约50nm至约4μm、约50nm至约3μm、约50nm至约2μm、约50nm至约1μm、约50nm至约900nm、约50nm至约800nm、约50nm至约700nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约400nm、约50nm至约300nm、约50nm至约200nm或约50nm至约100nm)。
[0146]
管的内部直径、内部宽度和/或内部高度优先足够大以容纳药剂和生物分子。管的内部直径、内部宽度和/或内部高度优先足够小以抑制细胞进入管的内部(例如，有核的真核细胞(如有核的人细胞或二倍体人细胞))。管的内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约5nm至约4μm(如约5nm至约3μm、约5nm至约2μm、约5nm至约1μm、约5nm至约900nm、约5nm至约800nm、约5nm至约700nm、约5nm至约600nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm或约5nm至约100nm)。管的内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约20nm至约4μm(如约20nm至约3μm、约20nm至约2μm、约20nm至约1μm、约20nm至约900nm、约20nm至约800nm、约20nm至约700nm、约20nm至约600nm、约20nm至约500nm、约20nm至约400nm、约20nm至约300nm、约20nm至约200nm或约20nm至约100nm)。管的内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约40nm至约4μm(如约40nm至约3μm、约40nm至约2μm、约40nm至约1μm、约40nm至约900nm、约40nm至约800nm、约40nm至约700nm、约40nm至约600nm、约40nm至约500nm、约40nm至约400nm、约40nm至约300nm、约40nm至约200nm或约40nm至约100nm)。
[0147]
在某些优选的实施方案中，颗粒包括多个管。多个管中的每个管可以是基本上平行的。在一些实施方案中，多个管中的至少两个管不是平行的。在一些实施方案中，多个管中没有一个管是平行的。管可以被布置成不同于平行的配置，以将开口分布到颗粒的不同面上的管上，或以允许颗粒在流(例如，层流或湍流)中翻滚。
[0148]
多个管可以被布置成网格或束。
[0149]
多个管可以被布置成多面体(如规则多面体)。多个管可以被布置成四面体(如规则四面体)。多个管可以被布置成六面体(如立方体、长方体或正方体)。多个管可以被布置成八面体(如规则八面体)。多个管可以被布置成十二面体(如规则十二面体)。多个管可以被布置成二十面体(如规则二十面体)。在一些实施方案中，多面体的每个边缘由单个管限定。在一些实施方案中，多面体的少于每个边缘由单个管限定(例如，当管的每个基本上平行时)。
[0150]
多个管可以被布置成棱锥(如三棱锥、斜方锥、四棱锥、正方棱锥、五棱锥、六棱锥、七棱锥或八棱锥)。多个管可以被布置成直立棱锥或斜棱锥。在一些实施方案中，棱锥的每个边缘由单个管限定。在一些实施方案中，棱锥的少于每个边缘由单个管限定(例如，当管的每个基本上平行时)。
[0151]
多个管可以被布置成棱柱(如三棱柱、矩形棱柱、正方棱柱、五棱柱、六棱柱、七棱柱或八棱柱)。多个管可以被布置成直立棱柱、斜棱柱或斜截棱柱。在一些实施方案中，棱柱的每个边缘由单个管限定。在一些实施方案中，棱柱的少于每个边缘由单个管限定(例如，当管的每个基本上平行时)。
[0152]
多个管可以被布置成具有长度、宽度和高度的配置，其中没有单个线度大于任何其他线度超过5倍。例如，多个管可以被布置成其中没有单个线度大于任何其他线度超过4倍、或没有单个线度大于任何其他线度超过3倍的配置。这样的配置对于，例如，颗粒的静脉内施用是有利的，因为椭圆形的颗粒在患者的血流中可能不会很好地流动。
[0153]
多个管可以被布置成具有长度和直径的配置，其中配置的长度不超过其直径的5倍。对于多个管可以以被布置成配置，其中配置的长度不超过其直径的4倍，或配置的长度不超过其直径的3倍。这样的配置对于，例如，颗粒的静脉内施用是有利的，因为椭圆形的颗粒在患者的血流中可能不会很好地流动。
[0154]
颗粒可以包括1至500个管(如1至100个管)。颗粒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、330、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个管。
[0155]
多个管可以包括1至500个管(如1至100个管)。多个管可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、330、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个管。
[0156]
多个管中的每个管可以具有相同的长度，或多个管中的不同的管可以具有不同的长度。管的平均长度可以是约5nm至约5μm(如约5nm至约4μm、约5nm至约3μm、约5nm至约2μm或约5nm至约1μm)。管的平均长度可以是约50nm至约5μm(如约50nm至约4μm、约50nm至约3μm、约50nm至约2μm或约50nm至约1μm)。管的平均长度可以是约100nm至约5μm(如约100nm至约4μm、约100nm至约3μm、约100nm至约2μm或约100nm至约1μm)。管的平均长度可以是约300nm至约5μm(如约300nm至约4μm、约300nm至约3μm、约300nm至约2μm或约300nm至约1μm)。管的平均长度可以是约500nm至约5μm(如约500nm至约4μm、约500nm至约3μm、约500nm至约2
μm或约500nm至约1μm)。
[0157]
多个管中的每个管可以具有相同的直径、宽度和/或高度，或多个管中的不同的管可以具有不同的直径、宽度和/或高度。管的平均直径、宽度和/或高度可以是约5nm至约5μm(如约5nm至约4μm、约5nm至约3μm、约5nm至约2μm、约5nm至约1μm、约5nm至约900nm、约5nm至约800nm、约5nm至约700nm、约5nm至约600nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm或约5nm至约100nm)。管的平均直径、宽度和/或高度可以是约50nm至约5μm(如约50nm至约4μm、约50nm至约3μm、约50nm至约2μm、约50nm至约1μm、约50nm至约900nm、约50nm至约800nm、约50nm至约700nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约400nm、约50nm至约300nm、约50nm至约200nm或约50nm至约100nm)。
[0158]
多个管中的每个管可以具有相同的内部直径、内部宽度和/或内部高度，或多个管中的不同的管可以具有不同的内部直径、宽度和/或高度。管的平均内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约5nm至约4μm(如约5nm至约3μm、约5nm至约2μm、约5nm至约1μm、约5nm至约900nm、约5nm至约800nm、约5nm至约700nm、约5nm至约600nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm或约5nm至约100nm)。管的平均内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约20nm至约4μm(如约20nm至约3μm、约20nm至约2μm、约20nm至约1μm、约20nm至约900nm、约20nm至约800nm、约20nm至约700nm、约20nm至约600nm、约20nm至约500nm、约20nm至约400nm、约20nm至约300nm、约20nm至约200nm或约20nm至约100nm)。管的平均内部直径、内部宽度和/或内部高度可以是约40nm至约4μm(如约40nm至约3μm、约40nm至约2μm、约40nm至约1μm、约40nm至约900nm、约40nm至约800nm、约40nm至约700nm、约40nm至约600nm、约40nm至约500nm、约40nm至约400nm、约40nm至约300nm、约40nm至约200nm或约40nm至约100nm)。
[0159]
管可以包括，例如，聚合物。聚合物可以是天然存在的聚合物或合成聚合物。聚合物可以是，例如，核酸(例如，dna)或蛋白质。
[0160]
v.包括dna骨架的颗粒
[0161]
在一些实施方案中，颗粒包括dna骨架，例如，颗粒可以包括dna折纸术骨架(参见，例如，美国专利号8,554,489和7,842,793；美国专利申请公开号2013/0224859和2010/0216978；以及pct专利申请公开号2014/170898，其中的每个以引用方式被并入本文)。
[0162]
颗粒可以包括dna骨架，并且dna骨架可以包括如本文中描述的至少一个管或多个管。例如，dna骨架可以包括至少一个大体上六角形的管(参见，例如，美国专利申请公开号2013/0224859，其以引用方式被并入本文)。
[0163]
dna骨架可以包括蜂窝体或网格(如六方网格或正方网格)(参见，例如，美国专利号8,554,489，其以引用方式被并入本文)。
[0164]
在一些实施方案中，颗粒包括dna骨架，并且dna骨架不包括管。例如，dna骨架可以包括三维形状(如多面体)，并且药剂可以被固定在所述形状的内部表面中。
[0165]
dna骨架可以包括多面体(如规则多面体)。dna骨架可以包括四面体(如规则四面体)。dna骨架可以包括六面体(如立方体、长方体或正方体)。dna骨架可以包括八面体(如规则八面体)。dna骨架可以包括十二面体(如规则十二面体)。dna骨架可以包括二十面体(如规则二十面体)。
[0166]
dna骨架可以包括棱锥(如三棱锥、斜方锥、四棱锥、正方棱锥、五棱锥、六棱锥、七
棱锥或八棱锥)。dna骨架可以包括直立棱锥或斜棱锥。
[0167]
dna骨架可以包括棱柱(如三棱柱、矩形棱柱、正方棱柱、五棱柱、六方柱、七棱柱或八棱柱)。dna骨架可以包括直立棱柱、斜棱柱或斜截棱柱。
[0168]
dna骨架可以包括长度、宽度和高度，其中没有单个线度大于任何其他线度超过5倍。例如，没有单个线度可以大于任何其他线度超过4倍，或没有单个线度可以大于任何其他线度超过3倍。这样的配置对于，例如，颗粒的静脉内施用是有利的，因为椭圆形的颗粒在患者的血流中可能不会很好地流动。
[0169]
在一些实施方案中，药剂被固定在dna骨架上。在一些实施方案中，药剂结合至核酸，所述核酸包括与dna骨架上的核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述核苷酸序列与dna骨架的核苷酸序列的反向互补序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。因此，通过将核酸与dna骨架杂交，药剂可有被固定在颗粒的表面上。
[0170]
vi.包括防护物的颗粒
[0171]
颗粒可以包括芯亚微颗粒和防护物，例如，其中防护物抑制结合至芯亚微颗粒的生物分子与细胞表面上的分子相互作用。防护物可以包括多个防护物组件。芯亚微颗粒可以包括二氧化硅。例如，芯亚微颗粒可以包括二氧化硅表面。芯亚微颗粒可以包括金、硅或聚合物。例如，芯亚微颗粒可以包括金、硅或聚合物表面。
[0172]
包括内芯亚微颗粒且具有防护物(其包括附连至芯亚微颗粒的多个防护物组件)的颗粒可以包括芯亚微颗粒(其包括二氧化硅表面)(如固体二氧化硅亚微颗粒、多孔二氧化硅亚微颗粒或具有非二氧化硅内部的二氧化硅纳米壳)。芯亚微颗粒可以包括盖覆有二氧化硅的非二氧化硅芯材料(如硅或金)。防护物组件可以是比芯亚微颗粒小的防护物亚微颗粒的形式(如纳米球)，并且可以包括二氧化硅或不同的材料(如金或聚合物)。芯亚微颗粒和防护物组件的表面的材料可以被选择为不同的以允许使用不同的耦合化学来将另外的组分或物质耦合到表面。
[0173]
药剂可以被提供在芯亚微颗粒的表面上，但在防护物组件的表面上以较少的程度，或优选地根本不提供。例如，通过与二氧化硅芯亚微颗粒优先(或唯一地)形成键(例如，离子、共价键或静电相互作用)而不与防护物亚微颗粒形成的键，药剂可以附连至二氧化硅芯亚微颗粒的表面(例如，具有金表面而不是二氧化硅表面)。
[0174]
在一些实施方案中，这样的颗粒可以包括二氧化硅芯，如大体上球形的二氧化硅芯，以及在二氧化硅芯的表面上的包括多个金纳米颗粒的防护物，金纳米颗粒具有小于芯的横截面线度(如芯的直径)的横截面线度。金纳米颗粒可以是大体上球形的。芯亚微颗粒可以是固体和非多孔的，或可以具有多孔表面。例如，如在美国专利号6,344,272，sadtler and wei,chem.comm.1604-5(2002)；meuhlig et al.,acs nano,5(8):6586-6592(2011)(其中的每个以引用方式被整体并入本文)中描述的，二氧化硅芯和在芯上的金纳米颗粒的形成可以实现。例如，借助于静电吸引，金纳米颗粒可以被吸附在胺盖覆的二氧化硅芯上，或可以被连接至二氧化硅芯，所述二氧化硅芯具有偶联至二氧化硅表面的硫醇基团，所述硫醇基团然后结合至金纳米颗粒的金表面。
[0175]
芯亚微颗粒可以具有50nm至4μm(如50nm至200nm、100nm至500nm、200nm至1μm或500nm至4μm)的横截面线度(如球形亚微颗粒或圆柱形亚微颗粒的直径)。
[0176]
颗粒可以由一定范围的芯亚微颗粒直径和防护物亚微颗粒直径组装。用于清除生
物分子的芯亚微颗粒的可用表面面积可以取决于防护物亚微颗粒的直径和靶标/药剂复合物结合至表面所需的芯亚微颗粒表面之上的有效高度(包含在表面和捕获药剂之间的表面之上的有效范围)。
[0177]
可以被结合至芯亚微颗粒的药剂的数量可以基于亚微颗粒的表面面积被计算。类似地，可以被结合至芯亚微颗粒的靶标生物分子的数量可以以类似的方式被计算。这样的计算可以，例如，通过蛋白质结合的体外研究被确认，并且可以被用于预测清除选定数量的靶标生物分子可能需要的颗粒的剂量(或，在一些实施方案中，用于从系统(如体外系统)或从治疗疾病的患者的循环中去除一些靶标生物分子或降低靶标生物分子的浓度的颗粒或含有该颗粒的制剂的有效剂量)。
[0178]
颗粒可以包括0.01μm2至50μm2(如0.01μm2至0.1μm2、0.05μm2至0.5μm2、0.1μm2至1.0μm2、0.5μm2至5μm2、1.0μm2至10μm2、5μm2至25μm2或10μm2至50μm2)的用于捕获靶标的可用表面面积。对于芯亚微颗粒表面的每单位面积的药剂的选定装载，基于芯亚微颗粒和防护物亚微颗粒直径，颗粒的最大剂量可以被确立为适合于清除期望量的靶标生物分子。
[0179]
防护物亚微颗粒的横截面线度(如直径)可以是芯亚微颗粒的横截面线度(如直径)的倍数。倍数可以是，例如，0.01至0.5(如0.02至0.2，如0.05至0.1)。
[0180]
为了使靶标生物分子有效接近药剂，靶标必须能够在防护物组分之间扩散以触及芯亚微颗粒表面上的药剂。例如，小于100kda的靶标(例如，stnf-r1/2)具有可以容易地在防护球之间扩散的尺寸，所述防护球的直径为40nm或更大。对于较小的防护球，球之间的有效孔长度是短的，并且因此小于40nm的防护球同样不太可能阻碍扩散。
[0181]
vii.包括亚微颗粒的颗粒
[0182]
在一些实施方案中，颗粒可以包括芯亚微颗粒和多个保护亚微颗粒。颗粒可以包括防护物，并且防护物可以包括多个保护亚微颗粒。药剂可以被固定在芯亚微颗粒的表面上，例如，其中芯亚微颗粒的表面是内表面。例如，当生物分子被结合至颗粒时，多个保护亚微颗粒可以被配置以抑制生物分子与特异性的结合对的第二构件的相互作用。例如，当生物分子被结合至颗粒时，多个保护亚微颗粒可以被配置以抑制生物分子与细胞(如哺乳动物细胞)之间的相互作用。
[0183]
保护亚微颗粒可以限定外表面。在优选的实施方案中，药剂不被固定在保护亚微颗粒的表面上。
[0184]
芯亚微颗粒优选足够大以结合至药剂的多于一个分子。例如，芯亚微颗粒的尺寸可以是约20nm至约4μm(如尺寸为约50nm至约2μm)。芯亚微颗粒的尺寸可以是约100nm至约1000nm、约100nm至约800nm、约100nm至约600nm、约100nm至约400nm、约100nm至约200nm、约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约200nm至约600nm、约200nm至约400nm、约400nm至约1000nm、约400nm至约800nm、约400nm至约600nm、约600nm至约1000nm或约600nm至约800nm。芯亚微颗粒的尺寸可以是约100nm至约4μm、100nm至约3μm、100nm至约2μm、约200nm至约4μm、200nm至约3μm、200nm至约2μm、约400nm至约4μm、400nm至约3μm、400nm至约2μm、约600nm至约4μm、600nm至约3μm、600nm至约2μm、约800nm至约4μm、800nm至约3μm或800nm至约2μm。
[0185]
芯亚微颗粒可以包括金属、金、氧化铝、玻璃、二氧化硅、硅、淀粉、琼脂糖、乳胶、塑料、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、聚合物或核酸。在一些实施方案中，芯亚微颗粒包括硅(如
多孔硅)。
[0186]
芯亚微颗粒可以是任何形状(例如，立方的、棱锥的、圆锥的、球形的、圆柱形的、圆盘、四面体的、六面体的、八面体的、十二面体的或二十面体的)，或芯亚微颗粒可以没有确定的形状。
[0187]
颗粒可以包括1个芯亚微颗粒。例如，芯亚微颗粒可以是美国专利号7,368,295或8,920,625(其中的每个以引用方式被整体并入本文)的颗粒，所述颗粒被进一步结合至多个保护亚微颗粒。
[0188]
颗粒可以包括多个芯亚微颗粒，如2个至300个芯亚微颗粒、2个至200个芯亚微颗粒、2个至150个芯亚微颗粒、2个至100个芯亚微颗粒、2个至80个芯亚微颗粒或2个至42个芯亚微颗粒(参见，例如，图4和图5)。在其中颗粒包括多个芯亚微颗粒的实施方案中，芯亚微颗粒中的每个优先大体上是球形的。包括多个球形的芯亚微颗粒的颗粒允许孔隙，从而允许可溶性生物分子扩散通过颗粒的内部。不过，各种其他形状的芯亚微颗粒可以允许孔隙。包括多个芯亚微颗粒的颗粒可以包括不同形状和尺寸的芯亚微颗粒。
[0189]
