一种固体微生物肥料的制备方法及应用与流程

1.本发明属于微生物肥料领域，具体涉及一种固体微生物肥料的制备方法及其应用。


背景技术：

2.马铃薯（solanum tuberosum l.），又称土豆、洋山芋等，是茄科一年生草本植物，块茎可供食用，营养价值高，含有多种维生素、无机盐和淀粉，含有丰富的膳食纤维，是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、水稻和玉米。原产于南美洲，具有适应性好、增产空间大等特点，我国是世界上马铃薯产量最高的国家，黑龙江是主要的种植区之一。近些年人们对马铃薯的需求量不断提高，为了达到更高的产量，人们往往在种植过程中大量施用化肥。但不合理施肥不仅会导致马铃薯种植成本增加，还会使马铃薯的综合抗性降低，土壤中有害微生物增多，土传病害频繁发生，使马铃薯产量和品质降低。
3.我国是一个人口众多的国家，在满足人们对粮食的需求方面，农业占有重要的地位，但现在农业依赖化肥的情况越来越严重。据统计，我国种植667 m2农作物需要21.9 kg的化肥，是美国的2.6倍，欧洲的2.5倍。化肥的不节制使用已经造成了环境和健康问题，继续使用化学合成品来提高土壤肥力、果实产量，往往会产生意想不到的环境影响。不仅会导致农业生产力下降、土壤流失，还会造成土壤中金属的积累，使环境污染问题越来越严重。在这样的背景下，微生物肥料受到人们的关注，它具有节约资源、安全、生态友好等特点，可以满足当前农业的发展需求。
4.植物根际促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, pgpr）是一类能够促进植物生长、加快植物对营养的吸收、有增产能力的有益菌群。由其制成的微生物肥料能够提高土壤肥力，增加作物产量和品质，是可再生的能源，是化肥的有效替代品。在作物生产中施用微生物肥料，将对农业的可持续发展产生深远影响。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种能够减少化肥施用、且促进马铃薯的生长和品质提高的固体微生物肥料。
6.本发明的另一目的是提供所述固体微生物肥料的制备方法及应用。
7.为了实现本发明目的，本发明的一种促进马铃薯生长的微生物菌肥，由微生物菌剂50重量份和载体100重量份组成。
8.所述菌剂中含有拜氏不动杆菌（acinetobacter beijerinckii）2亿cfu/g，所述载体为生物炭和膨润土经过高温灭菌后1:1混合而成。
9.拜氏不动杆菌（acinetobacter beijerinckii）ljl-12在adf培养基上形成圆形、不透明、灰白色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落；革兰氏染色菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。
10.拜氏不动杆菌（acinetobacter beijerinckii）ljl-12除了具有acc脱氨酶活性，
还能够合成吲哚乙酸、嗜铁素、溶解无机磷。
11.所述载体无毒，且能够促进微生物的生长。
12.所述生物炭为黑色颗粒状，具有质量轻、透气性好、保肥性好、吸附性强等优点，含有植物所需的磷、钾、镁等元素。
13.所述膨润土为乳白色粉末，具有吸水膨胀、分散、悬浮、离子交换和吸附等性质。
14.本发明还提供所述微生物肥的制备方法，包括如下步骤：（1）微生物菌剂的制备将上述拜氏不动杆菌ljl-12划线至lb固体培养基中，培养温度28℃，培养时间为12~16h。挑取单菌落接种于lb液体培养基中，制备菌悬液；将菌悬液以1%的体积比接入发酵培养基中，初始ph为7，培养温度为28℃，转速为180 rpm，振荡培养12~24 h，所得到的培养液即为所述微生物菌剂。
15.（2）载体的制备将上述载体经灭菌锅高压灭菌1-2 h后，在超净工作台中分装成100 g小袋(生物炭:膨润土=1:1)。
