含Pan-HDAC和免疫检查点抑制剂的组合及应用的制作方法

含pan-hdac和免疫检查点抑制剂的组合及应用
技术领域
1.本技术属于癌症治疗领域，具体地，本发明涉及包含pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂的组合在制备预防复发性淋巴瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.表观遗传学是研究不涉及dna序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴学科。表观遗传学修饰及其遗传机制包括dna甲基化、组蛋白修饰、非编码rna和基因组印记等。目前研究最为广泛和深入的组蛋白修饰是核小体组蛋白赖氨酸乙酰化；在染色质重塑和基因表达调控等方面发挥重要作用，这种修饰在体内受到组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶(histone deacetylase，hdac)的高度动态调控。hdac在肿瘤发生和发展的多个环节中扮演着非常重要的角色；hdac基因表达变化和突变，诱导关键基因异常转录，从而影响到肿瘤抑癌基因沉默、细胞分化、血管生成、细胞迁移、细胞周期异常、信号传导及细胞附着等。pan-hdac抑制剂通过靶向抑制hdac，调控组蛋白的乙酰化，进而调控关键的肿瘤抑制蛋白和原癌基因，因此也成为癌症治疗的可选途径之一。n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺属于pan-hdac抑制剂，可作用于hdac1、2、3、6、10亚型，实验表明其可以通过多种途径对肿瘤产生抑制效果。
[0003]
免疫检查点是一类可以调节自身免疫功能的蛋白小分子，免疫检查点是肿瘤发生和进展中免疫耐受的主要原因之一，可以通过抑制和刺激适当的免疫检查点来实现对肿瘤的治疗，目前研究较多并已投入市场的免疫检查点抑制剂药物主要为pd-1、pd-l1、ctla-4抗体类药物，如伊匹单抗、帕姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗等。尽管免疫检查点抑制剂药物在临床上取得了巨大的成功，但也存在一些不足，如人群总体有效率不高，耐药问题导致其应用受限。基于我们对pan-hdac抑制剂作用机制的深刻认识，我们就n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺在提高免疫检查点抑制剂的有效率及克服、延缓继发性耐药方面进行了研究，并获得了显著的实质性结果。我们的研究表明n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺不但能显著提高免疫检查点抑制剂的有效率，延长荷瘤动物的生存期，而且还发现对于治疗中肿瘤完全消退的动物，其体内产生了免疫记忆细胞，当遇到相同肿瘤细胞再激发时，能够起到长期保护作用。我们本项研究成果将完善肿瘤个体化治疗方案及不同治疗策略的应用，进一步推进肿瘤精准治疗的发展。
[0004]
目前尚无将pan-hdac和免疫检查点抑制剂联合应用的药物或治疗方法先例。


技术实现要素：

[0005]
一方面，本发明提供了一种药物组合在制备预防复发性淋巴瘤的药物中的应用，所述药物组合包含pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂；pan-hdac抑制剂优选为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺或其盐；免疫
检查点抑制剂优选为pd-1或ctla-4抗体。
[0006]
所述n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺盐优选对甲苯磺酸盐、盐酸盐、萘-1,5-二磺酸盐、萘-2-磺酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
[0007]
进一步地，pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂的含量比例优选为5-10:1-5。进一步地，pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的对甲苯磺酸盐，免疫检查点抑制剂为pd-1；pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂的含量比例为8:1。
[0008]
进一步地，所述药物组合为口服制剂或注射剂。
[0009]
本技术中abexinostat、艾贝司他、xp101、pci-24781、n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺可以交替使用，均是指如下化学式的化合物：
[0010][0011]