颗粒可以包括1个至约106个芯亚微颗粒、1个至约105个芯亚微颗粒、1个至约104个芯亚微颗粒、1个至约1000个芯亚微颗粒、1个至约100个芯亚微颗粒或1个至约10个芯亚微颗粒。颗粒可以包括2个至约106个芯亚微颗粒、2个至约105个芯亚微颗粒、2个至约104个芯亚微颗粒、2个至约1000个芯亚微颗粒、2个至约100个芯亚微颗粒或2个至约10个芯亚微颗粒。颗粒可以包括约10个至约106个芯亚微颗粒、约10个至约105个芯亚微颗粒、约10个至约104个芯亚微颗粒、约10个至约1000个芯亚微颗粒或约10个至约100个芯亚微颗粒。
[0190]
芯亚微颗粒可以包括孔，即，芯亚微颗粒可以是多孔的。
[0191]
保护亚微颗粒可以包括金属、金、氧化铝、玻璃、二氧化硅、硅、淀粉、琼脂糖、乳胶、塑料、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、聚合物或核酸。
[0192]
在一些实施方案中，多个保护亚微颗粒中的每个保护亚微颗粒通过连接体(如共价连接体)被束缚至芯亚微颗粒。在一些实施方案中，多个保护亚微颗粒中的一些保护亚微颗粒被束缚至芯亚微颗粒，并且没有被直接束缚至芯亚微颗粒的多个保护亚微颗粒中的每个保护亚微颗粒被束缚至保护亚微颗粒，即，使得多个中的每个保护亚微颗粒被直接地或间接地束缚至芯亚微颗粒。因此，颗粒可以包括单层保护亚微颗粒(例如，其中基本上全部的保护亚微颗粒被直接地束缚至一个或更多个芯亚微颗粒)，或颗粒可以包括多于一层的保护亚微颗粒(例如，其中通过与其他保护亚微颗粒的直接连接，很大一部分的保护亚微颗粒被间接地束缚至一个或更多个芯亚微颗粒)。
[0193]
在一些实施方案中，颗粒包括第一层保护亚微颗粒(其包括第一材料)和第二层保护亚微颗粒(其包括第二材料)。例如，第一材料可以包括二氧化硅或硅，并且第二材料可以包括金。例如，通过将第一层亚微颗粒中的亚微颗粒连接至一个或更多个芯亚微颗粒并且然后将第二层亚微颗粒中的亚微颗粒连接至第一层亚微颗粒，可以组装颗粒。第二层的亚微颗粒可以包括与一个或多个芯亚微颗粒类似的表面，例如，从而允许第一层的亚微颗粒使用类似的化学物质连接至一个或多个芯亚微颗粒和第二层的亚微颗粒。
[0194]
颗粒可以使用逐层法被组装。例如，通过首先连接多个芯亚微颗粒，可以形成颗粒。多个芯亚微颗粒可以是基本上同质的，例如，使得连接分子可以交联芯亚微颗粒。多个亚微颗粒可以包括至少两种类型的亚微颗粒，例如具有允许颗粒内的期望的特征(如孔隙)
的不同形状、尺寸和/或表面。在连接多个芯亚微颗粒之后，多个保护亚微颗粒可以被连接至多个芯亚微颗粒。在将多个保护亚微颗粒连接至芯亚微颗粒之后，第二多个保护亚微颗粒可以被连接至多个保护亚微颗粒。不过，颗粒可以以许多不同的方法被组装，并且根据颗粒的期望的性质和用于连接亚微颗粒的期望的化学物质，可以采用许多不同的逐层策略。
[0195]
用于交联亚微颗粒的方法是已知的，包含用于交联包括用于体内的抗体的亚微颗粒的方法(参见，例如，cheng,k.et al.,acs appl mater interfaces 2(9):2489
–
2495(2010)，其以引用方式被整体并入本文)。这样的方法可以适合于生产如本文中描述的颗粒，例如，通过简单地改变亚微颗粒的相对尺寸。
[0196]
保护亚微颗粒的尺寸可以是约10nm至约4μm(如尺寸是约10nm至约1μm或尺寸是约20nm至约500nm)。保护亚微颗粒的尺寸可以是约10nm至约200nm、10nm至约100nm、约10nm至约80nm、约10nm至约60nm、约10nm至约40nm、约10nm至约20nm、20nm至约200nm、约20nm至约100nm、约20nm至约80nm、约20nm至约60nm、约20nm至约40nm、30nm至约200nm、约40nm至约100nm、约40nm至约80nm、约40nm至约60nm、60nm至约200nm、约60nm至约100nm或约60nm至约80nm。保护亚微颗粒的尺寸可以是约100nm至约1000nm、约100nm至约800nm、约100nm至约600nm、约100nm至约400nm、约100nm至约200nm、约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约200nm至约600nm、约200nm至约400nm、约400nm至约1000nm、约400nm至约800nm、约400nm至约600nm、约600nm至约1000nm或约600nm至约800nm。保护亚微颗粒的尺寸可以是约100nm至约4μm、约100nm至约3μm、约100nm至约2μm、约200nm至约4μm、约200nm至约3μm、约200nm至约2μm、约400nm至约4μm、约400nm至约3μm、约400nm至约2μm、约600nm至约4μm、约600nm至约3μm、约600nm至约2μm、约800nm至约4μm、约800nm至约3μm或约800nm至约2μm。
[0197]
颗粒可以包括1个至约106个保护亚微颗粒、约4个至约106个保护亚微颗粒、约10个至约106个保护亚微颗粒、1个至约105个保护亚微颗粒、约4个至约105个保护亚微颗粒、约10个至约105个保护亚微颗粒、1个至约104个保护亚微颗粒、约4个至约104个保护亚微颗粒、约10个至约104个保护亚微颗粒、1个至约1000个保护亚微颗粒、约4个至约1000个保护亚微颗粒、约10个至约1000个保护亚微颗粒、1个至约100个保护亚微颗粒、约4个至约100个保护亚微颗粒或约10个至约100个保护亚微颗粒。
[0198]
芯亚微颗粒和保护亚微颗粒可以具有或可以不具有类似的或相同的形状、尺寸和组成。虽然如此，芯亚微颗粒与保护亚微颗粒不同，因为(1)药剂可以被固定在芯亚微颗粒上，而药剂优先不被固定在保护亚微颗粒上，并且(2)芯亚微颗粒优先位于颗粒的内部，而保护亚微颗粒可以存在于颗粒的外表面上。
[0199]
viii.基本上二维的颗粒
[0200]
颗粒可以是二维形状。例如，颗粒可以是圆形、环形、十字形、鱼骨形、椭圆形、三角形、方形、五边形、六边形、七边形、八边形或星形。颗粒可以是星形，并且星形可以是凹六边形、凹八边形、凹十边形或凹十二边形。形状可以是规则形状或不规则形状。基本上二维的颗粒的实施例如图6中所示。
[0201]
在一些实施方案中，颗粒包括第一侧面、第二侧面和边缘。第一侧面和第二侧面可以是基本上相同的形状。第一侧面和第二侧面可以包括长度和宽度。边缘可以限定高度，所述高度是第一侧面和第二侧面之间的距离。宽度和长度可以大于高度至少4倍(如大于高度4至1000倍、6至100倍、8至75倍或10至50倍)。宽度和/或长度可以大于高度0.2倍至约20倍。
[0202]
边缘可以包括一个或更多个凹的或凹入的部分。药剂可以被结合至边缘的凹的或凹入的部分。凹入的部分是这样的部分，其中颗粒的周界包括两个相邻的周界部分，所述两个相邻的周界部分在它们之间成大于270度的外角，如星形的点的任一侧。以这样的方法，可以防护捕获药剂不与接触颗粒的细胞的膜接触。
[0203]
在一些实施方案中，第一侧面和/或第二侧面是基本上平面的。在一些实施方案中，第一侧面和/或第二侧面包括凹的或凹入的部分。
[0204]
在一些实施方案中，颗粒是基本上平的星形的形式，例如在点之间具有凹入的部分。星形可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个点。颗粒可以包括规则的侧面或不规则的侧面。
[0205]
在一些实施方案中，颗粒是十字形或鱼骨形形状的形式，例如，包括具有在每个侧从骨干向外延伸的臂的骨干，以在臂之间限定凹入的表面部分。十字形或鱼骨形的臂还可以包括侧向凸出。
[0206]
星形的点之间的凹入的边缘或十字形或鱼骨形的臂优选地从接合点的线延伸一定距离，使得细胞膜不能在点之间变形，以便与边缘接触。例如，点的数量以及其之间的角度可以确定点之间的凹入的边缘部分的深度。
[0207]
适合用于本发明的颗粒可以通过纳米制造(例如通过纳米印刷术或纳米成型)形成。例如，颗粒可以通过print(“非浸润模板微印制技术(particle replication in non-wetting templates)”)工艺(参见，例如，国际专利申请wo2007/024323；perry,j.l.et al.,acc chem res.44(10):990-998(2011)，其中的每个以引用方式被并入本文)产生。颗粒可以使用已知的方法通过光刻产生。
[0208]
在一些实施方案中，药剂可以被固定在颗粒的边缘上并且不被固定，或以较小程度被固定在颗粒的第一侧面和第二侧面上。
[0209]
在一些实施方案中，每一颗粒的期望的表面面积在0.2μm2至25μm2的范围内。因此，能够通过纳米成型被制造的颗粒的防护的边缘部分的面积在期望的范围内。
[0210]
ix.药剂
[0211]
在一些实施方案中，被固定在颗粒表面上的药剂是小分子、大环化合物、多肽、拟肽化合物、适配子(aptamer)、核酸或核酸类似物。本文中使用的“小分子”是指具有小于约6kda并且最优选小于约2.5kda的分子量的药剂。许多制药公司具有广泛的化学和/或生物混合物库，所述库包括小分子阵列，通常包括真菌、细菌或藻类提取物，所述库可以用应用的任何测定进行筛选。除其他之外，本技术预期了使用小型化学库、肽库或天然产物的集。tan等描述了一个具有超过二百万种合成化合物的库，所述库与小型化的基于细胞的测定兼容(j am chem soc 120:8565-8566(1998))。
[0212]
拟肽物可以是化合物，其中受试者多肽的至少一部分被修饰，并且拟肽物的三维结构保持与受试者多肽的三维结构基本上相同。拟肽物可以是本公开的受试者多肽的类似物，所述类似物自身是在受试者多肽序列内含有一个或更多个取代或其它修饰的多肽。可替换地，受试者多肽序列的至少一部分可以用非肽结构代替，使得受试者多肽的三维结构被基本上保留。换句话说，受试者多肽序列内的一个、两个或三个氨基酸残基可以被非肽结构代替。此外，受试者多肽的其它肽部分可以(但不需要)用非肽结构代替。拟肽物(肽和非肽基类似物两者)可以具有改善的性质(例如，降低的蛋白水解、增加的固位力或增加的生
物利用度)。拟肽物通常具有改善的口服可用性，这使得其特别适合于治疗人类或动物。应该注意的是，拟肽物可以具有或可以不具有相似的二维化学结构，但是具有共同的三维结构特征和几何结构。每个拟肽物还可以具有一个或更多个独特的附加的结合要素。
[0213]
适配子是短的寡核苷酸序列，所述短的寡核苷酸序列可以被用于识别并特异性地结合几乎任何分子(包含细胞表面蛋白)。指数富集配体系统进化(selex)过程是有力的并且可以被用于容易地鉴定这样的适配子。适配子可以被制备用于治疗和诊断的宽泛范围的重要的蛋白质(如生长因子和细胞表面抗原)。这些寡核苷酸以与抗体相似的亲和性和特异性结合其靶标(参见，例如，ulrich(2006)handb exp pharmacol 173:305-326)。
[0214]
药剂可以是抗体或其抗原结合部分(即，抗体片段)，其中抗体或其抗原结合部分特异性地结合至靶标(例如，可溶性生物分子)。药剂可以包括抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分特异性地结合至靶标(例如，可溶性生物分子)。术语“抗体”是指包含不同的同种型的抗体的全部抗体，如igm、igg、iga、igd和ige抗体。术语“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体、被嵌合的或嵌合抗体、人源化抗体、灵长类抗体、去免疫抗体和完全人源抗体。抗体可以被制备成或衍生自任意多种物种，例如，哺乳动物，如人类、非人灵长类(例如，猩猩、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。抗体可以是纯化的或重组抗体。
[0215]
术语“抗体片段”、“生物分子结合片段”、“抗体的抗原接合部分”以及类似术语是指保留结合至靶标抗原的能力的抗体的片段。这样的片段包含，例如，单链抗体、单链fv片段(scfv)、fd片段、fab片段、fab’片段或f(ab’)2片段。scfv片段是单多肽链，所述单多肽链包含衍生scfv的抗体的重链和轻链可变区两者。此外，胞内抗体、微抗体(minibodies)、三链抗体(triabodies)和双链抗体(diabodies)也包含在抗体的定义中，并且与本文中描述的方法兼容使用(参见，例如，todorovska et al.,j immunol methods 248(1):47-66(2001)；hudson and kortt j immunol methods 231(1):177-189(1999)；poljak structure 2(12):1121-1123(1994)；rondon and marasco annual review of microbiology 51:257-283(1997)，其中的每个的公开内容通过引用被整体并入本文)。双特异性的抗体(包含dvd-ig抗体)也被术语“抗体”涵盖。双特异性的抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选人源或人源化的)抗体。
[0216]
如本文中使用的，术语“抗体”还包含，例如单结构域抗体，如骆驼化(camelized)单结构域抗体。参见，例如，muyldermans et al.,trends biochem sci 26:230-235(2001)；nuttall et al.,curr pharm biotech 1:253-263(2000)；reichmann et al.,j immunol meth 231:25-38(1999)；pct申请公开号wo 94/04678和wo 94/25591；以及美国专利号6,005,079、6,015,695和7,794,981，其全部通过引用被整体并入本文。在一些实施方案中，本公开提供包括具有修饰的两个vh结构域的单结构域抗体，使得形成单结构域抗体。
[0217]
在一些实施方案中，药剂是非抗体骨架蛋白。通常，通过预先存在的配体或抗原结合蛋白的基于组合化学的调整来获得这些蛋白质。例如，用于人转铁蛋白受体的人转铁蛋白结合位点可以使用组合化学被修饰以创造转铁蛋白变体的不同的库，所述库的一些具有对于不同抗原的后天的亲和性(参见ali et al.,j biol chem 274:24066-24073(1999))。不涉及结合受体的人转铁蛋白的部分保持不变并且用作骨架(类似抗体的框架区)以呈现不同的结合位点。然后将库作为针对感兴趣的靶标抗原的抗体库进行筛选，以鉴定具有对
是指用具有相似的空间性质的天然或非天然存在的氨基酸代替给定的多肽中的天然序列中存在的氨基酸。在待替代的天然氨基酸的侧链是极性的或疏水性的的情况下，保守取代应该用也是极性的或疏水性的天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，并且可选地具有与被代替的氨基酸的侧链相同或相似的空间性质。保守取代典型地包含以下基团中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。一个字母氨基酸缩写如下：丙氨酸(a)；精氨酸(r)；天冬酰胺(n)；天冬氨酸(d)；半胱氨酸(c)；甘氨酸(g)；谷氨酰胺(q)；谷氨酸(e)；组氨酸(h)；异亮氨酸(i)；亮氨酸(l)；赖氨酸(k)；甲硫氨酸(m)；苯丙氨酸(f)；脯氨酸(p)；丝氨酸(s)；苏氨酸(t)；色氨酸(w)；酪氨酸(y)和缬氨酸(v)。变体还包含全长野生型天然配体的片段以及相对于衍生出所述片段的野生型全长天然配体，包括一个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的片段。
[0223]
如本文中使用的，短语“非保守取代”是指通过具有不同电化学和/或空间的性质的另一天然或非天然存在的氨基酸代替母体序列中存在的氨基酸。因此，取代氨基酸的侧链可以显著大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链和/或可以具有与被取代的氨基酸显著不同的电子性质的官能团。
[0224]
在一些实施方案中，相对于衍生出变体多肽的野生型全长多肽，所述变体多肽包括至少2个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或多于100个)氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于衍生出变体多肽的野生型全长多肽，所述变体多肽包括不超过150个(例如，不超过145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个)氨基酸取代、缺失或插入。
[0225]
在一些实施方案中，变体多肽(例如，变体il-2或tnfα多肽)保留至少10(例如，至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)％的衍生出所述变体多肽的野生型全长多肽结合至靶标生物分子(例如，特异性的结合对的构件，其中野生型全长多肽是所述特异性的结合对的构件)的能力。在一些实施方案中，变体多肽将具有大于衍生出变体的野生型全长多肽的对靶标生物分子的亲和性。例如，在一些实施方案中，变体多肽具有比衍生出变体多肽的野生型全长多肽大2(3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500或甚至1000)倍的对靶标生物分子的亲和性。用于检测或测量两种蛋白质之间的相互作用的方法是本领域已知的并且在上文描述了。
[0226]
在一些实施方案中，野生型全长天然配体调节细胞表面受体的活性。因此，相对于野生型天然配体的活性，天然配体的变体可以具有增强的或降低的调节受体活性的能力。例如，在一些实施方案中，变体多肽具有小于90(例如，85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或小于5)％的衍生出所述变体多肽的全长野生型多肽的激活细胞表面受体蛋白的能力。在一些实施方案中，变体多肽不激活其结合的受体。
[0227]
这样的示例性变体多肽是本领域已知的。例如，国际专利申请公开号wo 2012/085891描述了具有降低的三聚能力并且因此具有降低的激活tnf家族受体的能力的tnf家族配体变体(也参见美国专利申请公开号us 2014/0096274，其以引用方式被并入本文)。然而变体tnf配体保留结合至tnf家族受体的能力。用于比较变体和野生型天然配体之间的活
性的合适的方法是本领域已知的。
[0228]
在一些实施方案中，可溶性生物分子是细胞表面受体的配体，例如，细胞因子或趋化因子(例如，mcp-1/ccl2、ccl5、ccl11、ccl12或ccl19)，如任何本领域已知的或本文中描述的那些。在一些实施方案中，配体是肿瘤坏死因子(tnf)家族配体或其变体。在一些实施方案中，tnf家族配体是tnfα或其变体。在一些实施方案中，tnf家族配体是fas配体、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配体、cd30配体、eda-a1、light、tl1a、tweak、tnfβ、trail或前述任一项的变体。在一些实施方案中，配体是tgfβ超家族配体或其变体，例如，激活素a、激活素b、抗缪勒氏管激素、生长分化因子(例如，gdf1或gdf11)、骨形态发生蛋白(bmp)、抑制素(例如，抑制素α、抑制素β)、左右不对称发育因子(lefty)、persephin、nodal、神经营养因子、tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3或肌肉生长抑制素。在一些实施方案中，配体是激素(例如，肽激素)，如饥饿素。