16.（3）固体微生物肥料的制备接种50 ml上述微生物菌剂，充分混匀后，倒入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎若干小孔，同样操作再套一自封袋，一切操作均在无菌条件下进行。为了保证固体菌肥的有效菌活性，保证马铃薯植株正常的生长发育，在菌肥中添加2~3 ml马铃薯所需微量元素溶液。将做好的菌肥置于28℃~30℃下培养7~10 d，之后常温保存，待用。
17.所述微量元素包含铁、锰、锌、铜、硼、钼元素。
18.所述微量元素溶液具体为硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、钼酸钠的混合液。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：1.拜氏不动杆菌ljl-12在土壤中有较好的适应性。
20.2.生物炭作为肥料的载体，提供了接种物进入土壤后生存率的可能性，释放微生物所需的营养，起到保水、保肥的作用。膨润土作为肥料的载体，不仅可以改善肥料的物理性状，而且可以减少肥料在土壤中养分的损失，控制肥料中养分的释放，提高肥料的利用率。二者混合后作为固体微生物肥料的载体，可为pgpr提供营养，提高肥料利用率，间接促进作物生长发育。
21.3.本发明的固体菌肥施入土壤后，起到疏松土壤、避免土壤板结的作用，有利于微生物呼吸，使菌群保持活性。与液体菌肥相比，促生菌群数量稳定，植物利用pgpr效率高，起到缓释的效果。
22.本发明固体微生物肥料中，微生物菌剂可以合成iaa、嗜铁素，溶解难溶无机磷，经大田实地验证，该固体微生物肥料配方合理，功效稳定，能有效促进植物吸收营养物质，促进植物生长，改善作物品质，增加产量。
23.保藏说明本发明对上述菌种进行了下述保藏：保藏时间：2012年6月26日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；
拜氏不动杆菌（acinetobacter beijerinckii）ljl-12保藏号为cgmcc no. 6291。
附图说明
24.图1为不同载体吸水率；图2为不同载体ph；图3为供试载体对接种菌株的毒性测试；图4为不同处理对马铃薯维生素c含量影响；图5为不同处理对马铃薯还原糖含量影响；图6为不同处理对马铃薯淀粉含量影响。
具体实施方式
25.下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
26.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。
27.一、微生物菌剂的制备将拜氏不动杆菌（acinetobacter beijerinckii）ljl-12划线至lb培养基中，培养温度28℃，培养时间为12~16h。
28.挑取单菌落接种于lb液体培养基中，于全温培养摇床28℃，180 r/min条件下培养12~24 h。等菌株充分生长后，用紫外分光光度计测菌株悬浮液od值，调至od
600
=0.5，即为菌株菌悬液。
29.将菌悬液以1%的体积比接入发酵培养基，初始ph为7，培养温度为28℃，转速为180 rpm，振荡培养12~24 h，所得到的培养液即为所述微生物菌剂。
30.二、载体性质的测定1、载体吸水率的测定将生物炭和膨润土121℃灭菌2 h（重复间歇灭菌，每次1 h），自然晾干备用。在无菌条件下，将无菌水与载体充分混匀，每次加入无菌水的量按照一定梯度逐渐增加，使载体材料保持湿润、疏松、不结块。以100 g（保持湿润疏松状态）载体所含的无菌水量为载体吸水率。重复3次，取平均值。
31.取灭菌烘干后的载体进行测定，实验结果如图1。结果表明，生物炭的平均吸水率为75.02%，膨润土的平均吸水率为41.45%，复合载体的平均吸水率为70.19%，符合载体要求。
32.2、载体ph的测定随机称取样品8 g，将样品置于干净烧杯内，按1:2加入去离子水，浸泡振荡均匀，测定样品悬浮液ph边测边搅拌，待仪器稳定后读数记录。重复3次，取平均值。
