双硫仑在增强免疫反应中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种双硫仑在增强免疫反应(特别是抗肿瘤免疫反应)中的应用。


背景技术：

2.双硫仑(disulfiram，dsf)，是二硫代氨基甲酸酯家族的成员之一，在临床上广泛应用于抗酗酒药物(hamidreza fasehee，ardeshir ghavamzadeh，kamran alimoghaddam，et al.a comparative cytotoxic evaluation of disulfiram encapsulated plga nanoparticles on mcf-7cells[j].ijhoscr，2017，11：16-21.)。近年来，学者们通过研究发现dsf对多种癌症类型均表现出强烈的细胞毒性，包括直肠癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、乳腺癌及前列腺癌等(morrison bw，doudican na，patelkr，et al.disulfiram induces copper-dependent stimulation of reactive oxygenspecies and activa-tion of the extrinsic apoptotic pathway in melanoma[j]，melanoma res，2010，20：11-20.)。dsf在血液恶性肿瘤和实体瘤的抗癌作用，已经在临床前研究中被证实(robinson tj，pai m，liu jc，et al.high-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells：interaction with iq motif-containing factors[j].cell cycle，2013，12：3013-3024；mohammad najlah，zahima ahmed，mohammed iqbal，et al.development and characterisation of disulfiram-loaded plga nanoparticle for the treatment of non-small cell lung cancer[j].eur j pharm biopharm，2017，112：224-233.)，其作用机制涉及抑制醛脱氢酶(aldh)活性、诱导细胞毒性、抑制多种蛋白酶体和nf-κb活性、激活sapk/jnk通路等(吕晓燕，徐学君，徐德琴等.双硫仑抗肿瘤作用研究进展.中国药业.2019，28(7：)：94-96)。尚未见dsf在免疫治疗方面的报道。


技术实现要素：

[0003]
本发明提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于促进t细胞受体(t cell receptor，tcr)激活的药物中的应用。
[0004]
具体地，上述tcr为cd8

t细胞中的tcr。
[0005]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于激活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)的药物中的应用。
[0006]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于促进cd8和lck的结合的药物中的应用。
[0007]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于激活t细胞的药物中的应用。
[0008]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于促进代谢重编程的药物中的应用。
[0009]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于促进ifn-γ的产生的药物中的
应用。
[0010]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于促进tnf-α的产生的药物中的应用。
[0011]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于增强cd8

t细胞免疫反应的药物中的应用。
[0012]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于增强肿瘤微环境中cd8

t细胞的抗肿瘤免疫反应的药物中的应用。
[0013]
具体地，上述肿瘤微环境中cd8

t细胞的抗肿瘤免疫反应的增强特征包括：肿瘤浸润cd8

t细胞的数量和/或比例增加。
[0014]
本发明提供一种双硫仑或其衍生物在制备免疫治疗药物中的应用。
[0015]
具体地，上述免疫治疗药物可用于治疗肿瘤，其中，双硫仑或其衍生物可通过增强cd8

t细胞的免疫反应，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
[0016]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于增强抗肿瘤免疫反应的药物中的应用。
[0017]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于降低、逆转肿瘤免疫治疗的耐药性的药物中的应用。
[0018]
具体地，上述免疫治疗包括：施用单克隆抗体、施用免疫检查点抑制剂、施用癌症疫苗、进行过继性细胞免疫治疗(例如，嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法)等。
[0019]
在本发明的一个实施方式中，上述免疫治疗包括施用免疫检查点抑制剂，例如，单独施用免疫检查点抑制剂，或施用免疫检查点抑制剂与化学疗法、放射疗法、靶向治疗、中医中药治疗、基因治疗、内分泌治疗、高温治疗、激光治疗、冷冻治疗等肿瘤治疗手段中的一种或多种联合。
[0020]
具体地，上述免疫检查点抑制剂可以为，例如，针对pd-1、pd-l1、ctla-4、btla、tim-3、lag-3、tigit、lair1、2b4、cd160等的免疫检查点抑制剂，特别是抗pd-1抗体(例如抗pd-1单克隆抗体)、抗pd-l1抗体(例如抗pd-l1单克隆抗体)。
[0021]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于过继性细胞免疫治疗的药物中的应用。
[0022]
具体地，上述过继性细胞免疫治疗为过继性t细胞治疗。
[0023]
本发明还提供一种双硫仑或其衍生物在制备用于提高过继性细胞免疫治疗功效的药物中的应用。
[0024]
本发明还提供一种免疫治疗方法，其包括向需要其的受试者施用双硫仑或其衍生物的步骤。
[0025]
具体地，上述免疫治疗方法可用于肿瘤的治疗。
[0026]
发明人通过大量实验研究发现，dsf可促进cd8