[0229]
在一些实施方案中，可溶性生物分子是结合珠蛋白或β-2微球蛋白。
[0230]
在一些实施方案中，可溶性生物分子是表2中鉴定的一个。
[0231]
表2.示例性可溶性生物分子和/或药剂
[0232]
[0233]
[0234]
[0235][0236]“ad”是指自身免疫紊乱和/或炎症性紊乱。“oa”是指骨关节炎。
[0237]
在一些实施方案中，药剂可以结合(例如，特异性地结合)至选自下列的生物分子：tnfα、tnfβ、可溶性tnf受体、可溶性tnfr-1、可溶性tnfr-2、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配体、cd30配体、eda-a1、light、tl1a、tweak、trail、可溶性trail受体、il-1、可溶性il-1受体、il-1a、可溶性il-1a受体、il-1b、可溶性il-1b受体、il-2、可溶性il-2受体、il-5、可溶性il-5受体、il-6、可溶性il-6受体、il-8、il-10、可溶性il-10受体、cxcl1、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cx3cl1、fas配体、可溶性死亡受体-3、可溶性死亡受体-4、可溶性死亡受体-5、tnf相关细胞凋亡弱诱导物、mmp1、mmp2、mmp3、mmp9、mmp10、mmp12、cd28、b7家族的可溶性成员、可溶性cd80/b7-1、可溶性cd86/b7-2、可溶性ctla4、可溶性pd-l1、可溶性pd-1、可溶性tim3、tim3l、半乳糖凝集素3、半乳糖凝集素9、可溶性ceacam1、可溶性lag3、tgf-β、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、抗缪勒氏管激素、神经胚素、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、骨形态发生蛋白(例如，bmp2、bmp3、bmp3b、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、bmp10、bmp11、bmp12、bmp13、bmp15)、生长分化因子(例如，gdf1、gdf2、gdf3、gdf3a、gdf5、gdf6、gdf7、gdf8、gdf9、gdf10、gdf11、gdf15)、抑制素α、抑制素β(例如，抑制素βa、b、c、e)、左右不对称发育因子、nodal、神经营养因子、persephin、肌肉生长抑制素、饥饿素、slr11、ccl2、ccl5、ccl11、ccl12、ccl19、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、簇集素、vegf-a、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、前列腺素e2、肝细胞生长因子、神经生长因子、骨硬化蛋白、补体c5、血管生成素2、血管生成素3、pcsk9、β淀粉样蛋白、激活素、激活素a、激活素b、β2微球蛋白、可溶性notch1、可溶性notch2、可溶性notch3、可溶性notch4、可溶性jagged1、可溶性jagged2、可溶性dll1、可溶性dll3、可溶性dll4、结合珠蛋白、纤维蛋白原α链、促肾上腺皮质激素释放因子、促肾上腺皮质激素释放因子1型、促肾上腺皮质激素释放因子2型、尿皮质素1、尿皮质素2、尿皮质素3、cd47、抗干扰素γ自身抗体、抗白介素6自身抗体、抗白介素17自身抗体、抗饥饿素自身抗体、wnt、吲哚胺2,3-双加氧
酶、c-反应蛋白、hiv-1gp120、内毒素、蓖麻毒蛋白毒素、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)ε毒素、葡萄球菌(staphylococcus)肠毒素b毒素以及肉毒毒素。
[0238]
在一些实施方案中，药剂可以包括特异性地结合至以下各项的抗体(或其抗原结合部分)：tnfα、tnfβ、可溶性tnf受体、可溶性tnfr-1、可溶性tnfr-2、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配体、cd30配体、eda-a1、light、tl1a、tweak、trail、可溶性trail受体、il-1、可溶性il-1受体、il-1a、可溶性il-1a受体、il-1b、可溶性il-1b受体、il-2、可溶性il-2受体、il-5、可溶性il-5受体、il-6、可溶性il-6受体、il-8、il-10、可溶性il-10受体、cxcl1、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cx3cl1、fas配体、可溶性死亡受体-3、可溶性死亡受体-4、可溶性死亡受体-5、tnf相关细胞凋亡弱诱导物、mmp1、mmp2、mmp3、mmp9、mmp10、mmp12、cd28、b7家族的可溶性成员、可溶性cd80/b7-1、可溶性cd86/b7-2、可溶性ctla4、可溶性pd-l1、可溶性pd-1、可溶性tim3、tim3l、半乳糖凝集素3、半乳糖凝集素9、可溶性ceacam1、可溶性lag3、tgf-β、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、抗缪勒氏管激素、神经胚素、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、骨形态发生蛋白(例如，bmp2、bmp3、bmp3b、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8a、bmp8b、bmp10、bmp11、bmp12、bmp13、bmp15)、生长分化因子(例如，gdf1、gdf2、gdf3、gdf3a、gdf5、gdf6、gdf7、gdf8、gdf9、gdf10、gdf11、gdf15)、抑制素α、抑制素β(例如，抑制素βa、b、c、e)、左右不对称发育因子、nodal、神经营养因子、persephin、肌肉生长抑制素、饥饿素、slr11、ccl2、ccl5、ccl11、ccl12、ccl19、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、簇集素、vegf-a、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、前列腺素e2、肝细胞生长因子、神经生长因子、骨硬化蛋白、补体c5、血管生成素2、血管生成素3、pcsk9、β淀粉样蛋白、激活素、激活素a、激活素b、β2微球蛋白、可溶性notch1、可溶性notch2、可溶性notch3、可溶性notch4、可溶性jagged1、可溶性jagged2、可溶性dll1、可溶性dll3、可溶性dll4、结合珠蛋白、纤维蛋白原α链、促肾上腺皮质激素释放因子、促肾上腺皮质激素释放因子1型、促肾上腺皮质激素释放因子2型、尿皮质素1、尿皮质素2、尿皮质素3、cd47、抗干扰素γ自身抗体、抗白介素6自身抗体、抗白介素17自身抗体、抗饥饿素自身抗体、wnt、吲哚胺2,3-双加氧酶、c-反应蛋白、hiv-1gp120、内毒素、蓖麻毒蛋白毒素、产气荚膜梭菌ε毒素、葡萄球菌肠毒素b毒素或肉毒毒素。
[0239]
药剂可以包括易普利姆玛(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)(例如，赛妥珠单抗(certolizumab pegol))、戈利木单抗(golimumab)、依那西普(etanercept)、司他芦单抗(stamulumab)、非苏木单抗(fresolimumab)、美替木单抗(metelimumab)、登西珠单抗(demcizumab)、他瑞妥单抗(tarextumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、卡纳单抗(canakinumab)、达克珠单抗(daclizumab)、贝利木单抗(belimumab)、地舒单抗(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、阿杜卡尼单抗(aducanumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布鲁赛珠单抗(brolucizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、阿柏西普(aflibercept)、阿克托克单抗(actoxumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、司妥昔单抗(siltuximab)、阿非莫单抗(afelimomab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、欧咗立珠单抗(ozoralizumab)、帕特立珠单抗(pateclizumab)、希瑞库单
抗(sirukumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿杜卡尼单抗(aducanumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、克雷内治单抗(crenezumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、珀珠单抗(ponezumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、达匹利珠单抗(dapirolizumab)、鲁利珠单抗(ruplizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、艾诺提克单抗(enoticumab)、培化阿珠单抗(alacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、弗图希单抗(futuximab)、依库单抗(icrucumab)、英戈土珠单抗(imgatuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕利珠单抗(panitumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、杜力戈图单抗(duligotumab)、帕图单抗(patritumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、安芦珠单抗(anrukinzumab)、地瑞伏单抗(diridavumab)、德罗图单抗(drozitumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、杜氏图单抗(dusigitumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗(edobacomab)、依夫单抗(efungumab)、依德鲁单抗(eldelumab)、enoblituzumab、艾诺克单抗(enokizumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依伏库单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、法希姆单抗(fasinumab)、非维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、费希腊妥单抗(ficlatuzumab)、非瑞伏单抗(firivumab)、夫来库单抗(fletikumab)、弗罗鲁单抗(foralumab)、福拉韦单抗(foravirumab)、弗兰单抗(fulranumab)、faliximab、盖尼塔单抗(ganitumab)、加沃坦珠单抗(gevokizumab)、弗塞库单抗(fuselkumab)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、艾玛鲁单抗(imalumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、西妥木单抗(iratumumab)、希凯珠单抗(ixekizumab)、姆帕力珠单抗(lampalizumab)、来金珠单抗(lebrikizumab)、仑齐鲁单抗(lenzilumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、利格利珠单抗(ligelizumab)、罗德希珠单抗(lodelcizumab)、鲁利珠单抗(lulizumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、纳米路单抗(namilumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、耐西维单抗(nesvacumab)、奥托昔单抗(obiltoxaximab)、奥鲁凯珠单抗(olokizumab)、奥泰单抗(orticumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕诺库单抗(panobacumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、培拉凯珠单抗(perakizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、普陀希单抗(pritoxaximab)、坤立珠单抗(quilizumab)、雷德图单抗(radretumab)、雷韦单抗(rafivirumab)、劳赛珠单抗(ralpancizumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、罗姆苏珠单抗(romosozumab)、罗利珠单抗(rontalizumab)、沙鲁单抗(sarilumab)、司库钦单抗(secukinumab)、斯图希单抗(setoxaximab)、司韦单抗(sevirumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、索维单抗(suvizumab)、他贝鲁单抗(tabalumab)、他珠单抗(tacatuzumab)、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、tgn1412、替曲吉珠单抗(tildrakizumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、tnx-650、托萨托舒单抗(tosatoxumab)、曲洛吉努单抗(tralokinumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、trevogrumab、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、伐提克图单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)或前述任一项的抗原结合部分。
[0240]
在一些实施方案中，药剂包括tnfα、tnfβ、可溶性tnf受体、可溶性tnfr-1、可溶性tnfr-2、vtnf、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配体、cd30配体、eda-a1、light、tl1a、tweak、trail、可溶性trail受体、il-1、可溶性il-1受体、il-1a、可溶性il-1a受体、il-1b、可溶性il-1b受体、il-2、可溶性il-2受体、il-5、可溶性il-5受体、il-6、可溶性il-6受体、il-8、il-10、可溶性il-10受体、cxcl1、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cx3cl1、fas配体、可溶性死亡受体-3、可溶性死亡受体-4、可溶性死亡受体-5、tnf相关细胞凋亡弱诱导物、mmp1、mmp2、mmp3、mmp9、mmp10、mmp12、cd28、b7家族的可溶性构件、可溶性cd80/b7-1、可溶性cd86/b7-2、可溶性ctla4、可溶性pd-l1、可溶性pd-1、可溶性tim3、tim3l、半乳糖凝集素3、半乳糖凝集素9、可溶性ceacam1、可溶性lag3、tgf-β、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、slr11、ccl2、ccl5、ccl11、ccl12、ccl19、激活素、激活素a、激活素b、可溶性notch1、可溶性notch2、可溶性notch3、可溶性notch4、可溶性jagged1、可溶性jagged2、可溶性dll1、可溶性dll3、可溶dll4或结合珠蛋白。
[0241]
在一些实施方案中，每个颗粒包括多个药剂。多个药剂可以包括10至约109份药剂，如约103至约107份药剂或约104至约106份药剂。
[0242]
x.产生抗体的方法
[0243]
如上所述，在一些实施方案中，被固定在颗粒或多个颗粒的表面上的药剂是抗体或其抗原结合片段。可以通过本领域已知的方法得到抗体。例如，可以用生物分子(例如，可溶性tnfr、毒素或病毒蛋白)的免疫原性形式免疫哺乳动物(如小鼠、仓鼠或兔子)。可替换地，通过使用在体内表达生物分子(例如，可溶性蛋白质)的核酸可以出现免疫作用，从而产生观察到的免疫原性应答。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包含接合至载体或本领域公知的其它技术。例如，本发明的多肽的肽基部分可以在佐剂的存在下被施用。通过检测血浆或血清中的抗体滴定度可以监测免疫作用的进展。标准elisa或其他免疫测定可与作为抗原的免疫原使用以评估抗体的浓度。
[0244]