33.由图2可知，生物炭的平均ph为6.86，膨润土的平均ph为9.44，复合载体的平均ph为7.56。其中，复合载体的ph环境更适宜菌株ljl-12的生长。
34.3、载体毒性的测定
称取不同载体及其组合风干样20 g于盛有200 ml蒸馏水的500 ml的锥形瓶中，150 r/min，30℃震荡后，用0.2 μm的细胞过滤膜过滤后得到无菌滤液，待用。将0.1 ml混合功能菌液接种到盛有6 ml滤液的试管中，于28℃、150 r/min震荡6 d，通过稀释梯度法测定有效菌的数量，通过与原始接种菌落数进行比较，判断载体是否对微生物的生长有影响。
35.如图3，培养6天的菌株ljl-12，其有效活菌数较初始接种有所提高，说明供试载体无毒，而且载体可为微生物提供营养成分，保持微生物活性。
36.三、固体微生物肥料的制作综合载体吸水率、ph、毒性检测的实验结果，选择复合载体作为固体微生物肥料的载体。将复合载体（生物炭: 膨润土=1:1）灭菌1～2 h后分装成100 g小袋，接种50 ml上述微生物菌剂，充分混匀后，倒入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎若干小孔，扎孔后的自封袋再外套一自封袋，并在外层自封袋的四周扎几个小孔，一切操作均在无菌条件下进行。为了保证固体菌肥的有效菌活性，保证马铃薯植株正常的生长发育，在菌肥中添加2~3 ml马铃薯所需微量元素溶液（zn、cu、mn、fe等）。将做好的菌肥置于28℃~30℃下培养7~10 d，之后常温保存，待用。
37.四、微生物肥料质量检测1、液体微生物肥料质量检测参照微生物肥料国家标准ny227-94。取液体微生物肥料10~20 ml（精确到0.01 ml），加入带有玻璃珠的90~180 ml的无菌水中，静置20 min后在摇床中200 r/min充分振荡30 min，即成母液的菌悬液。用无菌枪头吸取5 ml菌悬液加入45 ml无菌水中，混合成1:10的菌悬液，按梯度稀释法分别得到10-2
、10-3
、10-4
、10-5
等浓度。分别吸取不同浓度的菌悬液0.1 ml，均匀涂布在lb培养基上。每个稀释度重复三次，同时用无菌水做对照处理，培养2～5 d，菌落计数。
38.对储存于4℃冰箱中的液体微生物肥料进行有效活菌数检测。经15 d，30 d，45 d，60 d，75 d，90 d，120 d，150 d，180 d，210 d各检查一次。
39.2、固体复合微生物肥料质量检测取固体微生物肥料10~20 g（精确到0.01 g），以下同液体微生物肥料质量检测方法。对储存于室温下的液体微生物肥料进行有效活菌数检测。经15 d，30 d，45 d，60 d，75 d，90 d，120 d，150 d，180 d，210 d各检查一次。微生物肥料质量检测的结果如表1，在第150 d时，液体微生物肥料出现絮状沉淀，伴有臭味。建议该液体复合微生物肥料生产后，最好在4个月内使用。固体微生物肥料从90 d开始有效活菌数呈现下降趋势，到第210 d时，菌肥已被污染。建议固体微生物肥料最好在6个月内使用。
40.从结果来看，固体菌肥与液体菌肥相比，保存时间更长，肥效更持久。分析原因可能是，复合载体为不动杆菌ljl-12提供了一种适宜的生存环境，生物炭提供了接种物进入土壤后生存率的可能性，释放微生物所需的营养，起到保水、保肥的作用。膨润土可以减少肥料在土壤中养分的损失，控制肥料中养分的释放，提高肥料的利用率。二者混合后作为固体微生物肥料的载体，可为不动杆菌ljl-12提供营养，更有利于其繁殖生长。
41.表1 微生物肥料ljl-12的质量检查结果
注：“ ”表示污染，
“‑”
表示无污染。
42.五、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯生长的影响本试验于黑龙江省哈尔滨市利民开发区哈尔滨师范大学农园进行，每处理重复3次，试验区组内完全随机排列。小区每垄4 m长，垄宽为70 cm，1 m挖3穴，种植马铃薯，四周设有保护行。