本技术中所述的药物组合形式包括但不限于将pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂配制成组合物，在同一包装中分别提供pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂以及在不同的包装中分别提供pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂但联合使用。
[0012]
本技术中的“预防”意为防止治愈后的癌症或相关症状再次发生。
[0013]
除淋巴瘤外，本技术中的所治疗或者预防的癌症包括已知的和研究中的与pan-hdac或免疫检查点相关的癌症，包括但不限于淋巴瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、头颈癌、脑癌、鼻咽癌、骨癌、肠癌、胃癌、神经肿瘤、血癌等；优选淋巴瘤。本技术中所述癌症可以为原发、复发性或转移癌症，优选为复发性癌症。
[0014]
本技术的组合物可用于各种动物，包括但不限于灵长类哺乳动物、鼠、牛、马、犬、鸡、鸭、鹅类等，优选灵长类哺乳动物，特别优选人科。
[0015]
本技术中的pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂的给药特征根据盐的种类、抑制剂的种类、剂型、受试者情况的不同而变化，本领域技术人员或医师可以根据需要变化给药剂量、频率、持续时长等给药特征。
[0016]
本技术的剂型可选本领域已知和研究中的各种剂型，包括大不限于口服剂型如片剂、胶囊剂、口服液体制剂、丸剂、颗粒剂、散剂；注射剂型如水针剂、油针剂、乳针剂、粉针剂；以及其他剂型，如外用剂型，例如软膏剂、贴剂、喷剂等；制备这些剂型所需的方法和辅料可以在药剂学相关书籍和文献中获得，
[0017]
本领域技术人员可以根据药学领域一般知识为本技术所涉及的药物选择适合的辅料，可用的辅料种类包括但不限于溶剂、助溶剂、稳定剂、分散剂、粘度调节剂、抗氧化剂、甜味剂、粘合剂、气体发生剂等；本技术中优选的注射剂中辅料为水和hp-β-cd。
[0018]
本技术的药物组合和方法可以与其他已知和研究中的治疗或辅助治疗癌症的药物或方法联合使用，这些药物或方法包括但不限于，化疗及相应化疗药物、放射性疗法、免
疫治疗方法以及相应药物、中草药等。
附图说明
[0019]
图1为各组平均体重变化图。
[0020]
图2为各组平均体重下降率(％)变化图。
[0021]
图3为各组平均肿瘤体积生长曲线。
[0022]
图4为各组平均相对肿瘤体积变化图。
[0023]
图5为生存曲线图。
[0024]
图6为re-challenge肿瘤生长曲线。
具体实施方式
[0025]
本技术中的缩写和替换表述方式：
[0026][0027]
[0028]
本技术中研究的技术方案
[0029]
本技术了提供了一种药物组合，其特征在于，所述药物组合包含pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂。
[0030]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺。
[0031]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的盐。
[0032]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的对甲苯磺酸盐、盐酸盐、萘-1,5-二磺酸盐、萘-2-磺酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
[0033]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的对甲苯磺酸盐。
[0034]
进一步地，所述免疫检查点为pd-1、pd-l1或ctla-4。
[0035]
进一步地，所述免疫检查点为pd-1。
[0036]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂为抗体。
[0037]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂为单克隆抗体。
[0038]
进一步地，所述药物组合用于治疗或预防癌症。
[0039]
进一步地，所述癌症为淋巴瘤。
[0040]
进一步地，所述癌症为复发癌症。
[0041]
另一方面，本技术提供了上述药物组合在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
[0042]
进一步地，所述癌症为淋巴瘤。
[0043]
进一步地，所述癌症为复发癌症。
[0044]
进一步地，所述药物组合为口服制剂或注射剂。
[0045]
进一步地，所述药物组合为注射剂。
[0046]
本技术提供了还提供了使用上述药物组合治疗或预防癌症的方法，包括向患有癌症的对象施用pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂。
[0047]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺。