免疫作用之后，可以获得与本发明的多肽反应的抗血清，并且如果需要，也可以获得从血清中分离出的多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，抗体产生细胞(淋巴细胞)可以从免疫动物被收获，并通过标准体细胞融合过程与永生化细胞(如骨髓瘤细胞)融合以产生杂交瘤细胞。这样的技术在本领域中是公知的，并且包含例如杂交瘤技术(最初由kohler和milstein((1975)nature,256:495-497)开发)(如人b细胞杂交瘤技术(kozbar et al.,(1983)immunology today,4:72)和用于产生人单克隆抗体的ebv杂交瘤技术(cole et al.,(1985)monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,inc.pp.77-96))。杂交瘤细胞可以被免疫化学筛选用于产生与本发明的多肽特异性地反应的抗体和分离的单克隆抗体。
[0245]
xi.将药剂固定在颗粒上
[0246]
药剂可以通过共价键或非共价键(如通过离子键、氢键、疏水键、配位、粘合剂或物理吸附或相互作用)被固定在颗粒的表面上。
[0247]
颗粒可以包括反应基团，例如，用于固定药剂。颗粒可以包括约10至约109个反应基团(如约102至约108个反应基团，约103至约107个反应基团，或约104至约106个反应基团)。颗粒可以包括多个反应基团。例如，多个反应基团颗粒可以包括约10至约109个反应基团(如约102至约108个反应基团，约103至约107个反应基团，或约104至约106个反应基团)。
[0248]
用于向各种不同类型的颗粒添加反应基团的方法是已知的(参见，例如，xu,z.et al.j nanoparticle research 17:56(2015)；yu,m.k.et al.theranostics 2(1):3(2012)；sanz,v.et al.j nanoparticle research 14:917(2012)；jokerst,j.v.et al.nanomedicine 6(4):715(2011)；guan,b.et al.langmuir 27(1):328(2011)；cheng,k.et al.acs applied materials&interfaces 2(9):2489(2010)；godin,b.et al.j biomed mater res a 94(4):1236(2010)；cauda,v.et al.j.am.chem.sco.131(32):11361(2009)；kecht,j.et al.chemistry of materials 20(23):7207(2008)；boisselier,e.et al.chemical communications 30(44):5788(2008)；sun,x.-l.et al.bioconjugate chemistry 17(1):52(2006)，其中的每个以引用方式被整体并入本文)。
[0249]
每个反应基团可以选择性地与预定的官能团反应。如本文中描述的，在一些实施方案中，反应基团可以与药剂形成键，所述药剂可以包括(例如，经由连接体通过偶联)能够与反应基团反应(优选地选择性地反应)的官能团(图7)。如本文中描述的，在一些实施方案中，药剂可以与反应基团形成键。如本文中描述的，在一些实施方案中，多个反应基团中的每个反应基团可以与药剂形成键。在一些实施方案中，多个药剂中的每个药剂可以与反应基团形成键。键可以是共价键或非共价键。非共价键的实施例包含核苷酸序列(例如，当反应基团包括核酸时)中的互补核苷酸的碱基配对、包含复合物(例如，在环糊精环和非极性部分之间)和生物素复合物(例如，具有抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白以及前述的单体形式)。颗粒可以包括多个药剂(所述药剂可以是相同的或不同的)，所述药剂通过反应基团被偶联至颗粒，例如，其中每个药剂被直接地或间接地连接至反应基团。
[0250]
在一些方面，本发明涉及制作如本文中描述的颗粒的方法，所述方法包括将未装载的颗粒(例如，包括一个或更多个反应基团的颗粒)与本发明的药剂(例如，如果必要的话，被偶联至能够与反应基团反应的官能团)温育，从而在颗粒(例如，颗粒的反应基团)和药剂之间形成键。在一些实施方案中，方法包括将未装载的颗粒(例如，包括多个反应基团的颗粒)与多个药剂温育，所述药剂可以是相同的或不同的，从而在颗粒(例如，颗粒的反应基团群体)和药剂群体之间形成键。
[0251]
颗粒可以包括连接体，例如，用于将药剂连接至反应基团。颗粒可以包括约10至约109个连接体(如约102至约108个连接体，约103至约107个连接体，或约104至约106个连接体)。颗粒可以包括多个连接体。例如，多个连接体可以包括约10至约109个连接体(如约102至约108个连接体，约103至约107个连接体，或约104至约106个连接体)。
[0252]
在一些实施方案中，本发明的反应基团和/或药剂可以与连接体形成键。在一些实施方案中，连接体可以与反应基团和/或药剂形成键。在一些实施方案中，多个反应基团中的每个反应基团可以与连接体形成键。在一些实施方案中，多个药剂中的每个药剂可以与连接体形成键。在一些实施方案中，多个连接体中的每个连接体可以与反应基团形成键。在一些实施方案中，多个连接体中的每个连接体可以与药剂形成键。键可以是共价键或非共价键。在一些实施方案中，颗粒包括连接体。连接体可以被结合至反应基团。在一些实施方案中，颗粒包括多个连接体。例如，颗粒可以包括多个反应基团和多个连接体，例如，其中多个连接体中的每个连接体被结合至多个反应基团中的反应基团。颗粒可以包括多个反应基团、多个连接体和多个药剂，例如，其中每个药剂被结合至连接体和/或每个连接体被结合至反应基团。
[0253]
连接体可以包括官能团。在一些实施方案中，本发明的反应基团和/或药剂可以与官能团形成键。在一些实施方案中，官能团可以与反应基团形成键，例如，以形成酰胺或酯(当羧酸盐和胺或醇反应时)或胺或硫醚(当胺或硫醇与马来酰亚胺或其他michael受体反应时)。在一些实施方案中，多个反应基团中的每个反应基团可以与官能团形成键。在一些实施方案中，多个官能团中的每个官能团可以与反应基团形成键。键可以是共价键或非共价键。在一些实施方案中，颗粒包括官能团。官能团可以被结合至反应基团，例如，以酰胺、酯、胺、硫醚或官能团和反应基团的反应的其他产物的形式存在。在一些实施方案中，颗粒包括多个官能团。例如，颗粒可以包括多个反应基团和多个官能团，例如，其中多个官能团中的每个官能团被结合至多个反应基团中的反应基团，例如，以酰胺、酯、胺、硫醚或官能团和反应基团的反应的其他产物的形式存在。颗粒可以包括多个反应基团、多个官能团和多个药剂，例如，其中每个药剂被结合至官能团和/或每个官能团被结合至反应基团。当然，颗粒的每个反应基团被偶联至官能团/药剂不是必要的，只要多个这些反应基团被偶联至官能团/药剂以给予颗粒期望的功能。
[0254]
连接体可以包括第一官能团和第二官能团。第一官能团可以能够选择性地与药剂反应，所述药剂具有能够与第一官能团反应的预定的部分。第二官能团可以能够选择性地与颗粒的反应基团反应。第一官能团和/或第二官能团可以是，例如，烯烃、卤代烷、炔烃、胺、芳基叠氮化物、芳基卤、叠氮化物、碳二亚胺、羧基、二烯、亲双烯体、乙二醛、卤代酰基、亚氨酸酯、异氰、马来酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯、膦、四嗪、硫醇或核酸。
[0255]
连接体可以是，例如，4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(磺酸基-smcc)、聚(乙二醇)(n-羟基琥珀酰亚胺5-戊酸)醚n
’‑
(3-马来酰亚胺基丙酰基)氨基乙烷(nhs-peg-mal)、3-(2-吡啶二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯(spdp)，或碘乙酸琥珀酰亚胺酯(sia)(参见，例如，yu,m.k.et al.theranostics 2(1):3(2012))。
[0256]
连接体可以包括第一官能团和第二官能团，其中第一官能团是胺并且第二官能团是羧酸，或第一官能团是羧酸并且第二官能团是胺。颗粒可以包括多个官能团，其中官能团是伯胺基团。
[0257]
颗粒可以是二氧化硅颗粒，或包括二氧化硅表面的颗粒(例如，具有氧化表面的硅颗粒或具有非二氧化硅芯和二氧化硅外层的颗粒)。颗粒可以包括金表面(例如，颗粒可以是金颗粒或具有盖覆包括不同的材料的芯的金表面)。颗粒可以包括聚合物表面(例如，颗粒可以是聚合物颗粒或具有盖覆包括不同的材料的芯的聚合物表面)。盖覆的颗粒的表面可以是连续表面(例如，覆盖颗粒的大体上全部表面)或不连续表面(例如，覆盖颗粒表面的一部分或多部分)。
[0258]
颗粒的每个反应基团可以是金，所述金可以结合，例如，硫醇官能团。因此，连接体或药剂可以包括硫醇。在一些实施方案中，连接体包括硫醇(例如，其中硫醇是官能团)和羧酸。颗粒可以包括胺反应基团(例如，多个胺反应基团)。例如，颗粒可以是二氧化硅颗粒或包括二氧化硅表面，并且颗粒可以包括多个反应基团，其中多个反应基团中的每个反应基团是胺。颗粒可以是聚合物颗粒或包括聚合物表面，并且颗粒可以包括多个反应基团，其中多个反应基团中的每个反应基团是胺。
[0259]
反应基团可以包括芳族肼(例如，6-肼基-烟酸)并且官能团可以包括芳族醛(例
如，4-甲酰基苯甲酸酯)，或反应基团可以包括芳族醛(例如，4-甲酰基苯甲酸酯)并且官能团可以包括芳族肼(例如，6-肼基-烟酸)，例如，从而允许反应基团在存在苯胺的情况下结合官能团(参见，例如，u.s.2014/0302001，其以引用方式被整体并入本文，以及http://www.solulink.com/solulink-technology)。
[0260]
颗粒可以包括多个反应基团，其中每个反应基团包括羧酸。官能团可以包括胺。反应基团可以被交联至官能团，例如，使用碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)，可选地使用三唑(例如，1-羟基-苯并三唑、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑)或n-羟基琥珀酰亚胺基酯(例如，n-羟基琥珀酰亚胺)。
[0261]
颗粒可以包括金或金表面(例如，覆盖二氧化硅)。反应基团或多个反应基团可以是金，并且官能团或多个官能团可以是硫醇(例如，连接体或药剂的官能团可以是硫醇)。例如，药剂可以包括半胱氨酸，例如，其中官能团是半胱氨酸的硫醇。
[0262]
颗粒可以包括多个反应基团，其中每个反应基团包括马来酰亚胺。官能团可以包括硫醇(例如，连接体或药剂的官能团)，从而允许官能团结合颗粒的马来酰亚胺。例如，药剂可以包括半胱氨酸，例如，其中官能团是半胱氨酸的硫醇。
[0263]
颗粒可以包括多个反应基团，其中每个反应基团包括硫醇。官能团可以包括马来酰亚胺(例如，连接体或药剂的官能团)，从而允许官能团结合颗粒的硫醇。
[0264]
颗粒可以包括第一连接体和第二连接体，例如，其中第一连接体用于将第一药剂连接至反应基团，并且第二连接体用于将第二药剂连接至反应基团。颗粒可以包括第一多个连接体和第二多个连接体。第一多个连接体和/或第二多个连接体可以包括约10至约109个连接体(如约102至约108个连接体，约103至约107个连接体，或约104至约106个连接体)。
[0265]
颗粒可以包括第一反应基团和第二反应基团，例如，其中第一反应基团用于结合第一官能团，并且第二反应基团用于结合第二官能团。颗粒可以包括第一多个反应基团和第二多个反应基团。第一多个反应基团和/或第二多个反应基团可以包括约10至约109个反应基团(如约102至约108个反应基团，约103至约107个反应基团，或约104至约106个反应基团)。第一反应基团(或多个反应基团)可以用于将药剂连接至颗粒，例如，通过将药剂或连接体的官能团结合至反应基团。第二反应基团(或多个反应基团)可以用于将第二药剂连接至颗粒，例如，通过结合第二药剂或连接体(例如，第二连接体)的官能团，所述连接体可以被用于将第二药剂连接至颗粒。
[0266]
第一反应基团可以与第二反应基团不同，例如，使得第一反应基团可以结合第一官能团，并且第二反应基团可以结合第二官能团，所述第二官能团与第一官能团不同。在一些实施方案中，第一反应基团与第二反应基团有关，例如，使得第一反应基团和第二反应基团结合相同的官能团。当第一反应基团和第二反应基团结合相同的官能团时，第一反应基团和第二反应基团中的至少一个可以被结合至保护基团。在该实施方案中，第一反应基团可以被偶联至第一药剂或用于结合药剂的连接体的官能团，例如，第二反应基团可以被脱保护，并且然后第二反应基团可以被偶联至第二药剂。
[0267]
保护基团是众所周知的(greene,t.w.and p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,3rd edition,john wiley&sons,new york(1999)，其以引用方式被整体并入本文)，并且示例性基团总结如下。
[0268]
氨基-保护基团包含氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴甲基氨基甲酸酯(fmoc)、
9-(2-磺酸基)芴甲基氨基甲酸酯、9-(2,7-二溴)芴甲基氨基甲酸酯、2,7-二-叔丁基-[9-l0,10-二氧杂-10,10,10,10-四氢硫代氧蒽基)]甲基氨基甲酸酯(dbd-tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(teoc)、2-苯乙基氨基甲酸酯(hz)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(adpoc)、1,1-二甲基-2-卤乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基1-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(db-boc)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(tcboc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(bpoc)、1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-bumeoc)、2-(2'-和4'-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(pyoc)、2-(n1n-二环己基甲酰氨基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸叔丁酯(boc)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(adoc)、乙烯基氨基甲酸酯(voc)、烯丙基氨基甲酸酯(alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸苄酯(cbz)、甲氧基苄基氨基甲酸酯(moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、氨基甲酸溴苄酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚硫酰基苄基氨基甲酸酯(msz)、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、氨基甲酸二苯甲酯、2-甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]甲基氨基甲酸酯(dmoc)、4-甲基苯硫基氨基甲酸酯(mtpc)、2,4-二甲基苯硫基氨基甲酸酯(bmpc)、2-磷酰乙基氨基甲酸酯(peoc)、2-三苯基磷酰异丙基氨基甲酸酯(ppoc)、1,1-二甲基-2-氰乙基氨基甲酸酯、m-氯-对酰氧基苄基氨基甲酸酯、(二羟基硼基)氨基甲酸苄酯、5-苯并异噁唑基甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基氨基甲酸酯(tcroc)、m-硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、正硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(正硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、n
’‑
对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、n-苯基氨基硫代羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、s-苄基硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸氰苄酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、癸氧基苄基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、正(n,n-二甲基甲酰氨基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(n,n-二甲基甲酰氨基)丙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸异冰片酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟酸酯、对(对甲氧基苯偶氨基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基甲基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸苯酯、(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三-叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶羧酰胺、n-苯甲酰基苯丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、苯基苯酰胺、正硝基苯基乙酰胺、正硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(n
’‑