43.施用液体微生物肥料时要均匀施用到小区各处，为保持菌体在土壤中的活性，在马铃薯各个生育期阶段进行灌根处理，每小区施肥量为2.5 l（微生物菌剂:蒸馏水=1:50），对照组采用等量蒸馏水处理。固体微生物肥料在种植前浅施于土壤表层，入土深度5~8 cm为好。整个试验期内不再施除草剂、化肥等其他化学合成物质。
44.设5种处理，分别为：ck为空白对照，t1为ljl-12液体菌肥 85%化肥，t2为全肥，t3为ljl-12固体菌肥 85%化肥，t4为固体载体。
45.在收获期对小区中的马铃薯进行随机抽取，对其生物量进行测定，结果见表2。与未接菌的对照（ck）相比，各菌肥均显著提高了马铃薯促生指标（p 《 0.05）。
46.与ck相比，t1、t2、t3、t4处理的马铃薯株高分别增加了17.32%、10.75%、23.14%、-7.12%；茎粗分别增加了4.33%、-0.52%、5.36%、-12.98%；分蘖数分别增加了33.33%、8.33%、41.67%、-8.33%；叶绿素含量分别增加了10.77%、6.93%、12.48%、-3.23%；产量分别增加了19.63%、41.36%、27.23%、-3.14%。
47.t3处理与ck相比，株高、茎粗、分蘖数、产量差异显著（p 《 0.05）。除块茎产量外，t3（固体微生物肥料）较t2（全肥）相比，各促生指标均有所提高。其中，固体微生物肥料的促生效果优于液体微生物肥料。
48.表2 不同处理对马铃薯生长的影响
处理组株高（cm）茎粗（cm）分蘖数（个）叶绿素含量产量（kg）ck53.94
±
1.82c1.16
±
0.18a2.40
±
0.55c42.16
±
1.67bc0.76
±
0.07ct163.28
±
2.30a1.21
±
0.07a3.20
±
0.45ab46.70
±
2.38a0.91
±
0.04bt259.74
±
3.15b1.15
±
0.10a2.60
±
0.55bc45.08
±
3.94ab1.08
±
0.04a
t366.42
±
3.52a1.22
±
0.06a3.40
±
0.55a47.42
±
2.00a0.97
±
0.10bt450.10
±
0.95d1.01
±
0.04b2.20
±
0.45c40.80
±
2.31c0.74
±
0.06c
注：ck: 空白对照; t1: ljl-12液体菌肥 85%化肥; t2: 全肥; t3: ljl-12固体菌肥 85%化肥; t4: 固体载体。同列标以不同小写字母的数值在0.05水平显著差异。
49.六、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯品质的影响1、对马铃薯维生素c含量的影响采用紫外分光光度法，每处理重复3次。分别称取10 g待测样品于榨汁机中，各加入1% hcl 10 ml，匀浆，转移到50 ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀并移至离心管中8000 r/min，离心10 min，上清液即为样品待测提取液。
50.酸处理：取1 ml样品待测提取液，放入盛有2 ml 10% hcl的50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以蒸馏水为空白，测od
243.4
吸光值；碱处理：取1 ml样品待测提取液、10 ml蒸馏水和4 ml 1 mol/l naoh溶液放入50 ml容量瓶中，摇匀，静置20 min后加入4 ml 10% hcl，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白，测od
243.4
吸光值。样品提取液的吸光值为酸处理和碱处理吸光值之差。代入标曲中，即可求出维生素c浓度。计算公式如下：其中，c——依据标准曲线方程计算得到的维生素c浓度，μg/ml；v
总
——测吸光度时吸取样品溶液的体积，ml；v
待测总
——吸取样品定容总体积，ml；v1——待测样品总体积，ml；w
总