[0048]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的盐。
[0049]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的对甲苯磺酸盐、盐酸盐、萘-1,5-二磺酸盐、萘-2-磺酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
[0050]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂为n-羟基-4-{2-[3-(n,n-二甲基氨基甲基)苯并呋喃-2-基羰基氨基]乙氧基}-苯甲酰胺的对甲苯磺酸盐。
[0051]
进一步地，所述免疫检查点为pd-1、pd-l1或ctla-4。
[0052]
进一步地，所述免疫检查点为pd-1。
[0053]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂为抗体。
[0054]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂为单克隆抗体。
[0055]
进一步地，所述癌症为淋巴瘤。
[0056]
进一步地，所述癌症为复发癌症。
[0057]
进一步地，pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂同时施用。
[0058]
进一步地，pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂在同一药物组合物中施用。
[0059]
进一步地，pan-hdac抑制剂和免疫检查点抑制剂分别施用。
[0060]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂的给药剂量为每次40-100mg。
[0061]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂的给药剂量为每次80mg。
[0062]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂的给药频率为每2日1次至每日3次，每周1-7次。
[0063]
进一步地，所述pan-hdac抑制剂的给药频率为每日2次，2次之间间隔4小时，每周7次，持续一周后停药7日，以28日为一个治疗周期；或者每28日治疗周期内第1-4日、第8-11日和第15-18日每日2次，2次之间间隔4小时。
[0064]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药剂量为1-50mg/kg。
[0065]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药剂量为10mg/kg。
[0066]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药的频率为每周1-6次。
[0067]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药的频率为每周2次。
[0068]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药时长为1-6周。
[0069]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂的给药时长为3周。
[0070]
实施例1实验药品、动物、仪器和一般方法
[0071]
实验药品和主要试剂：
[0072]
实验药品xp101由申请人自行提供，基本信息如下：
[0073][0074]
分子式：c
21h23
n3o5，c7h8o3s
[0075]
分子量：569.6(397.431 172.205)
[0076]
手性/立体化学：无不对称碳
[0077]
碱基换算系数：0.698。
[0078]
实验药品anti-mouse ctla4由bioxcell提供。
[0079]
实验药品anti-mouse pd-1由bioxcell提供。
[0080]
溶媒20％hp-β-cd由广州智媛生物科技有限公司提供。
[0081]
实验用细胞系：a20小鼠b细胞淋巴瘤细胞系来源于atcc。
[0082]
其他试剂：
[0083]
[0084][0085]
实验动物和饲养：
[0086]
动物种属及品系：
ꢀꢀꢀ
balb/c小鼠
[0087]
给药记录：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无给药史
[0088]
性别、年龄、体重：
ꢀꢀꢀ
雌性，5-6周龄，18-20克
[0089]
养殖方/供应商：
ꢀꢀꢀꢀ
上海灵畅生物科技有限公司
[0090]
适应期：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
7天
[0091]
房间：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