二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟苯基)丙酰胺、3-(正硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(正硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(正苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、正硝基肉桂酰胺、n-乙酰蛋氨酸衍生物、正硝基苯甲酰胺、正(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、n-苯邻二甲酰亚胺、n-二硫杂琥珀酰亚胺(dts)、n-2,3-二苯基马来酰亚胺、n-2,5-二甲基吡咯、n-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基
氮杂环戊烷加合物(stabase)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、n-甲胺、n-烯丙胺、n-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(sem)、n-3-乙酰氧基丙胺、n-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、n-苄胺、n-二(4-甲氧基苯基)甲胺、n-5-二苯并环庚基胺、n-三苯甲基胺(tr)、n-[(4-甲氧基苯基)二苯甲基]胺(mmtr)、n-9-苯基芴基胺(phf)、n-2,7-二氯-9-芴基亚甲基胺、n-二茂铁基甲氨基(fern)、n-2-吡啶甲基氨基n
’‑
氧化物、n-1,1-二甲基硫代亚甲基胺、n-亚苄基胺、n-甲氧基亚苄基胺、n-二苯基亚甲基胺、n-[(2-吡啶基)4,2,6-三甲苯基]亚甲基胺、n-(n’,n-二甲基氨基亚甲基)胺、n,n-异亚丙基二胺、硝基亚苄基胺、n-亚水杨基胺、n-5-氯代亚水杨基胺、n-(5-氯-2-羟苯基)苯基亚甲基胺、n-环亚己基胺、n-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、n-硼烷衍生物、n-二苯基硼酸衍生物、n-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、n-乙醇胺铜、n-乙醇胺锌、n-硝胺、n-亚硝胺、胺n-氧化物、二苯基磷酸氨(dpp)、二甲基硫代磷酸氨(mpt)、二苯基硫代磷酸氨(ppt)、氨基磷酸二烷基酯、氨基磷酸二苄酯、氨基磷酸二苯酯、苯次磺酰胺、正硝基苯次磺酰胺(νps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(νpys)、甲苯磺酰胺(ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(imds)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰胺(pmc)、甲烷磺酰胺(ms)、β-三甲基甲硅烷基乙烷磺酰胺(ses)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8
’‑
二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(dνmbs)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
[0269]
羧酸保护基团包含甲硅烷基-、烷基-、烯基-、芳基-和芳基烷基-保护的羧酸。
[0270]
甲硅烷基保护基团包含三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。
[0271]
羟基保护基团包含甲基、甲氧基甲基(mom)、甲基硫代甲基(mtm)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(smom)、苄氧基甲基(bom)、对甲氧基苄氧基甲基(pmbm)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-aom)、愈创木酚甲基(gum)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(pom)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(mem)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(semor)、四氢吡喃基(thp)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(mthp)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基s,s-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(ctmp)、1,4-二恶烷-2-基、苄基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-甲烷苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、氯代苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、正硝基苄基、硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、氰苄基、苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基n-氧化物、二苯甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯甲基、α-萘基二苯甲基、对甲氧基苯基二苯甲基、二(对甲氧基苯基)苯甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4
’‑
溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯甲基、4,4’,4
”‑
三(4,5-二氯苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4,4’,4
”‑
三(乙酰丙酰氧基苯
基)甲基、4,4’,4
”‑
三(苯甲酸基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4’,4
”‑
二甲氧基苯基)甲基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1
’‑
芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-桥氧基)蒽基、1,3-苯并二噻戊环-2-基、苯并异噻唑s,s-二氧化物、三甲基甲硅烷基(tms)、三乙基甲硅烷基(tes)、三异丙基甲硅烷基(tips)、二甲基异丙基甲硅烷基(dmips)、二乙基异丙基甲硅烷基(deips)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbs)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)、三苄基甲硅烷基、三二甲苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、二苯甲基甲硅烷基(dpms)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(tbmps)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、丙酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(乙撑二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代乙酸酯)、特戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯甲酸苯酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(菜酸酯)、烷基碳酸二甲酯、9-芴基甲基碳酸酯(fmoc)、烷基乙基碳酸乙酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(tmsec)、2-(苯磺酰基)乙基碳酸酯(psec)、2-(三苯基磷)乙基碳酸酯(peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基正硝基苄基碳酸酯、烷基硝基苄基碳酸酯、烷基s-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、正(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-双(1,1-二甲丙基)苯氧基乙酸酯、氯化联苯乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(e)-2-甲基-2-丁烯酸酯、正(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基-四甲基磷二酰胺、烷基n-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(methanesulfonate)(甲磺酸酯(mesylate))、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(ts)。
[0272]
1,2-或1,3-二醇保护基团包含亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、环己二烯缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酯、1-甲氧基亚乙基原酯、1-乙氧基次乙基原酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酯、α-甲氧基亚苄基原酯、1-(n,n-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(m,n'-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂环戊烷亚基原酯、二-叔丁基亚甲硅基(dtbs)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(tipds)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(tbds)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙酯和苯基硼酸酯。
[0273]
硫醇保护基团包含硫代酸酯、碳酸酯、磺酸酯、烯丙基硫醚、硫醚、甲硅烷基硫醚、烷基硫醚、芳基烷基硫醚和烷基氧基烷基硫醚。
[0274]
酯保护基团包含甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、戊酸酯、巴豆酸酯、苯甲酸酯、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4,4-(乙撑二硫代)戊酸酯、特戊酸酯(三甲基乙酸酯)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苄基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯。碳酸
酯保护基团包含9-芴甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(苯磺酰基)乙基、乙烯基、烯丙基和对硝基苄基碳酸酯。甲硅烷基酯保护基团包含三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基醚，以及其他三烷基甲硅烷基醚。烷基酯保护基团包含甲基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基和烯丙醚及其衍生物。芳基烷基酯保护基团包含苄基、对甲氧基苄基(pmb)、3,4-二甲氧基苄基、正硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰苄基、2-和4-吡啶甲基醚。
[0275]
在一些方面，本发明涉及制作如本文中描述的颗粒的方法，所述方法包括将未装载的颗粒(例如，包括反应基团的颗粒)与连接体(例如，包括官能团的连接体)温育，从而在颗粒(例如，颗粒的反应基团)和连接体(例如，官能团)之间形成键。参见图8。在一些实施方案中，方法包括将未装载的颗粒(例如，包括多个反应基团的颗粒)与多个连接体(例如，其中每个连接体包括官能团)温育，从而在颗粒(例如，颗粒的反应基团群体)和连接体群体(例如，连接体群体的官能团)之间形成键。方法可以包括将连接体与本发明的药剂温育，从而在连接体和药剂之间形成键。在一些实施方案中，方法包括将多个连接体与多个药剂温育，从而在连接体群体和药剂群体之间形成键。在一些实施方案中，反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以与羧基、伯胺或硫醇形成键。在某些优选实施方案中，反应基团和/或官能团可以与羧基、伯胺或硫醇形成键。
[0276]
反应基团和/或官能团可以包括生物素-结合蛋白(例如，抗生物素蛋白、单体抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、单体抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、单体中性抗生物素蛋白)或生物素。例如，反应基团可以包括生物素并且官能团可以包括生物素-结合蛋白，或反应基团可以包括生物素-结合蛋白并且官能团可以包括生物素。连接体可以包括生物素-结合蛋白或生物素，例如，其中颗粒的反应基团分别包括生物素或生物素-结合蛋白，或药剂分别包括生物素或生物素-结合蛋白。药剂可以包括生物素-结合蛋白或生物素，例如，其中颗粒的反应基团分别包括生物素或生物素-结合蛋白，或连接体分别包括生物素或生物素-结合蛋白。
[0277]
连接体可以包括生物素和硫醇、生物素和胺、或生物素和羧酸。例如，连接体可以结合至包括生物素-结合蛋白的药剂，并且连接体的官能团可以是硫醇、胺或羧酸，即用于将药剂连接至颗粒。类似地，连接体可以结合至包括生物素-结合蛋白的颗粒(例如，其中连接体的官能团是生物素)，并且连接体的硫醇、胺或羧酸可以被用于将药剂交联至颗粒。
[0278]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括α-卤代酰基、烯烃、卤代烷、炔烃、胺、芳基叠氮化物、芳基卤、叠氮化物、碳二亚胺、羧基、二烯、亲双烯体、乙二醛、卤代酰基、亚氨酸酯、异氰、马来酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯、膦、四嗪或硫醇，例如，用于将药剂键合至颗粒。例如，颗粒可以包括胺功能化的二氧化硅表面，其中多个反应基团是胺。反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括抗体(或其抗原结合部分)、肽、蛋白质、核酸或适配子(aptamer)。
[0279]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括叠氮化物或炔烃，例如，用于经由叠氮化物-炔烃huisgen环加成反应固定药剂。huisgen环加成反应是亲偶极体与导致5元(杂)环的1,3-偶极化合物的反应。亲偶极体的实施例是烯烃和炔烃以及具有有关杂原子官能团(如羰基和腈)的分子。1,3-偶极化合物含有一个或更多个杂原子并且可以被描述为具有至
少一个代表带电偶极的内消旋结构。它们包含氧化腈、叠氮化物和重氮烷。金属催化的点击化学是烷基-芳基)-磺酰基叠氮化物、c-n三键和c-c三键之间的huisgen1,3-偶极环加成反应的极其有效的变体，其非常适合于本文公开的方法。这些反应的结果是1,2-噁唑、1,2,3-三唑或四唑。例如，1,2,3-三唑通过炔烃和烷基/芳基叠氮化物之间的铜催化的huisgen反应形成。金属催化的huisgen反应在环境温度下进行，对溶剂(即非极性的、极性的、半极性的)不敏感，并且对官能团高度耐受。与金属催化的反应相比，由于反应组分的低毒性，涉及具有共同促进与叠氮化物的[3 2]偶极环加成反应的环应变和吸电子取代基(如氟)的被取代的环辛炔的使用的非金属huisgen反应(也称为应变促进的环加成反应)尤其适用于本文。实施例包含difo和dimac。炔烃和叠氮化物的反应是非常特异性的并且对生物组织的化学环境基本上是惰性的。
[0280]
反应性基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括硫醇或烯烃，例如，用于经由硫醇-烯反应烯烃(氢硫化反应，即在c＝c键上添加rs-h)固定药剂。硫醇-烯反应经由自由基链机理进行。在光引发剂或硫醇本身的uv激发下通过自由基形成引发起始。硫醇-烯系统形成基态电荷转移复合物，因此即使在合理聚合时间内在不存在引发剂的情况下也发生光聚合。然而，uv光的添加增加反应进行的速度。根据需要，可以调节光的波长，取决于附连至硫醇或烯烃的成分的尺寸和性质。
[0281]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括二烯或亲双烯体，例如，用于经由狄尔斯-阿尔德反应固定药剂。狄尔斯-阿尔德反应将二烯(具有两个交替双键的分子)和亲双烯体(烯烃)结合以制作环状化合物和二环化合物。
[0282]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括异腈或四嗪，例如，用于经由4 1环加成反应固定药剂。
[0283]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括马来酰亚胺或硫醇，例如，用于经由马来酰亚胺-硫醇反应固定药剂(参见，例如，美国专利申请公开号2010/0036136，以引用方式被并入本文)。
[0284]
反应基团、连接体、官能团和/或药剂可以包括膦或叠氮化物，例如，用于经由施陶丁格反应固定药剂。典型的施陶丁格反应是其中叠氮化物与膦或亚磷酸盐的结合产生氮杂-叶立德中间体的化学反应，所述氮杂-叶立德中间体在水解时产生氧化膦和胺。施陶丁格反应是将叠氮化物还原为胺的温和方法；并且三苯基膦通常用作还原剂。在施陶丁格连接中，亲电捕集剂(通常是甲酯)适当地被置于三芳基膦上(通常在磷原子的邻位)并且与叠氮化物反应，以产生氮杂-叶立德中间体，其在水性介质中重排以产生具有酰胺基和氧化膦功能的化合物。施陶丁格连接的命名是因为其将两个起始分子连接(附连/共价连接)在一起，而在典型的施陶丁格反应中，两种产物在水解后不共价连接。