——样品质量，g；100为100 g样品。
51.结果如图4所示，除t4处理外，其余处理均能提高马铃薯的维生素c含量，但差异不显著（p 《 0.05）。t1、t2、t3处理较ck分别增加15.94%、22.91%、21.91%，t4处理增加-4.98%，排除了固体载体对实验结果的影响。其中，固体菌肥处理的维生素c含量与全肥相比，相差不大。
52.2、对马铃薯还原糖含量的影响采用3,5
ꢀ‑
二硝基水杨酸比色法
66.，每处理重复3次。
53.称取样品100 g，加85%乙醇100 ml，在榨汁机中捣碎，置烧杯中，80℃水浴中提取20 min，期间摇动数次。以12000 r/min 离心10 min，上清液备用。将待测液稀释至测定范围内（0-1 mg/ml），取待测液1 ml，加3,5-二硝基水杨酸溶液1 ml，摇匀，置沸水中煮5 min，取出后迅速冷却，加蒸馏水至10 ml，用未加葡萄糖标准溶液的试管作为空白调零，用分光光度计在530 nm波长处测定吸光值。还原糖含量的计算公式（2-2）如下：其中，c——还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；v——还原糖或总糖提取液的总体积，ml；100为样品重量，g；1000为mg换算成g的系数。结果如图5，各处理均能降低马铃薯的还原糖含量，与ck相比，t1、t2、t3、t4处理的还原糖含量分别降低了12.98%、3.87%、12.19%、7.42%。t1和t3两微生物肥料处理与t2（全
肥）处理相比，差异显著（p《0.05），可有效地降低马铃薯的还原糖含量，有利于马铃薯商业属性的开发。3、对马铃薯淀粉含量的影响采用碘比色法，每处理重复3次。称粉细的马铃薯块茎干样0.1g，放入50ml烧杯中，向烧杯中加入2ml蒸馏水调成糊状，然后边搅拌边加入3.2ml浓度为60%的高氯酸，继续搅拌10min至马铃薯粉样全部溶解，在100ml容量瓶中定容。静置10min，取上清液0.5ml放入带刻度的10ml的离心管中，再依次加入3ml蒸馏水、2ml碘试剂，静置5min后再定容至10ml，用蒸馏水作对照，测od
660
吸光值。计算公式如下：淀粉含量（%）=r/[(0.1
×
0.01
×
0.05
×
106)
×
100]其中，r——标准曲线上求出的浓度。
[0054]
如图6所示，除t4处理外，其余处理均能提高马铃薯的淀粉含量含量。t1、t2、t3处理较ck相比分别增加24.74%、15%、27.65%。其中，固体微生物肥料t3处理较ck相比，差异显著（p《0.05），可有效提高马铃薯的淀粉含量。
[0055]
七、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯经济效益的影响通过把小区产量折算成公顷产量，来计算马铃薯的块茎产值，即马铃薯经济效益。经济效益=块茎产值-总投入，总投入包括化肥、种子、培养基原料、载体等费用。
[0056]
每公顷马铃薯产量(kg)=马铃薯平均单株结薯重
×
株数/处理种植面积
×
10000块茎产值(元hm-2
)=块茎单价
×
块茎产量其中，马铃薯单价按市售1元/kg，化肥单价：尿素2.2元/kg、磷酸二铵2.9元/kg、硫酸钾3.2元/kg计算。其他费用：酵母粉300元/kg，蛋白胨140元/kg，氯化钠16元/kg，膨润土4元/kg，稻壳炭1.2元/kg计算。
[0057]
结果如表3所示，除t4外，各处理的块茎产值均高于对照。t3与t2（全肥）相比，虽没有带来更高的经济效益，但从生态方面考虑，固体微生物肥料配施化肥能有效替代15%的化肥，减少化学制品对环境的污染。且较空白对照相比，仍有7200元的增产效益，可作为生物菌肥运用到马铃薯的生产中。
[0058]
表3马铃薯经济效益新增经济效益为处理组经济效益-对照组经济效益。缩写同表1。
[0059]
综上所述，固体微生物肥料能较有效地促进马铃薯生长，提高块茎产量，改善马铃薯的营养品质。与全化肥相比，有利于农业的可持续发展，为定向利用生物肥料资源提供理论基础，推进马铃薯产业发展。