spf区房间
[0092]
室内温度：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20-26℃
[0093]
室内相对湿度：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
40-70％
[0094]
灯光：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
日光灯照明，12小时照明(08:00-20:00)及12小时无照明
[0095]
动物饲养：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
每笼2-6只(同一给药组)
[0096]
食物：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无限量获取饲料(经辐照消毒，江苏省协同医药生物工程有限公司，中国)
[0097]
水：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无限量获取饮用水(经反渗透或高压灭菌处理并酸化的自来水)
[0098]
从供应商处购入共计68只用于本实验。动物均无特定病原，到达动物房时为4-5周。动物到达后，动物房人员将动物从运输包装中转移至鼠笼并对每只动物进行检查。检查范围包括外观、四肢和孔腔等，以及动物静止或运动时是否有异常表现。适应期7天。
[0099]
主要仪器设备：
[0100]
仪器公司型号离心机赛默飞世尔thermo fisher legend mach 1.6/倒置显微镜尼康ts100生物安全柜(细胞培养)赛默飞世尔1379co2培养箱赛默飞世尔thermo hera cell 150水浴锅上海精宏dk-8b液氮罐赛默飞世尔thermo locator 4移液器(电动)(细胞培养)capppa-100移液器(1ml)(细胞培养)艾本德l20989h移液器(100μl)(细胞培养)艾本德l38752h移液器(20μl)(细胞培养)艾本德n22990h麻醉机matrxmatrx vip3000生物安全柜(细胞接种)赛默飞世尔thermo msc-advantage生物安全柜(配药)赛默飞世尔thermo msc-advantage
天平(动物体重)美国丹佛denver instrument tp-602游标卡尺日本三丰mitutoyo cd-15cx
[0101]
实施例2细胞培养
[0102]
用于本实验的小鼠b细胞淋巴瘤细胞系a20，以rpmi-1640培养基添加10％fbs培养于含5％co2的37℃培养箱。细胞连续培养两代后，接种于68只balb/c小鼠皮下。每只小鼠接种1
×
106a20细胞，将其重悬于pbs，通过皮下注射接种于小鼠，接种体积为100μl。接种前用2-5％异氟烷将小鼠麻醉。
[0103]
实施例3动物分组和给药方案
[0104]
当肿瘤生长到67mm3时，48只荷瘤小鼠根据肿瘤体积和体重被随机分成6组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表1所示：
[0105]
表1.分组和给药方案
[0106][0107][0108]
n:每组动物只数
[0109]
给药体积:动物的给药体积按照10μl/g进行调整
[0110]
实施例4药物配制：
[0111]
表2.药物配置步骤
[0112][0113]
实施例5实验过程
[0114]
笼边观察
[0115]
每天观察每只小鼠的外观及行为，自分组开始连续观察。所有非正常的外观形态和行为活动都记录在实验室临床观察表内。
[0116]
测定
[0117]
笼边观察：自给药开始每天观察每只小鼠的外观及行为。自分组开始连续观察。
[0118]
所有非正常的外观形态和行为活动都记录在澎立生物实验室临床观察表内。
[0119]
肿瘤体积：分组后每周测量肿瘤体积两次直至实验结束。肿瘤体积(v)的计算方法如下：v＝(长
×
宽2)/2。每只小鼠相对肿瘤体积(rtv)的计算方法是：rtv＝vt/v0，其中vt为每天的测量体积，v0为治疗开始时的体积。
[0120]
动物体重：分组后每周测量并记录老鼠体重两次。
[0121]
实验停药和恢复给药标准
[0122]
在实验过程中，小鼠遵循以下原则进行停、复给药：体重下降≥10％时，即停止给药，停药期应足够长让小鼠恢复体重；仅单只小鼠停药，其余小鼠正常给药；体重下降《10％即恢复给药。本实验中未发生小鼠停药情况。
[0123]
安乐死及取材
[0124]
在实验过程中，若出现以下任何一项或多项情况时，应对动物实施安乐死：
[0125]
1)当单只动物荷瘤体积超过2000mm3；
[0126]
2)肿瘤发生溃疡、坏死或感染；
[0127]
3)动物出现行动异常，或瘫痪；
[0128]
4)动物体重连续3天降低超过开始药物处理时体重的20％。
[0129]
体内实验结束，小鼠用co2窒息，然后脱颈椎处死。收集肿瘤、称重、拍照后丢弃。体内实验结束前，已死亡的动物不进行样品收集。
[0130]
统计分析
[0131]
结果将以平均值
±