[0285]
官能团可以通过不同长度的间隔臂或桥连接至药剂，所述间隔臂或桥可以是烷基链、peg链、氨基酸链或任何其他适当的间隔物。例如，连接体可以包括聚乙二醇(peg)链，例如，所述聚乙二醇(peg)链用作官能团和药剂之间的间隔物。连接体可以包括，例如，二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇或六甘醇。连接体可以包括，例如第一官能团(例如，r1)、聚乙二醇间隔物(例如，-[och2ch2]no-，其中n是2至100(如2至50，或2至20)的整数)和第二官能团(例如，r2)。例如，连接体可以是式r1[och2ch2]nor2或r2[och2ch2]nor1的分子。r1和r2可以各自独立地选自包括下列的部分：α-卤代酰基、烯烃、卤代烷、炔烃、胺、芳基叠氮化物、芳基
卤、叠氮化物、碳二亚胺、羧基、二烯、亲双烯体、乙二醛、亚氨酸酯、异腈、马来酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯、膦、四嗪或硫醇。r1可以是硫醇并且r2可以是羧基，或r2可以是硫醇并且r1可以是羧基。r1可以是硫醇并且r2可以是胺，或r2可以是硫醇并且r1可以是胺。r1可以是羧基并且r2可以是胺，或r2可以是羧基并且r1可以是胺。
[0286]
适合于与伯胺反应的反应基团和官能团包含亚氨酸酯和n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯。亚氨酸酯官能团的实施例包含己二亚氨酸二甲酯、庚二亚氨酸二甲酯和辛二亚氨酸二甲酯。nhs-酯官能团的实施例包含谷氨酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯和双(磺酸基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯。存在于肽、多肽和蛋白质的n末端的可使用的胺基与nhs-酯反应以形成酰胺。nhs-酯交联反应可以在磷酸盐、重碳酸盐/碳酸盐、hepes和硼酸盐缓冲液中进行。如果其不含有伯胺，可以使用其他缓冲液。nhs-酯与伯胺的反应可以在约7和约9之间的ph以及约4℃和30℃之间的温度进行约30分钟至约2小时。nhs-酯官能团的浓度可以从约0.1至约10mm变化。nhs-酯是亲水的或疏水的。尽管dmso可以被包含以实现更大的溶解度，但是亲水nhs-酯在水性溶液中反应。将疏水nhs-酯溶于水溶性的有机溶剂中，然后加入水性反应混合物中。
[0287]
巯基反应性官能团和反应基团包含马来酰亚胺、卤代烷、芳基卤和a-卤代酰基，所述马来酰亚胺、卤代烷、芳基卤和a-卤代酰基与巯基反应以形成硫醇醚键和吡啶基二硫化物，所述吡啶基二硫化物与巯基反应以产生混合二硫化物。肽、多肽和蛋白质上的巯基基团可以通过本领域技术人员已知的技术产生，例如，通过二硫键的还原或通过使用2-亚氨基噻烷与伯胺反应而添加。马来酰亚胺官能团的实施例包含4-{n-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯。卤代缩醛官能团的实施例包含n-琥珀酰亚胺基(4-碘乙缩醛)氨基苯甲酸酯和磺酸基琥珀酰亚胺基(4-碘乙缩醛)氨基苯甲酸酯。吡啶基二硫化物官能团的实施例包含1,4-二-[3
’‑2’‑
吡啶二硫代(丙酰胺基)丁烷]和n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯。
[0288]
反应性基团和/或官能团可以包括通过使用碳二亚胺结合至伯胺或酰肼的羧基，其导致酰胺或腙键的形成。以这种方式，可以将肽、多肽和蛋白质的羧基末端固定在颗粒上。碳二亚胺官能团和反应基团的实施例包含1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐和n,n
1-二环己基碳二亚胺。当暴露于紫外线辐射时，芳基叠氮化物变成反应性的以形成芳基氮烯。芳基叠氮官能团的实施例包含叠氮苯甲酰基酰肼和n-5-叠氮-2硝基苯甲酸基琥珀酰亚胺。乙二醛官能团靶向精氨酸的胍基部分。乙二醛官能团的实施例是对叠氮苯基乙二醛一水合物。
[0289]
具有两个或更多不同的官能团(例如，第一官能团、第二官能团，以及可选地附加的官能团)的异双功能连接体适合于在本文中使用。实施例包含在一端是胺反应性的并且在另一端是巯基反应性的连接体，如4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯、n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯和如上所述的马来酰亚胺连接体。这样的连接体可以被用于间接地连接颗粒的反应基团与药剂的官能团。
[0290]
通过结合至反应基团，药剂可以被固定在颗粒上。例如，通过在肽、多肽或蛋白质的羧基、伯胺或硫醇与反应基团之间形成键，肽、多肽或蛋白质可以被固定。可替代地，药剂可以，例如，用连接体修饰，以与反应基团形成键。可替代地，药剂可以，例如，用连接体修饰，以与反应基团形成键。用于修饰药剂(如蛋白质、碳水化合物或脂质)的各种方法在本领
域中是已知的(参见，例如，美国专利申请公开号2014/0212425、2014/0377837和2015/0005447，以及美国专利号4,711,955、5,047,519、7,332,355、9,040,716，以引用方式被并入本文)。
[0291]
1,3-偶极化合物可以使用代谢机制、共价抑制剂和酶促转移被并入蛋白质、脂质、寡糖、寡核苷酸和聚糖中。例如，叠氮基团、n3可以使用氯化叠氮乙酰被应用于蛋白质或肽的n-末端(参见，例如，haridas,et al.,tetrahedron letters 48(2007)4719-4722)。叠氮基团是将与其他亲核基团互换的亲核基团，例如，oh、nh2和卤素(br、cl或i)。nan3是能够通过简单地将蛋白质与10倍摩尔过量的nan3接触叠氮化蛋白质的叠氮化剂。在cazalis,et al.,bioconjugate chem.,15(2004)1005-1009中描述了用于c端叠氮化的方法。细胞与全乙酰化n-叠氮乙酰基甘露糖胺的温育提供具有叠氮基唾液酸的细胞表面聚糖(参见，例如，codelli et al.,j.amer.chem.soc.,130(34)11486-11493(2008))。smith,et al.,bioconjugate chem.,19(9),1855-1863(2008)中描述了叠氮基-标记的脂质。聚乙二醇化是用于将基团添加到肽和蛋白质中的常用技术，并且适合于在本文中使用。例如，peg可以经由反应性部分被共价地结合至氨基酸残基。反应性部分(与本文中的反应基团相反)是活化peg分子可以被结合至的那些(例如，自由氨基或自由羧基)。例如，n-末端氨基酸残基和赖氨酸残基具有自由氨基，并且c-末端氨基酸残基具有自由羧基。巯基基团(例如，如在半胱氨酸残基上发现的)也可以被用作用于附连peg的反应性部分。此外，用于在多肽的c-末端特异性地引入活化基团(例如，酰肼、醛和芳族氨基)的酶辅助方法。因此，本文可以利用并入1,3-偶极化合物的peg。本领域技术人员可以利用任何已知的用于将1,3-偶极化合物偶联到蛋白质、脂质、寡糖、寡核苷酸和聚糖中的方法。
[0292]
颗粒可以包括反应基团，所述反应基团包括叠氮基团或炔基基团，并且连接体或药剂(例如，连接体或药剂的官能团)可以分别包括炔基基团或叠氮基团。例如，使用铜催化的炔烃-叠氮化物环加成反应，炔基基团可以与叠氮基团形成共价键。用于制备包括叠氮基团或炔基基团的颗粒的方法是已知的(参见，例如，xu,z.et al.j nanoparticle research 17:56(2015))。
[0293]
通过在n-末端与，例如，炔烃连接(例如，3-丁炔基氯甲酸酯)，可以合成亲偶极体功能化的蛋白质、多肽和肽。在一些实施方案中，半胱氨酸上的硫醇用具有马来酰亚胺的炔烃功能化。例如，通过使用连接剂(如n-羟基琥珀酰亚胺/dcc)与炔丙胺偶联，提供c-末端亲偶极体可以被实现。末端炔烃可以使用代谢结构单元(如炔酸)被安装。脂质可以用炔烃功能化。例如，炔烃修饰的脂肪酸可以通过末端炔基-烷基溴化物与三甲基膦的反应产生，以产生16碳炔基-二甲基膦酸酯(参见，例如，raghavan et al.,bioorg.med.chem.lett.,18(2008)5982-5986)。如上所述，聚乙二醇化可以被用于将亲偶极体添加到肽和蛋白质，并且适合于在本文中使用。狄尔斯-阿德耳官能度和硫醇-烯官能度可以同样地被附连至蛋白质、脂质、寡糖、寡核苷酸和聚糖。
[0294]
在某些优选实施方案中，反应基团包括核酸，例如，用于与药剂或官能团(例如，包括互补核酸的药剂或官能团)杂交。术语“核酸”是指dna或rna。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以包括单链区域和/或双链区域。核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列是核酸中从5’至3’读出的连续核苷酸的次序。核酸可以包括多个核苷酸序列。例如，双链核酸包括两个核苷酸序列，每个核苷酸序列跨越核酸的长度，其中一个核苷酸序列可以是另一个核
苷酸序列的反向互补序列。核酸也包括比核酸的长度短的核苷酸序列。例如，长为十个核苷酸的单链核酸具有两个长为九个核苷酸的核苷酸序列。类似地，长为十个核苷酸的单链核酸具有长为八个核苷酸的三个核苷酸序列。核酸的核苷酸可以是，例如，胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)和/或尿嘧啶(u)。核苷酸可以是经修饰的或未经修饰的。例如，一个或更多个核苷酸可以是甲基化的。核酸可以包括核苷酸类似物和/或非天然碱基对。核酸的核苷酸可以包括5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、黄嘌呤核苷和/或7-甲基鸟苷。
[0295]
颗粒可以包括反应基团，其中反应基团包括核酸；和药剂，其中药剂被连接至互补核酸，所述互补核酸可以与反应基团的核酸杂交，从而在药剂和颗粒之间形成非共价的缔合。类似地，颗粒可以包括反应基团，其中反应基团包括核酸；和官能团，其中官能团包括互补核酸，所述互补核酸可以与反应基团的核酸杂交，从而在药剂和颗粒之间形成非共价的缔合。核酸可以包括核苷酸序列，并且互补核酸可以包括互补核苷酸序列，例如，其中核苷酸序列与互补核苷酸序列的反向互补序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。核苷酸序列可以与互补核苷酸序列的反向互补序列具有100％的序列一致性。
[0296]
优选地，生理流体(例如，血液)中的核酸和互补核酸的解链温度大于体温(例如，受试者(如人或小鼠)的体温)。例如，生理流体中的核酸和互补核酸的解链温度优选大于37℃(如大于约38℃、大于约39℃、大于约40℃、大于约41℃、大于约42℃、大于约43℃、大于约44℃或大于约45℃)。核酸和互补核酸的解链温度可以是约37℃至约120℃(如约38℃至约120℃、约39℃至约120℃、约40℃至约120℃、约41℃至约120℃、约42℃至约120℃、约43℃至约120℃、约44℃至约120℃、约45℃至约120℃、约46℃至约120℃、约47℃至约120℃、约48℃至约120℃、约49℃至约120℃、约50℃至约120℃、约38℃至约100℃、约39℃至约100℃、约40℃至约100℃、约41℃至约100℃、约42℃至约100℃、约43℃至约100℃、约44℃至约100℃、约45℃至约100℃、约46℃至约100℃、约47℃至约100℃、约48℃至约100℃、约49℃至约100℃或约50℃至约100℃)。
[0297]
反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度优选大于9个核苷酸。反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度可以大于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度可以是约10个核苷酸至约100个核苷酸，如约11个核苷酸至约80个核苷酸、约12个核苷酸至约60个核苷酸、约13个核苷酸至约50个核苷酸、约14个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸，或约16个核苷酸至约25个核苷酸。核酸、核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的gc含量可以是约10％至约100％，如约40％至约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约40％至约95％、约45％至约90％、约50％至约85％，或约55％至约80％。
[0298]
xii.颗粒上的药剂的定位
[0299]
在一些实施方案中，颗粒的几何形状是这样以致于固定的药剂具有降低的或大幅度降低的与细胞(如免疫细胞、血细胞或淋巴细胞)表面上的生物分子相互作用的能力。相对于游离的可溶形式的药剂，固定的药剂可以具有小于50％(例如，45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的结合至细胞表面上的生物分子的能力。例如，在一些实施方案中，固定在本文中描述的颗粒表面上的tnfα或il-2
具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离的tnfα或il-2结合至细胞表面上的tnfα受体或il-2受体的能力。
[0300]
在一些实施方案中，结合至颗粒的可溶性生物分子具有降低的或大幅度降低的与其同源配体(特异性的结合对的第二构件)相互作用的能力。生物分子可以借助药剂被结合至颗粒。相对于未结合的生物分子的能力，结合至颗粒的生物分子可以具有小于50％(例如，45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的与其同源配体相互作用的能力。例如，结合至本文中描述的颗粒的可溶性tnfr具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离的可溶性tnfr与游离的tnfα相互作用的能力。在另一个实施例中，结合至本文中描述的颗粒的可溶性病毒粒子具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离的病毒粒子与其的一个或多个同源细胞表面受体相互作用并感染细胞的能力。
[0301]
在一些实施方案中，药剂可以被固定在颗粒的内表面(例如，多孔颗粒的孔或管的内表面)上。在一些实施方案中，药剂可以被固定在颗粒的外表面上，但是通过来自颗粒的一个或更多个凸起，被空间上妨碍与细胞表面相互作用。在一些实施方案中，例如，环形颗粒，药剂被固定在颗粒的内表面上，使得药剂具有降低的或大幅度降低的与细胞表面上的生物分子相互作用的能力，和/或借助药剂被结合至颗粒的可溶性生物分子具有降低的或大幅度降低的与其同源配体(特异性的结合对的第二构件)相互作用的能力。
[0302]
能够降低或大幅度降低药剂与细胞表面上的生物分子的相互作用，或结合至颗粒的生物分子与其同源配体之间的相互作用的示例性颗粒几何形状在图1至图6中列出并且在本文中被描述。
[0303]
xiii.清除剂和覆层
[0304]
在一些实施方案中，颗粒包括清除剂。清除剂可以通过生物学途径便利颗粒的清除，如通过尿液中排泄、降解、通过肝胆途径排泄和/或吞噬作用。
[0305]
例如，颗粒可以包括储存器，其中所述储存器包括清除剂。储存器可以是颗粒体中的洞或孔隙，例如，多孔硅颗粒体中的孔隙。
[0306]
对于包括孔的颗粒，储存器可以是孔，或储存器可以大于或小于平均孔尺寸。储存器可以由颗粒体中的凹部(例如，浅凹部)组成，其中凹部的宽度或直径大于平均孔尺寸的宽度或直径。储存器的宽度或直径可以是平均孔尺寸的宽度或直径的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是约500倍大。储存器的宽度或直径可以是平均孔尺寸的宽度或直径的约2倍至约10倍，如约2倍至约8倍或约2倍至约6倍。储存器的宽度或直径可以是平均孔尺寸的宽度或直径的约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是约500倍大。
[0307]
对于包括dna骨架的颗粒，储存器可以是dna骨架的内部区域。储存器(例如，内部区域)对细胞可能是难接近的，例如，可以构建dna骨架，使得骨架在空间上阻碍细胞进入内部区域。在一些实施方案中，储存器(例如，内部区域)对胞外蛋白是难接近的，例如，可以构建dna骨架，使得骨架在空间上阻碍胞外蛋白进入储存器。储存器(例如，内部区域)对抗体可能是难接近的。不过，dna骨架可以允许储存器(例如，内部区域)在预定时间段后变得对
细胞和/或胞外蛋白是可接近的。例如，dna骨架可以包括可生物降解的壁，所述壁可以在预定时间段后降解(例如，通过水解)，从而使清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白。dna骨架可以包括可生物降解的闩，所述闩可以在预定时间段后降解(例如，通过水解)，从而允许dna骨架经历构象改变，从而使清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白(参见，例如，pct专利申请公开号wo2014/170899，其通过引用被并入本文)。类似地，如下所述的，dna骨架可以包括包括和开口的储存器。
[0308]
储存器可以包括开口。开口可被盖或构件覆盖，从而抑制清除剂与细胞和/或胞外蛋白(例如，抗体)之间的相互作用。盖或构件可以包括聚合物，如可生物降解的聚合物。盖或构件可以在预定时间段后降解(例如，通过水解)，从而使清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白。盖或构件可以在暴露于生物流体(例如，血浆或细胞外液)约1天至约5年(如约1天至约4年、约1天至约3年或约1天至约1年)后降解(例如，生物降解)。
[0309]
预定时间段可以是颗粒处于液体(例如，水性液体)中的时间段。预定时间段可以是颗粒体内滞留的时间段(例如，暴露于生物流体、ph、酶和/或温度)。可以通过将颗粒结合至生物分子至少部分地来确定预定时间段。例如，颗粒可以被配置，使得生物分子的结合将清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白(参见，例如，pct专利申请公开号wo2014/170899，其以引用方式被并入本文)。预定时间段可以是约1天至约5年(如约1天至约3年或约1天至约1年)。
[0310]