t细胞中的t细胞受体激活，结合并激活lck，可直接激活t细胞和代谢重编程，显著促进ifn-γ和tnf-α的产生，增强cd8

t细胞的免疫反应。通过动物实验发现，dsf治疗组动物的肿瘤浸润cd8

t细胞的比例和数量均升高，其可显著抑制肿瘤(例如结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌等)生长，延长存活期。
附图说明
[0027]
图1所示为显示dsf促进tcr介导的t细胞中p-s6的活性的实验结果。
[0028]
图2所示为显示dsf以计量依赖的方式促进tcr介导的t细胞中p-s6活性的实验结果。
[0029]
图3所示为显示naddc促进tcr介导的t细胞中p-s6的活性的实验结果。
[0030]
图4所示为显示dsf激活t细胞受体信号传导的实验结果。
[0031]
图5所示为显示dsf激活t细胞受体信号传导的实验结果。
[0032]
图6所示为显示dsf激活t细胞受体信号传导的实验结果。
[0033]
图7所示为显示dsf直接激活t细胞的实验结果。
[0034]
图8所示为显示dsf直接激活t细胞的实验结果。
[0035]
图9所示为显示dsf直接激活t细胞的实验结果。
[0036]
图10所示为显示dsf促进lck与cd8结合的实验结果。
[0037]
图11所示为显示dsf促进lck与cd8结合的实验结果。
[0038]
图12所示为显示dsf结合lck的实验结果。
[0039]
图13所示为显示dsf直接结合lck的实验结果。
[0040]
图14所示为显示dsf激活t细胞和代谢重编程的实验结果。
[0041]
图15所示为显示dsf激活t细胞和代谢重编程的实验结果。
[0042]
图16所示为显示dsf激活t细胞和代谢重编程的实验结果。
[0043]
图17所示为显示dsf激活t细胞和代谢重编程的实验结果。
[0044]
图18所示为显示cuet抑制4t1的活力，但不抑制b16f10和mc38的活力的实验结果。
[0045]
图19所示为显示dsf以cd8依赖性方式抑制肿瘤生长的实验结果。
[0046]
图20所示为显示dsf促进mc38肿瘤模型中cd8
t细胞的抗肿瘤活性的实验结果。
[0047]
图21所示为dsf以cd8依赖性方式抑制肿瘤生长的实验结果
[0048]
图22所示为dsf以cd8依赖性方式抑制肿瘤生长的实验结果。
[0049]
图23所示为dsf以cd8依赖性方式抑制肿瘤生长的实验结果。
具体实施方式
[0050]
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0051]“肿瘤(tumor)”是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，可将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。“恶性肿瘤”是指以不可控制的恶性细胞生长和扩散，以及组织浸润为特征，并经药理检验确定符合国家卫生部公布的“疾病和死因分类”标准归属于恶性肿瘤之列的疾病，例如，但不限于，淋巴瘤、母细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜细胞肉瘤、神经内分泌肿瘤、类癌肿瘤、胃泌素瘤、胰岛细胞癌、间皮瘤、神经鞘瘤、听神经瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴样恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺癌肺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门
癌、阴茎癌、梅克尔细胞癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈部癌和血液恶性肿瘤。在本发明，恶性肿瘤特别是乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、宫颈癌、鼻咽癌等。
[0052]“免疫治疗(immunotherapy)”是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。肿瘤的免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。目前，用于恶性肿瘤的免疫治疗主要包括使用单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、非特异性免疫疗法(使用细胞因子、白细胞介素、干扰素等)、嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法等。其中，免疫检查点抑制剂可以为，例如，针对pd-1、pd-l1、ctla-4、btla、tim-3、lag-3、tigit、lair1、2b4、cd160等的免疫检查点抑制剂，特别是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体。
[0053]“过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy，act)”是指将具有抗肿瘤功能的免疫效应细胞(自体或异体的)在体外激活和大量扩增后，回输到患者体内，从而达到直接杀伤肿瘤细胞或激发机体的免疫反应杀伤肿瘤细胞目的的治疗方法。act主要包括过继性t细胞治疗(如tcr-t疗法、car-t疗法)、过继性nk细胞治疗。
[0054]
双硫仑的“衍生物”是指双硫仑结构中的氢原子或基团被其他原子或基团取代所形成的化合物，特别是具有相同或相似功能的化合物，其可以为现有技术中已知的双硫仑衍生物，也可以根据现有技术中已知的结构修饰方法制备得到的双硫仑衍生物。
[0055]“cd8