s.e.m的方式呈现。各组间均值比较将用dunnett’smulti-comparison test进行检验；对于生存期分析，以log-rank(mantel-cox)统计组间差异。如
果p《0.05则认为有统计学显著性差异。
[0132]
实施例6实验结果和分析
[0133]
平均体重、平均体重下降率和动物耐受性
[0134]
anti-pd-1和anti-ctla4单独给药组(g2和g3)，动物没有表现出任何体重下降，耐受良好；80mg/kg xp101无论是单独给药或与anti-pd-1或anti-ctla4联合给药组(g4、g5和g6)，动物都会表现出轻微体重下降(平均体重下降率《5％)，表明动物都能够很好耐受。各组动物体重统计见表3和图1，体重下降率统计见表4和图2。
[0135]
肿瘤体积和相对肿瘤体积
[0136]
分组后每周测量肿瘤体积两次直至实验结束。每只小鼠相对肿瘤体积(rtv)的计算方法是：rtv＝vt/v0，其中vt为每天的测量体积，v0为治疗开始时的体积。
[0137]
与g1对照组相比，g2组动物平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积在day11-18显著下降；g3组动物平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积于day0-18无显著差异，平均相对肿瘤体积于day7显著下降；g4组动物平均肿瘤体积于day11-18显著下降，平均相对肿瘤体积于day7-18显著下降；g5组动物平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积于day4-18显著下降；g6组动物平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积于day7-18显著下降。各组动物肿瘤体积统计见表5和图3，相对肿瘤体积统计见表6和图4。
[0138]
与anti-pd-1单药组(g2)相比，xp101 anti-pd-1组(g5)动物平均相对肿瘤体积于day11-18显著下降(p＝0.032,0.046,0.049；表6)；
[0139]
与xp101单药组(g4)相比，xp101 anti-pd-1组(g5)动物平均相对肿瘤体积于day7-18显著下降(p＝0.014,0.002,0.001,0.001；表6)；
[0140]
与anti-ctla-4(g3)单药组相比，xp101 anti-ctla-4(g6)组动物平均相对肿瘤体积于day11-18显著下降(p＝0.015,0.014,0.007；表6)；
[0141]
与xp101单药组(g4)相比，xp101 anti-ctla-4(g6)组动物平均相对肿瘤体积于day0-18均无显著性差异(p》0.05；表6)。
[0142]
相对肿瘤抑制率(％)
[0143]
相对肿瘤抑制率(tgi,tumor growth inhibitory)：tgi％＝(1-t/c)
×
100％。疗效评价标准：tgi％≥60％为有效，tgi％《40％为无效。
[0144]
day18时，anti-pd-1单药组、xp101单药组、xp101和anti-pd-1联合给药组和xp101和anti-ctla-4联合给药组的tgi均大于60％，证明对肿瘤有显著的抑制作用(表7)。
[0145]
day 18时，xp101 anti-pd-1组(g5)与anti-pd-1单药组(g2)或xp101单药组(g4)相较，相对肿瘤抑制率tgi从65.83％或77.42％提高到99.52％；xp101 anti-ctla-4组(g6)与anti-ctla-4单药组(g3)或xp101单药组(g4)相较，相对肿瘤抑制率tgi从42.70％或77.42％提高到91.32％(表7)。
[0146]
肿瘤完全消退率(cr％，complete regression)
[0147]
直到day 63，各组的肿瘤完全消退率如下表8。其中，xp101联合anti-pd-1组与anti-pd-1单药组相较，cr％从37.5％提高到100％；与xp101单药组相较，cr％从0提高到100％。
[0148]
生存期分析
[0149]
本实验中，单只动物肿瘤体积到达2000mm3作为终点，进行动物生存期统计(结果见图5和表9)。
[0150]
至day 63天时，g1-g6的生存中位数分别为18、52.5、23、25、》56和33.5天，与g1对照组相比，g2-g6组的生存期均显著延长。
[0151]
g5测试药xp101 anti-pd-1联合给药组：在day 63时，与g2 anti-pd-1单药组(3/8只动物存活)相较，所有8只动物全部存活，显著延长动物生存期(p＝0.008)；与g4测试药xp101单药组相比，g5 anti-pd-1与测试药xp101联合给药组的生存期显著延长(p《0.001)；表明联合给药显示出抗肿瘤药效的协同性。
[0152]
g6测试药xp101 anti-pd-l1联合给药组：在day 63时，与g3 anti-ctla-4单药组相比，生存期从23天延长到33.5天，但未显示出统计学差异(p＝0.100)；与g4测试药xp101单药组相比，生存期也有一定延长，并未有显著性(p＝0.095)。