美国专利号7,918,842描述了适合用作盖或膜的示例性材料，其以引用方式被并入本文。通常，这些材料通过酶水解或在体内或体外暴露于水或通过表面或体积侵蚀而降解或溶解。代表性的合成的可生物降解的聚合物包含：聚(酰胺)，如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚(酯)，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己内酯)；聚(酸酐)；聚(原酸酯)；聚(碳酸酯)；及其化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其它修饰)、其共聚物和混合物。可用于盖或膜的其它聚合物包含：聚(醚)，如聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)和聚(四氢呋喃)；乙烯基聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)，如甲基、乙基、其它烷基、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸，以及其他，如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(醋酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素及其衍生物，如烷基、羟烷基、醚、酯、硝化纤维素和各种醋酸纤维素；聚(硅氧烷)；及其任何化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如，烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其它修饰)、其共聚物和混合物。在某些实施方案中，储存器盖由一种或更多种交联聚合物(如交联的聚乙烯醇)形成。
[0311]
在一些实施方案中，颗粒包括覆层。在一些实施方案中，覆层包括清除剂。覆层可以遮蔽清除剂。
[0312]
颗粒可以包括第一表面和第二表面；药剂可以被固定在第一表面上；并且覆层可以覆盖第二表面的至少一部分。第一表面可以是内部表面或内表面，例如，第一表面可以被定向使得药剂具有降低的结合至细胞表面上的分子的能力。内部表面或内表面的实施例包含孔、储存器或管的内壁、环形的内周表面或凹面的中空。内部表面或内表面的其它实施例包含颗粒的外表面，其中通过一个或更多个凸起保护外表面免受与细胞的相互作用。第二表面可以是外部表面或外表面，例如，第二表面可以被定向使得覆层可以与细胞相互作用。在一些实施方案中，颗粒可以包括一个或更多个芯亚微颗粒和多个保护亚微颗粒。颗粒可以包括防护物，并且防护物可以包括多个保护亚微颗粒。第一表面可以是一个或更多个芯
颗粒的表面，并且第二表面可以是保护亚微颗粒的表面。
[0313]
覆层可以抑制颗粒之间的相互作用，例如，覆层可以降低颗粒形成聚集体的倾向。覆层可以抑制颗粒与细胞之间的相互作用，例如，通过呈现生物惰性表面。覆层可以抑制与胞外分子的非特异性的相互作用，例如，生物分子的非特异性的吸附。覆层可以抑制与细胞或胞外分子的特异性的相互作用，例如，覆层可能不利于或延缓颗粒的排泄或吞噬作用。覆层可以靶向颗粒以进行排泄或吞噬作用。通过延缓颗粒的排泄或吞噬作用的覆层(例如，第二覆层)可以遮蔽靶向颗粒以进行排泄或吞噬作用的覆层或其他特征(例如，“排泄诱导化合物”)被，例如，以促进血流中的颗粒维持预定量的时间。
[0314]
覆层可以包括多个一端结合至颗粒的表面的拉长的覆层分子。覆层可以抑制结合至颗粒的生物分子与包含生物分子的特异性的结合对的第二构件之间的相互作用。覆层可以抑制结合至颗粒的生物分子与细胞之间的相互作用。药剂可以相对于覆层在颗粒上被定向，使得药剂具有降低的结合至细胞表面上的分子的能力。药剂可以相对于覆层在颗粒上被定向，使得药剂具有降低的结合至细胞表面上的靶标的能力。药剂可以相对于覆层在颗粒上被定向，使得覆层在空间上抑制药剂结合至细胞表面上的分子。药剂可以在颗粒上被定向，使得覆层在空间上抑制药剂结合至细胞表面上的靶标。覆层可以在颗粒上被定向，使得颗粒的药剂具有降低的结合至细胞表面上的分子的能力。相对于细胞表面受体蛋白的天然配体的能力，覆层可以降低颗粒的药剂激活细胞表面受体蛋白的能力。
[0315]
颗粒可以包括第二覆层，例如，其中第二覆层由第二多个覆层分子组成。颗粒可以包括第二多个覆层分子。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以减小颗粒的体内清除，例如，通过遮蔽覆层和/或多个覆层分子。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以是可生物降解的，例如，在预定时间段后将覆层和/或多个覆层分子暴露于细胞和/或胞外蛋白。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以包括可生物降解的聚合物，例如第二多个覆层分子中的每个分子可以包括可生物降解的聚合物。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以包括抑制吞噬作用的cd47。
[0316]
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内部表面)和第二表面(例如，外部表面或外表面)；药剂被固定在第一表面上；并且覆层覆盖第二表面的至少一部分。第一表面的定向可以降低药剂与细胞表面上的分子相互作用的能力。第二表面的定向可以容许覆层与细胞、胞外分子和/或不同颗粒之间的相互作用。覆层与细胞、胞外分子和/或不同颗粒之间的“相互作用”可以是弱的、中性的或不利的相互作用，例如，不利于颗粒稳定结合至细胞、胞外分子或其它颗粒的。可替换地，覆层与细胞和/或胞外分子之间的相互作用可以是特异性的或被设计的相互作用，例如，有利于通过生物学途径(如吞噬作用)进行颗粒的清除。在某些优选实施方案中，第二表面基本上不含药剂。在某些优选实施方案中，第一表面基本上不含覆层。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
[0317]
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内部表面)和第二表面(例如，外部表面或外表面)；药剂被固定在第一表面和第二表面上；并且覆层覆盖第二表面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层(和/或第二覆层)可以抑制药剂与细胞表面上的分子之间的相互作用。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
[0318]
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内部表面)和第二表面(例如，外部表面或外表面)；药剂被固定在第一表面上；并且覆层覆盖第一表面的至少一部分和第二表
面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层优选地不影响药剂特异性地结合至生物分子的能力。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
[0319]
在一些实施方案中，颗粒包括表面；药剂被固定在表面上；并且覆层覆盖表面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层可以不影响药剂特异性地结合至生物分子的能力。覆层可以允许药剂中的一些特异性地结合至生物分子并且抑制药剂中的一些与生物分子之间的相互作用。覆层可以抑制药剂与细胞表面上的分子之间的相互作用。在某些优选的实施方案中，覆层覆盖基本上全部的表面。
[0320]
在一些实施方案中，颗粒包括覆层和第二覆层，所述覆层覆盖第二表面的至少一部分，所述第二覆层覆盖第二表面上的覆层的至少一部分(如，基本上全部)。在这样的实施方案中，覆层可以包含清除剂(如“排泄诱导化合物”)以靶向颗粒用于排泄或吞噬作用。这样的覆层可以包括β-环糊精。第二覆层可以包括材料(例如，第二多个覆层分子)，以抑制与细胞的相互作用和/或抑制与胞外分子的非特异性的相互作用(例如，生物分子的非特异性吸附)。第二覆层可以是可生物降解的，例如，在预定时间段之后将第二表面上的覆层暴露于细胞和/或胞外蛋白。例如，在包括一个或更多个芯亚微颗粒和多个保护亚微颗粒的颗粒中，其中捕获药剂被固定在一个或多个芯亚微颗粒的表面上(即，第一表面)，保护亚微颗粒的表面(即第二表面)的至少一部分包括覆层(例如包括清除剂的覆层或包括材料的覆层)，以抑制与细胞的相互作用和/或抑制与胞外分子的非特异性的相互作用。
[0321]
覆层可以包括覆层分子，例如，覆层可以由多个覆层分子组成，或覆层可以由覆层分子的群体组成。如本文中使用的，术语“多个覆层分子”和“覆层分子的群体”每个都是指覆层。然而，术语“覆层”可以是指附加的组合物，如水凝胶。覆层分子可以是清除剂(并且因此，清除剂可以是覆层分子)。
[0322]
颗粒可以包括多个覆层分子。颗粒可以包括表面和被固定在所述表面上的多种药剂，并且多个覆层分子中的至少一个分子可以被结合至表面。例如，多个覆层分子的全部或基本上全部的分子可以被结合至表面。
[0323]
颗粒可以包括表面和第二表面，其中被固定在表面上的多个药剂和多个覆层分子中的至少一个分子可以被结合至第二表面。例如，多个覆层分子的全部或基本上全部的分子可以被结合至第二表面。在一些实施方案中，多个覆层分子中的一些分子被结合至表面，并且多个覆层分子中的一些分子被结合至第二表面。
[0324]
在一些实施方案中，覆层分子增加颗粒的体内清除。例如，覆层分子可以包括病原体相关分子模式。
[0325]
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒具有包括排泄诱导化合物的覆层，所述排泄诱导化合物便利从循环中去除颗粒，例如，经由肾脏、肝脏/肠(例如，经由胆汁)，或吞噬作用(例如，通过抗原递呈细胞)。多个覆层分子可以是多个排泄诱导化合物。例如，在其中颗粒是环形的实施方案中，内周表面(例如，第一表面)可以包括被固定的药剂，并且外表面(例如，第二表面)可以包括诱导颗粒的清除的化合物，例如，通过肾脏、肝脏或巨噬细胞。在一些实施方案中，排泄诱导化合物是程序化的。也就是说，化合物可以被覆层覆盖，所述覆层随时间(例如，预定量的时间)降解(例如，通过酶的作用、水解或逐渐溶解)，最终暴露排泄诱导化合物或提高清除率的其它特征。在暴露于生物流体(例如，血浆或细胞外液)约1天至约5年(如约1天至约3年或约1天至约1年)后，覆层可以降解。因此，可以修饰和/或控制颗
粒的体内滞留。
[0326]
覆层可以包括有机聚合物，如聚乙二醇(peg)。有机聚合物可以被附连至颗粒，例如，被附连至颗粒的表面。有机聚合物可以包含peg、聚乳酸酯(polylactate)、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸、聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚醋酸乙烯酯(pva)及其组合。在某些实施方案中，颗粒与peg共价共轭，所述peg阻拦血清蛋白的吸附，便利有效的尿排泄并减小颗粒的聚集(参见，例如，burns et al.,nano letters,9(1):442-448(2009)以及美国专利申请公开号2013/0039848和2014/0248210，其中的每个以引用方式被并入本文)。
[0327]
在一个实施方案中，覆层包括至少一个亲水部分，例如，型聚合物(具有通式ho(c2h4o)a(-c3h6o)b(c2h4o)ah)的非离子聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)、三嵌段共聚物聚(乙二醇-b-(dl-乳酸-共-乙醇酸)-b-乙二醇)(peg-plga-peg)、二嵌段共聚物聚己内酯-peg(pcl-peg)、聚(偏二氟乙烯)-peg(pvdf-peg)、聚(乳酸-共-peg)(pla-peg)、聚(甲基丙烯酸甲酯)-peg(pmma-peg)等。在具有这样的部分的实施方案中，亲水部分是peg部分，如：[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷(例如，ch3(oc2h4)
6-9
(ch2)osi(och3)3)、[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-二甲氧基硅烷(例如，ch3(oc2h4)
6-9
(ch2)osi(och3)2)或[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-甲氧基硅烷(例如，ch3(oc2h4)
6-9
(ch2)osi(och3))。合适的覆层描述于例如美国专利申请公开号2011/0028662(其以引用方式被并入本文)。
[0328]
覆层可以包含聚羟基聚合物，如天然聚合物或含羟基聚合物，所述含羟基聚合物包含多羟基聚合物、多糖、碳水化合物、多元醇、聚乙烯醇、聚氨基酸(如聚丝氨酸)或其它聚合物(如2-(羟乙基)甲基丙烯酸酯)或其组合。在一些实施方案中，聚羟基聚合物是多糖。多糖包含甘露聚糖、普鲁兰、麦芽糖糊精、淀粉、纤维素和纤维素衍生物、树胶、黄原胶、刺槐豆胶或果胶、其组合(参见，例如，美国专利申请公开号2013/0337070，其以引入方式被并入本文)。
[0329]
在一些实施方案中，覆层包括两性离子聚合物(参见，例如，美国专利申请公开号2014/0235803、2014/0147387、2013/0196450和2012/0141797；以及美国专利号8,574,549，其中的每个以引用方式被并入本文)。
[0330]
其它合适的覆层包含聚-α羟基酸(包含聚乳酸或聚丙交酯、聚乙醇酸或聚乙交酯)、聚-β羟基酸(如聚羟基丁酸酯或聚羟基戊酸酯)、环氧聚合物(包含聚氧化乙烯(peo))、聚乙烯醇、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺酯、聚酯酰胺、聚磷酸酯和聚磷酸酯-聚氨酯。可降解的聚酯的实施例包含：聚(羟基链烷酸酯)，包含聚(乳酸)或(聚丙交酯，pla)、聚(乙醇酸)或聚乙交酯(pga)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)和聚(己内酯)或聚(戊内酯)。聚氧杂酯的实施例包含聚(亚烷基草酸酯)(如聚(草酸乙烯酯))和含酰胺基团的聚氧杂酯。其它合适的覆层材料包含聚醚、醚-酯共聚物(共聚(醚-酯))和聚碳酸酯，聚醚包含聚乙二醇。可生物降解的聚碳酸酯的实施例包含聚原碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚烷基碳酸酯(如聚(三亚甲基碳酸酯))、聚(1,3-二氧环己烷-2-酮)、聚(对二氧环己酮)、聚(6,6-二甲基-1,4-二氧环己烷-2-酮)、聚(1,4-二氧环庚烷-2-酮)和聚(1,5-二氧环庚烷-2-酮)。合适的可生物降解的覆层还可以包含聚酸酐、聚亚胺(如聚(乙烯亚胺)(pei))、聚酰胺(包含聚-n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺)、聚(氨基酸)(包含聚赖氨酸(如聚-l-赖氨酸)或聚谷氨酸(如聚-l-谷氨酸))、聚磷腈(如聚(苯氧基-共-羧基苯氧基磷腈)、聚有机磷腈、聚氰基丙
烯酸酯和聚氰基丙烯酸烷基酯(包含聚氰基丙烯酸丁酯)、聚异氰酸酯和聚乙烯吡咯烷酮。
[0331]
聚合物覆层分子的链长可以是约1个至约100个单体单元，如约4个至约25个单元。
[0332]
颗粒可以用天然存在的聚合物(包含纤维蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、酪蛋白、胶原、壳聚糖、胞外基质(ecm)、角叉菜胶、软骨素、果胶、藻酸盐、藻酸、白蛋白、糊精、葡聚糖、明胶、甘露醇、正卤胺、多糖、聚-1,4-葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉(hes)、二醛淀粉、糖原、淀粉酶、羟乙基淀粉酶、支链淀粉、葡萄糖-聚糖、脂肪酸(及其酯)、透明质酸、鱼精蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、d-甘露糖醛酸、l-古洛糖酸、玉米醇溶蛋白和其他醇溶谷蛋白、藻酸、瓜尔豆胶和磷酸胆碱、以及其共聚物和衍生物)盖覆。覆层还可以包括改性多糖，如纤维素、壳多糖、葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、聚葡萄糖酸酯、透明质酸和盐酸高飞燕草碱(elatin)，以及其共聚物及衍生物。
[0333]
颗粒可以用水凝胶盖覆。例如，可以使用选自任何合适的聚合物(如聚(羟烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)或聚乙烯醇)的基础聚合物形成水凝胶。交联剂可以是过氧化物、硫、二氯化硫、金属氧化物、硒、碲、二胺、二异氰酸酯、二硫化烷基苯、二硫化四乙基秋兰姆、4,4
’‑
二硫代吗啡啉、对奎宁二肟和四氯对苯醌中的一种或更多种。此外，含硼酸的聚合物可以被并入水凝胶中，并具有可选的可光聚合性基团。
[0334]
在某些优选的实施方案中，覆层包括被美国食品和药物管理局(fda)批准使用的材料。这些fda批准的材料包含聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚糖乳酸复合物910(每单元丙交酯包括比率为9:1的乙交酯，也称为vicryl
tm
)、聚葡糖酸酯(每单元三亚甲基碳酸酯包括比率为9:1的乙交酯，也称为maxon
tm
)和聚二氧环己酮(pds)。
[0335]
将覆层附连至颗粒可以通过共价键或非共价键实现，如通过离子键、氢键、疏水键、配位、粘合剂或物理吸附或相互作用。
[0336]
常规纳米颗粒盖覆方法包含干法和湿法。干法包含：(a)物理气相沉积(zhang,y.et al.solid state commun.115:51(2000))，(b)等离子体处理(shi,d.et al.,appl.phys.lett.78:1243(2001)；vollath,d.et al.,j.nanoparticle res.1:235(1999))，(c)化学气相沉积(takeo,o.et al.,j.mater.chem.8:1323(1998))以及(d)用于基质内纳米颗粒的原位沉淀的聚合或非聚合有机材料的热解(sglavo,v.m.et al.,j.mater sci.28:6437(1993))。用于盖覆颗粒的湿法包含：(a)溶胶-凝胶法以及(b)乳化和溶剂挥发法(cohen,h.et al.,gene ther.7:1896(2000)；hrkach,j.s.et al.,biomaterials 18:27(1997)；wang,d.et al.,j.control.rel.57:9(1999))。可以通过电镀、喷涂、浸涂、溅射、化学气相沉积或物理气相沉积来涂覆覆层。此外，用多糖盖覆各种纳米颗粒的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号8,685,538和美国专利申请公开号2013/0323182，其中的每个以引用方式被并入本文)。