t细胞”是指细胞表面表达cd8的t细胞，其通常在激活后分化为细胞毒性t细胞(ctl)，可特异性识别并杀伤靶细胞。
[0056]
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0057]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0058]
实施例1 dsf促进cd8

t细胞中的t细胞受体激活
[0059]
为了探索新药是否具有t细胞功能的能力，发明人对112种已知的抗癌代谢化合物进行了高通量筛选，发现在cd8

t细胞中，fda批准的非抗肿瘤药物双硫仑(dsf)显著促进tcr介导的s6核糖体亚基的磷酸化。表明dsf可以增强t细胞中tcr信号通路下游的蛋白质合成(如图1所示)。流式细胞术数据显示，dsf预处理促进tcr介导的s6磷酸化呈剂量依赖性上调(如图2所示)。这些数据提示dsf可促进t细胞受体信号传导通路的磷酸化。作为dsf的代谢候选物，naddc促进cd8

t细胞中tcr介导的p-s6活性(如图3所示)。为了进一步证实dsf对p-s6的作用，发明人进行了western blot以检测作为s6激酶的p70s6激酶的磷酸化(如图4所示)，结果显示，dsf显著促进了p70s6激酶的磷酸化。出乎意料的是，发明人发现dsf直接激活p-p70s6k的活性，p-p70s6k的磷酸化甚至高于抗cd3和cd28共刺激。提示dsf可能直接激活tcr信号通路。为了进一步研究dsf对tcr信号通路的影响，发明人通过western blot检测dsf对tcr介导的近端信号的影响，如lck和zap 70的磷酸化。结果发现，dsf直接激活zap70的磷酸化，且直接抑制lck(y505)(tcr活化的抑制位点)的磷酸化(如图5和6所示)。
[0060]
为了确定dsf对tcr激活的作用，发明人使用了荧光素酶报告系统测定(如图7和8
所示)。发明人发现，dsf直接激活nfat转录，dsf与抗cd3和cd28之间没有显著性差异(如图9所示)。与单独的抗cd3刺激相比，dsf预处理组的nfat荧光素酶没有差异。当dsf与抗cd28联合使用时，nfat活性与经典tcr刺激抗cd3和cd28没有差异(如图8所示)。所有这些数据表明，dsf可能是非经典tcr激活配体，直接激活t细胞受体信号传导通路。
[0061]
实施例2 dsf结合并激活lck
[0062]
接下来，发明人寻求确定dsf激活tcr信号通路的潜在机制。由于dsf是锌指结构蛋白激活活性最强的化合物，发明人推测dsf能够结合并激活lck。t细胞共同受体cd8通过它们的胞质尾区(cxcp基序)与src家族酪氨酸激酶lck n-末端(cxxp基序)结合，这些相互作用需要锌离子存在并且对于t细胞的激活是关键的。使用分子对接和mm/gbsa，发明人预估dsf对lck-cd 4/8二聚体的结合亲和力。dsf与界面上的复合物相互作用并促进它们之间的连接，而不是锌离子。mm/gbsa进一步计算了双硫仑与复合物的结合自由能(δg)。与lck-cd 4二聚体结合的双硫仑δg为-26.97kcal/mol，而与lck-cd8二聚体结合的双硫仑δg为-32.08kcal/mol。然而，锌与4个半胱氨酸残基的结合自由能为-12.44kcal/mol。因此，双硫仑代替络合物中的锌，并充当lck和cd4/8之间的桥联分子。
[0063]
发明人使用活细胞pull down实验进一步证实其假设，发现dsf可以促进cd8和lck的结合(如图10所示)。接下来，发明人构建lck突变体，以打断lck与cd8的结合，这在功能上对于lck和cd8相互作用是必需的(如图11所示)。活细胞pull down实验显示当lck突变后，dsf促进lck和cd8结合的相互作用消失(如图11所示)。已有研究表明dsf通过共价修饰结合cys残基从而结合靶蛋白。因此，发明人进行活细胞pull down实验，在dtt组中未检测到相互作用(如图11所示)。发明人使用药物亲和力响应靶点稳定性(darts)作为另一种独立的方法，其原理是药物与蛋白质结合时能够保护蛋白质构象，使其不被链霉蛋白酶水解。与发明人推测结果一致，暴露于dsf导致lck(wt)而非lck(mut)的差异链霉蛋白酶依赖性蛋白水解模式(如图12所示)。此外，发明人使用微量热泳动(mst)作为结合实验分析的另一独立方法验证结果。mst结合测定显示dsf以86.812nm的解离常数与lck结合(如图13所示)。这些结果表明，dsf直接靶向lck，并且lck的锌指结构域对于其相互作用是必需的。
[0064]
实施例3 dsf直接激活t细胞和代谢重编程
[0065]
为了确定dsf对t细胞功能的影响，发明人进行了rna-seq分析，结果表明，dsf预处理显著激活了t细胞激活相关基因的表达，如cd69和cd44并富集了tcr信号传导途径和糖酵解途径(如图14所示)。在抗原识别和共刺激后，t细胞上调增殖和维持效应细胞功能所需的代谢水平。在氧存在下，静息细胞依靠线粒体氧化磷酸化(oxphos)产生免疫监视所需的能量。相反，t细胞使用有氧糖酵解以满足它们的生物合成需求。为了评估dsf对t细胞代谢变化的影响，发明人测量了两种内在细胞生物能参数。用xf96细胞外流分析仪测定氧消耗速率(ocr)和细胞外酸化速率(ecar)。ocr是线粒体oxphos的指标，并且ecar主要是在糖酵解能量代谢过程中形成的乳酸的量度并且因此反映总的糖酵解通量。在用dsf处理后，t细胞ecar和ocr的水平显著增加，甚至高于抗cd3和cd28应答(如图15所示)。此外，dsf的oxphos最大呼吸率高于对照组，与抗cd3和cd28水平相当。为了进一步证实dsf在代谢重编程中的作用，发明人用2-dg和met处理黑色素瘤荷瘤小鼠，以抑制t细胞中的糖酵解。与仅用dsf处理组相比，2-dg和二甲双胍以及dsf联用组荷瘤小鼠显示出较弱的抗肿瘤活性(如图16所示)。
[0066]
为探讨dsf对ifn-γ和tnf-α产生的影响，发明人用ova或ova-突变肽以primeot-i(分离自卵清蛋白(ova特异性tcr转基因))细胞，流式分析结果显示，dsf显著促进ifn-γ和tnf-α的产生(如图17所示)。这些数据表明dsf直接激活t细胞。
[0067]
实施例4 dsf通过cd8

