百里醌作为冠状病毒广谱抑制剂的新用途的制作方法

1.本发明属于医药领域，涉及百里醌的新用途，具体涉及百里醌在治疗冠状病毒感染的用途。


背景技术：

2.高致病性冠状病毒感染成了这十年来广受关注公共卫生问题。严重急性呼吸综合征(sars，2002-2004)，中东呼吸综合征(mers，2012-至今)，2019-ncov(covid-19)，每一个对人类健康，经济发展都带了巨大的冲击。
3.由于没有针对性的有效药物和疫苗，新型冠状病毒的新药研发意义重大，在这场没有硝烟的战争中，全球多家科研机构和制药公司致力于研发新型冠状病毒疫苗和治疗药物，因此发明具有重大的社会学和经济学意义。
4.百里醌，thymoquinone，为天然产物提取物，用于上呼吸道感染的辅助治疗。
5.百里醌是从nigella.sativa黑种草中分离得到的天然产物。thymoquinone具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗肿瘤活性和保肝作用。黑种草(nigella sativa linn.),英文名black cummin,属毛茛科黑种草属植物，主要分布于地中海地区，在沙特阿拉伯、北非和亚洲的部分地区也有生长，中国云南、新疆等地有分布。黑种草作为一种民间的药食两用植物，已有2000多年历史。其干燥种子可作为辅料用于面包和烘焙食品中，也可用于酱料中增加风味。作为药用，常用于上呼吸道感染的辅助治疗。现代研究表明，黑种草种子具有扩张支气管的作用，并有一定的抗菌、稳定血压和调节胆汁的功能。《中华草本》记录，黑种草功能主治：益气养心；祛风止咳。主心悸；失眠；体虚；风寒感冒；咳嗽。
6.伊本西那(980-1037)在其医学著作《医典》(the canon of medicine)中提及，黑种草籽能够刺激身体的能量，帮助人们从疲劳和精神不振中恢复过来，这种能量的提高包括身体和心理在内的整体健康。黑种草籽油中所含的百里醌对抑郁行为有预防作用，黑种草籽油还可以通过提高大脑中血清素(一种神经递质，是一种天然的情绪稳定剂)水平来降低焦虑，从而提高精神能量水平和情绪水平。在缓解睡眠方面，黑种草籽也很有应用潜力。长期的研究发现，经常摄入黑种草籽油可以帮助消除睡眠障碍，提供更好的睡眠和完整的睡眠周期。关于黑种草籽油在睡眠方面发挥效果的潜在机制，可能是由于其在睡眠周期内能增强脑内乙酰胆碱的能力，因为研究结果表明，在睡眠期间乙酰胆碱水平会升高。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供包括2019新型冠状病毒(covid-19)在内的冠状病毒的有效抑制剂，可以预防及治疗包括2019新型冠状病毒在内的冠状病毒感染。本发明提供了一种百里醌的新用途，作为包括2019新型冠状病毒在内的冠状病毒感染的有效抑制剂，在制备预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。
8.所述的应用，其中冠状病毒包括2019新型冠状病毒(covid-19)、严重急性呼吸综合症(sars)病毒以及普通感冒人冠状病毒nl63(hcov-nl63)。
9.所述的应用，其中冠状病毒为2019新型冠状病毒(covid-19)。
10.所述的应用，其中冠状病毒感染为冠状病毒肺炎或者普通感冒。
11.所述的应用，其中冠状病毒感染包括2019新型冠状病毒covid-19肺炎、严重急性呼吸综合症sars、人冠状病毒nl63肺炎、普通感冒。
12.所述的应用，其中冠状病毒感染为2019新型冠状病毒肺炎。
13.本发明人经过大量研究发现百里醌的新用途，百里醌可以结合冠状病毒受体ace2，从而阻断病毒进入细胞，百里醌在细胞水平ec
50
＝4.999um,cc
50
＝35.10um。
14.本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
15.与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
16.百里醌在细胞水平能够结合冠状病毒受体ace2，阻止病毒进入细胞，从而达到治疗冠状病毒肺炎感染以及普通感冒,抑制sars-cov-2假病毒的ec50＝4.999um。
附图说明
17.图1.ace2&百里醌结合位点
18.图1显示ai对接结果：百里醌和ace2的结合位点
19.百里醌结合ace2(pdb:6vw1)
20.百里醌对接在ace2蛋白上，虚线表示氢键
21.图2.ace2&百里醌spr传感图
22.图2显示百里醌和2019新型冠状病毒受体ace2的亲和力
23.图3.百里醌抑制sars-cov-2假病毒的ec
50
和cc
50
24.图3显示新型冠状病毒(sars-cov-2)外膜的vsv-dg-fluc的复制缺陷型假病毒百里醌ec50的测定。
具体实施例
25.下面结合具体实验操作及数据，进一步说明本方面的技术方案。
26.以下通过试验说明百里醌对各个亚型冠状病毒的抑制作用。百里醌来源：百里醌粉末购买于阿拉丁公司，货号(t115128)。
27.实施例1ai预测结合位点
28.从pdb(http://www.rcsb.org/)下载了ace2蛋白(pdb：6vw1)。除去所有异质原子和ace2配体。mpro对接网格最大化用于百里醌对接。在虚拟筛选之前，将pdb文件转换为pdbqt格式的大分子。网格(配体对接搜索空间)的位置如上所述。然后，用autodock vina 1.1.2用于后续的分子对接。使用1.7.4.5版的pymol可以观察到蛋白质与配体的相互作用。ace2蛋白质接近命中配体的氨基酸残基被突出显示为参与蛋白质-配体相互作用的潜在相互作用残基。结果见图1-3。