[0337]
在一些实施方案中，颗粒可以适于便利通过肾排泄的清除。具有正常肾功能的受试者的肾清除通常需要至少一个维度小于15nm的颗粒(参见，例如，choi,h.s.,et al.,nat biotechnol 25(1):1165(2007)；longmire,m.et al.,nanomedicine 3(5):703(2008))。不过，较大的颗粒可以在尿液中被排泄。对于其中颗粒对于肾清除太大的实施方案，颗粒则可以在体内降解到更小尺寸后被清除。
[0338]
在一些实施方案中，颗粒可以适于便利通过肝胆排泄的清除。包含在肝脏中的枯
否细胞的单核吞噬系统(mps)涉及肝摄取和随后的纳米颗粒的胆汁排泄。已知纳米颗粒的某些尺寸和表面性质增加肝脏中mps的摄取(参见choi et al.,j.dispersion sci.tech.24(3/4):475-487(2003)；和brannon-peppas et al.,j.drug delivery sci.tech.14(4):257-264(2004)，其中的每个通过引用被并入本文)。例如，已知增加颗粒的疏水性增加mps的摄取。因此，本领域普通技术人员可以选择具有某些特性的颗粒以调节胆汁排泄。肝胆系统允许比可以通过肾脏系统排泄的颗粒稍微大的颗粒(例如，10nm至20nm)的排泄。对于其中颗粒对于肝胆排泄太大的实施方案，则颗粒可以在体内降解到更小尺寸后被清除。在这样的实施方案中，便利通过肝胆排泄的清除的覆层可以覆盖颗粒内表面的一部分，使得覆层在颗粒降解后变为暴露的。颗粒可以包括覆盖表面的一部分的多个覆层分子，例如，疏水性分子。表面可以在颗粒降解后被暴露，而允许被降解的颗粒的清除。
[0339]
在一些实施方案中，颗粒适于便利通过吞噬作用的清除。例如，颗粒可以包括清除剂，其中清除剂包括病原体相关分子模式，例如，用于通过巨噬细胞识别。病原体相关分子模式(pamps)包含未甲基化的cpg dna(细菌的)、双链rna(病毒的)、脂多糖(细菌的)、肽聚糖(细菌的)、脂阿拉伯甘露糖(细菌的)、酵母聚糖(酵母)、支原体脂蛋白(如malp-2(细菌的))、鞭毛蛋白(细菌的)、聚(肌苷酸-胞苷酸)酸(细菌的)、脂磷壁酸(细菌的)和咪唑喹啉(合成的)。在优选的实施方案中，pamp清除剂被遮蔽，使得在颗粒结合至一个或更多个靶标之前巨噬细胞不吞食所述颗粒。例如，pamp清除剂可以被任何一种上述覆层(例如，聚合物覆层，如可生物降解的聚合物覆层)遮蔽。巨噬细胞可以吞食20μm大的颗粒(参见，例如，cannon,g.j.和swanson,j.a.,j.cell science 101:907-913(1992)；champion,j.a.,et al.,pharm res 25(8):1815-1821(2008))。在一些实施方案中，便利通过吞噬作用清除的清除剂可以覆盖颗粒的内表面的一部分，使得清除剂在颗粒降解后变为暴露的。颗粒可以包括覆盖表面的一部分的多个清除剂，例如，pamps。表面可以在颗粒降解后被暴露，而允许被降解的颗粒的清除。清除剂可以覆盖表面的一部分，所述表面的一部分与包括药剂的表面重叠。清除剂(例如，pamps)可以引发针对颗粒的免疫应答，例如，在第二覆层的降解之后或在颗粒的降解之后。
[0340]
在一些实施方案中，针对清除剂(例如，pamps)的免疫应答可以超过针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答，从而抑制或延缓针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答的开始。例如，颗粒的降解可以将清除剂和药剂(和/或药剂/生物分子复合物)两者暴露于白细胞。pamp清除剂可以允许通过巨噬细胞的被降解的颗粒的快速清除，从而延缓针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答(例如，b细胞介导的免疫应答)。
[0341]
清除剂可以是诱导吞噬作用的钙网蛋白。
[0342]
在某些优选的实施方案中，覆层分子包括核酸，例如，用于与覆层分子杂交成包括dna骨架的颗粒。例如，颗粒可以包括核酸和覆层分子，其中覆层分子包括可以与核酸杂交的互补核酸，从而在覆层分子和颗粒之间形成键(即，氢键)。核酸可以包括核苷酸序列，并且互补核酸可以包括互补核苷酸序列，例如，其中核苷酸序列与互补核苷酸序列的反向互补序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。核苷酸序列可以与互补核苷酸序列的反向互补序列具有100％序列一致性。
[0343]
优选地，生理流体(例如，血液)中的核酸和互补核酸的解链温度大于体温(例如，受试者(如人或小鼠)的体温)。例如，生理流体中的核酸和互补核酸的解链温度优选大于37
℃(如大于约38℃、大于约39℃、大于约40℃、大于约41℃、大于约42℃、大于约43℃、大于约44℃或大于约45℃)。核酸和互补核酸的解链温度可以是约37℃至约120℃(如约38℃至约120℃、约39℃至约120℃、约40℃至约120℃、约41℃至约120℃、约42℃至约120℃、约43℃至约120℃、约44℃至约120℃、约45℃至约120℃、约46℃至约120℃、约47℃至约120℃、约48℃至约120℃、约49℃至约120℃、约50℃至约120℃、约38℃至约100℃、约39℃至约100℃、约40℃至约100℃、约41℃至约100℃、约42℃至约100℃、约43℃至约100℃、约44℃至约100℃、约45℃至约100℃、约46℃至约100℃、约47℃至约100℃、约48℃至约100℃、约49℃至约100℃或约50℃至约100℃)。
[0344]
反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度优选大于9个核苷酸。反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度可以大于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。反应基团的核酸、反应基团的核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的长度可以是约10个核苷酸至约100个核苷酸，如约11个核苷酸至约80个核苷酸、约12个核苷酸至约60个核苷酸、约13个核苷酸至约50个核苷酸、约14个核苷酸至约40个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸，或约16个核苷酸至约25个核苷酸。核酸、核苷酸序列、互补核酸和互补核苷酸序列的gc含量可以是约10％至约100％，如约40％至约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约40％至约95％、约45％至约90％、约50％至约85％，或约55％至约80％。
[0345]
在一些实施方案中，颗粒可以在约1天至约5年(如约1天至约3年，或约1天至约1年)内被生物体清除。
[0346]
xiv.应用
[0347]
本文中描述的组合物(例如，颗粒和其药物组合物)在各种各样的诊断和治疗应用中是有用的。例如，本文中描述的颗粒可以被用于治疗癌症、使受试者解毒或治疗病毒或细菌感染。
[0348]
治疗应用包含使用各种各样的部分取决于于施用途径的方法将本文中描述的一种或更多种组合物施用至受试者(例如，人受试者)。途径可以是，例如，静脉内注射或输注(iv)、皮下注射(sc)、腹腔内(ip)注射或肌肉注射(im)。
[0349]
在一些方面，本发明涉及用于从组合物去除生物分子的方法，所述方法包括使组合物与本文中描述的颗粒接触。这样的方法对科学研究是特别有用的。例如，将生物分子加入溶液中是相对容易的，然而从溶液中去除特异性的生物分子是稍微更有挑战性。
[0350]
目前用于从溶液去除生物分子的技术包含，例如，将生物分子结合至颗粒(如琼脂糖珠)，并且然后从溶液物理地分离珠。本文中描述的颗粒可以隔离组合物中的生物分子，从而抑制与组合物的其他组分(例如，细胞)的相互作用，而不需要从组合物物理地分离颗粒。
[0351]
颗粒可以包括荧光团。颗粒可以是磁性的或顺磁性的，或颗粒可以包括允许颗粒被吸引到磁场的磁性的或顺磁性的亚微颗粒或组分。
[0352]
方法可以包括使组合物与本文中描述的颗粒接触，其中所述组合物是细胞培养物。例如，细胞培养物可以是细菌细胞培养物或组织培养物。这样的方法，例如，对从细胞培养物中去除分泌的蛋白质或从细胞培养物中去除污染物可以是有用的。
[0353]
方法可以包括使组合物与本文中描述的颗粒接触，其中所述组合物是细胞裂解
物。细胞裂解物可以是原核细胞裂解物或真核细胞裂解物。这样的方法，例如，对抑制靶标生物分子的活性可以是有用的。
[0354]
上述方法对评估特定系统中感兴趣的生物分子的功能可以是特别有用的。例如，生物分子可以被引入系统(例如，组织培养物)以评估生物分子对系统的影响(例如，细胞增殖或细胞死亡)，并且使用如本文中描述的颗粒，生物分子可以被从相似的系统耗尽，以评估生物分子的缺乏对系统的影响。
[0355]
xv.用于将药剂偶联至颗粒的试剂盒
[0356]
在一些方面，本发明涉及用于制作清除颗粒的试剂盒。试剂盒可以包括多个颗粒。试剂盒可以包括用于将颗粒的反应基团偶联至多个药剂以制备清除颗粒的说明书。试剂盒可以包括用于功能化颗粒的反应基团以制备清除颗粒的说明书。试剂盒还可以包括多个连接体。多个连接体中的每个连接体可以包括第一官能团，所述第一官能团能够选择性地与具有预定部分的药剂反应，所述预定部分能够与第一官能团反应。多个连接体中的每个连接体可以包括第二官能团，所述第二官能团能够选择性地与颗粒的反应基团反应。在一些实施方案中，试剂盒不包括连接体，例如，当颗粒的反应基团可以选择性地与药剂反应从而将药剂偶联至颗粒时。试剂盒还可以包括多个药剂，每个药剂具有预定部分。例如，对于包括肽或蛋白质的药剂，预定部分可以是伯胺、胍盐、硫醇或羧基基团。在一些实施方案中，试剂盒不包括，例如，用于产生定制清除颗粒的药剂。
[0357]
在一些实施方案中，试剂盒包括第二多个连接体，例如，其中第二多个连接体中的每个连接体包括第三官能团，所述第三官能团能够选择性地与具有第二预定部分的药剂反应，所述第二预定部分能够与第三官能团反应。例如，第一官能团可以能够与蛋白质的预定部分反应，并且第三官能团可以能够与核酸的预定部分反应，使得通过利用不同的连接体，颗粒可以装载有蛋白质和/或核酸。
[0358]
xvi.用于制作清除颗粒的方法
[0359]
在一些方面中，本发明涉及用于制作清除颗粒的方法。方法可以包括将颗粒与多个药剂反应。多个药剂中的每个药剂可以包括官能团或预定部分，所述官能团或预定部分能够选择性地与多个反应基团中的反应基团反应。每个反应基团可以在颗粒上被定向，使得在药剂被偶联至颗粒之后，药剂具有降低的结合至细胞(例如，真核细胞(如二倍体细胞(如人二倍体细胞(如免疫细胞或癌细胞))))表面上的分子的能力。
[0360]
方法还可以包括将多个药剂与多个连接体反应，例如，在将颗粒与多个药剂反应之前。例如，多个连接体中的每个连接体可以包括第一官能团，所述第一官能团能够选择性地与具有预定部分的药剂反应，所述预定部分能够与第一官能团反应。多个连接体中的每个连接体可以包括第二官能团，所述第二官能团能够选择性地与颗粒的反应基团反应。因此，药剂可以被功能化，以添加可以选择性地与颗粒的反应基团反应的官能团。每个连接体可以包括保护基团，例如，所述保护基团保护第二官能团。方法还可以包括脱保护连接体，例如，在将多个药剂与多个连接体反应之后。
[0361]
方法还可以包括将颗粒与多个连接体反应，例如，在将颗粒与多个药剂反应之前。例如，多个连接体中的每个连接体可以包括第二官能团，所述第二官能团能够选择性地与反应基团反应。多个连接体中的每个连接体可以包括第一官能团，所述第一官能团能够选择性地与具有预定部分的药剂反应，所述预定部分能够与第一官能团反应。因此，颗粒可以
被功能化，以选择性地与药剂的预定部分反应。每个连接体可以包括保护基团，例如，所述保护基团保护第一官能团。方法还可以包括脱保护连接体，例如，在将颗粒与多个连接体反应之后。
[0362]
例如，如果药剂的结合区域偶联至反应基团和/或连接体，则制备清除颗粒的方法可以导致包括不能结合至生物分子的药剂的颗粒。药剂群体仍然可以是可使用的以特异性地结合至生物分子。在一些实施方案中，多个药剂中的每个药剂可以特异性地结合至生物分子。在一些实施方案中，颗粒的每个药剂可以特异性地结合至生物分子。
[0363]
制备清除颗粒的方法可以导致包括可以与细胞(如癌细胞或免疫细胞)相互作用的药剂的颗粒。药剂群体仍然可以表现降低的结合至细胞(例如，二倍体人细胞、癌细胞和/或免疫细胞)表面上的分子的能力。在一些实施方案中，例如，相对于被固定在颗粒的外表面上的药剂，多个药剂中的每个药剂表现降低的结合至细胞(例如，二倍体人细胞、癌细胞和/或免疫细胞)表面上的分子的能力。在一些实施方案中，例如，相对于被固定在颗粒的外表面上的药剂，颗粒的每个药剂表现降低的结合至细胞(例如，二倍体人细胞、癌细胞和/或免疫细胞)表面上的分子的能力。
[0364]
上述适用于本文中描述的任何组合物和方法。本公开具体地预期了这样的组合物和方法(单独或组合)的特征与用于描述本节中描述的各种试剂盒的特征的任何组合。
[0365]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中描述了优选的方法和材料，尽管与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料也可以被用于实践或测试本发明公开的方法和组合物。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用被整体并入本文。
[0366]
本公开预期了任何前述方面和实施方案的所有组合，以及与详细说明和实施例中阐述的任何实施方案的组合。在考虑以下实施例时，将进一步理解本公开的这些和其它方面，所述实施例旨在说明本公开的某些特定实施方案，但不旨在限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。
[0367]
范例
[0368]
实施例1-用于制造硅颗粒的方法
[0369]
多孔硅盘被制造具有1000nm
×
400nm以及1000nm
×
800nm的尺寸和可变的孔尺寸。盘的尺寸和形貌以及孔直径通过扫描电子显微镜进行表征。金纳米颗粒(au)被沉积在多孔硅盘的孔中。肿瘤坏死因子(tnf)通过配位共价键接合至金纳米颗粒的表面。评估配体密度和tnf-au结合稳定性。
[0370]
实施例2-用于制造聚合物颗粒的方法
[0371]
通过乳状液制备聚(交酯-共-乙交酯)(plga)颗粒。plga颗粒的尺寸和形貌通过扫描电子显微镜、原子力显微镜和透射电子显微镜来表征。颗粒用季铵β-环糊精盖覆，用于巨噬细胞募集(即吞噬作用)。通过原子力显微镜和透射电子显微镜验证覆层。覆层密度和均匀性通过透射电子显微镜和动态光散射进行表征。
[0372]
将β-环糊精盖覆的plga颗粒与巨噬细胞一起温育，并且通过荧光显微镜和通过流式细胞仪监测吞噬作用。
[0373]
β-环糊精盖覆的plga颗粒用聚乙二醇(peg)和硫醇部分的混合物盖覆，以允许阻止巨噬细胞吸收的调理素作用和逃避，以及结合至其他颗粒。peg和硫醇覆层的均匀性和密
度通过原子力显微镜进行表征。覆层稳定性通过将颗粒在介质中温育不同的时间段进行表征。如上文中描述的，通过将颗粒与巨噬细胞一起温育，在不同的时间点监测颗粒的逃避和吸收。
[0374]
用肿瘤坏死因子(tnf)盖覆plga颗粒，并且颗粒通过二硫键组合以形成“海绵”，所述“海绵”包括在海绵的内部表面上的tnf。海绵的外部表面(即，外表面)可选地被不包括tnf的颗粒封闭，以阻止海绵的tnf与细胞之间的相互作用。
[0375]
虽然本公开已经参考其具体实施方案被描述，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以取代等同物。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质的组成、过程、工艺步骤或多个步骤适合于本公开的目标、精神和范围。所有这样的修改被意图在本公开的范围之内。
[0376]
实施例3-用于制造dna颗粒的方法
[0377]
dna纳米管将使用与douglas等(nature 459(7245):414-8(2009)，其以引用方式被整体并入本文)中描述的方案类似的方案被组装。纳米管将包含五个内部生物素。未被并入纳米管中的dna链将使用300kda mwco过滤单元被除去。纳米管将通过原子力显微镜被表征。
[0378]
生物素标记的tnfα将以3:1的比例与抗生蛋白链菌素四聚物混合，以产生浓度为约300nm的具有结合至一个抗生蛋白链菌素分子的三个人tnfα的tnfα模块。然后tnfα模块将与dna纳米管温育，以产生包括tnfα模块的纳米管。纳米管将使用300kda mwco过滤单元提纯并且通过原子力显微镜被表征。
[0379]
tnfα测定将被用于证实tnfα模块被附连至纳米管并且产生浓度为5nm、10nm、15nm、25nm、35nm和50nm的包括tnfα的纳米管的溶液(abcam catalogue#_ab181421)。
[0380]
将使用elisa测定(abcam catalog#ab100642)评估tnfα纳米管结合可溶性tnf受体的能力。简而言之，纳米管将以各种浓度被添加到盖覆有抗可溶性tnf受体抗体的96孔板的不同孔中。可溶性tnf受体将被添加到孔中，板将被温育一段时间，并且然后纳米管连同结合至纳米管的可溶性tnf一起将从孔中被洗涤。生物素化的抗可溶性tnf受体抗体将被添加到孔中，孔将被洗涤以去除未结合的抗体，辣根过氧化物酶缀合的抗生蛋白链菌素将被添加到孔中，孔将被洗涤以去除未结合的辣根过氧化物酶，并且3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)将被添加到孔中。结合至孔的抗tnf受体抗体的tnf受体的量将通过监测450nm处的tmb和/或在650nm处从tmb生成的3,3’,5,5
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四甲基联苯胺二亚胺被定量。接受较高浓度纳米管的孔将在450nm处显示较高的吸光度并且在650nm处显示较低的吸光度，对应于结合至孔的较少的可溶性tnf受体，并且因此较低的过氧化物酶活性。
再多了解一些
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