t细胞抑制肿瘤生长
[0068]
由于dsf抗癌活性在乳腺癌中已被证明是铜依赖性的，发明人检测了dsf和dtc-铜络合物双(二乙基二硫代氨基甲酸)-铜(cuet)形式对其他肿瘤细胞活性的影响。短期(24小时)测定显示，在小鼠4t1乳腺癌细胞中cuet的细胞毒性较高，但在小鼠b16f10和mc38癌细胞中cuet的细胞毒性较低(如图18所示)。为了探讨dsf对小鼠黑色素瘤的体内抗肿瘤作用，发明人对比了小鼠组：先构建b16f10黑色素瘤荷瘤小鼠模型，喂饲(i)正常饮食(对照组)；(ii)正常饮食加dsf；然后随时间测量肿瘤体积和存活率(如图19a和b所示)。与对照组相比，dsf治疗组的肿瘤体积被显著抑制。出乎意料的是，在注射肿瘤后第21天，dsf组一只小鼠的肿瘤消退。dsf组的死亡率显著降低。dsf治疗组小鼠的肿瘤浸润cd8

效应t细胞的比例和数量升高(如图19c和d所示)。在mc-38肿瘤模型中的研究表明，dsf治疗组小鼠肿瘤生长减慢(如图20所示)。这些数据表明，在黑色素瘤和结肠癌治疗过程中，dsf的抗肿瘤效应可能不止依赖于其代谢产物的肿瘤杀伤效应，还存在其他事件。
[0069]
cd8

t细胞在抗肿瘤免疫中发挥非常重要的作用。因此，发明人考虑dsf的抗肿瘤作用是否依赖于cd8

t细胞。为检验这一假说，发明人将b16-ova细胞和dsf处理的ot-i t细胞共培养，以检测dsf对t细胞介导的细胞毒性的影响(如图21所示)。当b16f10荷瘤小鼠的cd8

t细胞耗尽时，肿瘤生长速度高于dsf组(如图22所示)。这些数据表明cd8

t细胞在dsf介导的抗肿瘤作用中是关键的。为了进一步证实dsf对cd8

t细胞活性的作用，发明人将dsf处理的ot-i t细胞过继转移到荷瘤小鼠中，用dsf处理过的cd8

t细胞回输后荷瘤小鼠表现出更强的抑制肿瘤生长和延长存活期的能力(如图23所示)。这些数据表明，dsf在cd8

t细胞介导的抗肿瘤免疫中起关键作用。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0071]
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
[0072]
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。