29.实验结果：
30.1.百里醌与ace2蛋白的结合位点是ile291和phe438。
31.结果见图1
32.实施例2:冠状病毒受体ace2蛋白spr实验
33.实验材料与仪器
34.biacore t200(ge healthcare,uppsala,sweden),cm5芯片(ge healthcare,uppsala,sweden)，百里醌(阿拉丁)，ace2 his标签蛋白(novoprotein)。
35.机型为ge公司的biacore t200,将ace2蛋白(novoprotein)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量分别为15861.6ru,测量百里醌和ace2蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um,50um,25um,12.5um,6.25um,3.125um，1.5625um,0um的浓度注入百里醌,进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。结果见图2。spr结果总结在如下表1中。
36.表1在25℃下百里醌结合冠状病毒受体ace2蛋白的亲和力
37.蛋白kd(m)rmax(ru)chi2(ru2)chiace23.214*10-5
11.580.3280.573
38.实施例3
39.新型冠状病毒(sars-cov-2)外膜的vsv-dg-fluc的复制缺陷型假病毒感染实验——检测百里醌抑制冠状病毒进入细胞的效果
40.实验材料
41.vsv-dg-gfp中vsv的糖蛋白(g)被gfp荧光蛋白所替代。vsv-dg-fluc(firefly luciferase)水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)的假病毒包装系统由反向遗传学质粒拯救(rescue)获得，相关质粒均从karafast购得。其中pvsv-δg-luciferase用于转录复制缺陷型的重组vsv基因组，其中vsv的糖蛋白(g)被荧火虫荧光素酶(firefly luciferase，fluc)所替代，而pbs-n,pbs-p,pbs-l,pbs-g作为辅助载体用于帮助第一轮的病毒拯救。
42.拯救与扩增含vsvg外膜的vsv-dg-fluc复制缺陷型病毒
43.将bhk21细胞贴壁于3.5cm dish,第二天待细胞达到90％密度时，并用重组表达t7 rna聚合酶的痘病毒(vaccinia virus-t7,vv-t7)以moi＝5的滴度(dmem，无血清)在37℃感染45分钟。用pbs漂洗细胞一遍后，用lipo3000转染已混合好的反向遗传学质粒(pvsv-δg-luciferase：pbs-n:pbs-p:pbs-g:pbs-l＝5:3:5:8:1)转染已被vv-t7感染过的细胞，12小时后换液，48小时后收取含有初代vsv-dg-fluc病毒的上清,用0.22μm滤膜过滤上清除去残留的vv-t7。为进一步扩增病毒，用过表达vsv g蛋白的pmd2.g(atcc：plasmid#12259)转染hek293t细胞，24小时后，初代上清与dmem 10％血清1：1混合用于感染，24-48小时后收取上清，12000转离心2分钟后保留上清并分装，用噬斑法测定病毒滴度，并保存于-80℃。
44.包装含新型冠状病毒(sars-cov-2)外膜的vsv-dg-fluc的复制缺陷型假病毒
45.用过表达sars-cov-2的s外膜蛋白(c端截短18个氨基酸，提高包装效率)的质粒(pcaggs-sars2-s-dc)转染hek293t细胞或vero-e6细胞。24小时后，用moi＝10的含vsvg外膜的vsv-dg-fluc病毒(1:30稀释)在37℃感染转染后的细胞1小时，然后加入含1：300稀释的大鼠抗vsvg抗血清(夏宁邵实验室)的dmem 10％fbs的培养基，用于完全中和残留的含vsvg外膜的vsv-dg-fluc假病毒。24-48小时后收取含有病毒的上清，12000转离心2分钟后保留上清并分装，用有限稀释法通过cpe测定病毒滴度(infectious unit)，并保存于-80℃。
46.用基于vsv的sars-cov-2假病毒感染确定药物半数有效浓度(ec50)
47.将同时过表达ace2-3xflag与gaussia luciferase(gluc)的bhk21-ace2-gluc(bag)细胞与不同浓度的药物分别与不同的假病毒(moi＝0.1)混合，在dmem 10％fbs的培养基中贴壁于96孔板。感染24小时后，通过荧光显微镜拍摄感染后表达gfp的细胞；或要测定细胞内的荧火虫荧光素酶强度，则除去培养上清，加入20μl 1x passive lysis缓冲液(promega)，室温放置10分钟后通过one-glo luciferase kit(promega)和20/20生物发光测定仪(promega)进行测定。细胞毒性(cc50)或通过上清中gaussia luciferase的活性进行评价，检测方法按照invovogen公司的quanti-luc
tm
试剂说明书进行。实验结果见图3。百里醌抑制sars-cov-2假病毒的ec50＝4.999um。