[0153]
re-challenge实验和结果
[0154]
本实验观察到day 56时，g2和g5组分别有4只和8只动物存活，g2组其中3只和g5组所有8只动物处于肿瘤完全消退状态；将这11只动物挑选出来，在每只动物左侧皮下再接种1
×
106a20细胞，接种体积为100μl，同时在5只周龄相近的雌性balb/c小鼠的相同位置接种1
×
106a20细胞，接种体积为100μl，并观测肿瘤生长到day 98结束实验。
[0155]
re-challenge实验结果：5只动物的肿瘤能够正常生长，直到day 84时，5只动物全部因为肿瘤体积到达2000mm3时而安乐死。在此期间g2组3只动物和g5组其中的7只动物都未发现左侧肿瘤有任何生长，而g5组中另一只动物因右侧肿瘤重新生长出来且在day 77时达到2000mm3而安乐死；g2组3只动物和g5组7只动物一只观察到实验终点day 98左右两侧都未有任何肿瘤生长，表明这10只动物因为前期治疗，体内产生了免疫记忆，从而对re-challenge的a20细胞达到完全免疫的效果。肿瘤生长曲线见图5。
[0156]
结论
[0157]
本实验在balb/c小鼠上建立了小鼠b细胞淋巴瘤a20皮下移植瘤模型，vehicle对照组(g1)的肿瘤体积稳定增长，给药开始前d0平均肿瘤体积为69.99
±
1.31mm3。
[0158]
与g1对照组相比，g2组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积在day11-18显著下降；g3组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积于day0-18无显著差异，相对肿瘤体积于day7显著下降；g4组动物肿瘤体积于day11-18显著下降，相对肿瘤体积于day7-18显著下降；g5组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积于day4-18显著下降；g6组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积于day7-18显著下降。
[0159]
与vehicle对照组(g1)相比，g2 vehicle anti-pd-1,10mg/kg,qd*4/wks*3wks biw*6times组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积于day11-18显著下降，day18的tgi为65.83％；
[0160]
g3 vehicle anti-ctla-4,10mg/kg,qd*4/wks*3wks biw*6times组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积在day0-18无显著差异，day18的tgi为42.70％；
[0161]
g4 xp101 pbs 80mg/kg,qd*4/wks*3wks组动物肿瘤体积于day11-21显著下降，相对肿瘤体积在day7-18显著下降，day18的tgi为77.42％；
[0162]
g5 xp101 anti-pd-1 80 10mg/kg,qd*4/wks*3wks biw*6times组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积于day4-18显著下降，day18的tgi为99.52％；与xp101单药组或anti-pd-1单药组相较，平均肿瘤体积都有显著差异；且与anti-pd-1单药组相较，到day63，显著性提供了动物的生存率(p＝0.008)。
[0163]
g6 xp101 anti-ctla-4 80 10mg/kg,qd*4/wks*3wks biw*6times组动物肿瘤体积和相对肿瘤体积在day7-18显著下降，day18的tgi为91.32％；与anti-ctla-4单药组相
较，平均肿瘤体积和动物平均生存期都有显著性差异；但与xp101单药组相较，平均肿瘤体积和动物平均生存期都未有显著性差异(p＝0.095)。
[0164]
后续re-challenge实验表明：对于治疗中肿瘤完全消退的动物，其体内产生了免疫记忆细胞，当遇到相同肿瘤细胞再激发时，能够起到长期保护作用。
[0165]
[0166]
[0167][0168]
表7.相对肿瘤抑制率
[0169][0170]
表8.肿瘤完全消退率cr％
[0171]
g1 vehicle pbs0(0/8)g2 vehicle anti-pd-137.5％(3/8)g3 vehicle anti-ctla-40(0/8)g4 xp101 pbs0(0/8)g5 xp101 anti-pd-1100％(8/8)g6 xp101 anti-ctla-40(0/8)
[0172][0173]
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。